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    血管緊張素Ⅱ誘導高血壓大鼠腸系膜動脈PP2A激活的機制研究*

    2019-10-24 08:26:08姜君財駱妍蓓陸德琴
    中國病理生理雜志 2019年10期
    關鍵詞:腸系膜磷酸化收縮壓

    于 敏, 姜君財, 駱妍蓓, 張 倩, 丁 菁, 陸德琴

    (貴州醫(yī)科大學病理生理學教研室, 貴州省常見慢性疾病發(fā)病機制及藥物研究重點實驗室, 貴州 貴陽 550025)

    高血壓是一種以體循環(huán)動脈血壓升高為主要特點的臨床綜合征,可導致腦卒中、腎衰竭及心力衰竭等嚴重并發(fā)癥。高血壓的發(fā)病機制復雜,其中腎素-血管緊張素系統(tǒng) (rennin-angiotensin system, RAS) 的異常激活被認為是其重要的發(fā)病機制之一[1]。血管緊張素Ⅱ (angiotensinⅡ, AngⅡ) 是RAS的主要組成部分,可通過與其1型受體 (AngⅡ type 1 receptor,AT1R) 結合參與多種心血管疾病的發(fā)生[2-3]。有研究報道, AngⅡ的慢性升高可導致內皮型一氧化氮合酶 (endothelial nitric oxide synthase, eNOS) 活性降低以及一氧化氮 (nitric oxide, NO) 生成減少,進而引起血管內皮功能障礙 (vascular endothelial dysfunction, VED) 和高血壓的發(fā)生[2,4]。生理條件下,血管壁的NO主要由內皮細胞的eNOS催化生成[5-6],eNOS/NO功能障礙是心血管疾病發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)。eNOS的活性調節(jié)復雜,蛋白質翻譯后磷酸化調控是其活性調節(jié)的重要機制之一,eNOS Ser1177是其中一個重要的磷酸化位點,該位點磷酸化水平上調可增強eNOS活性[7]。

    蛋白磷酸酶2A (protein phosphatase 2A,PP2A) 是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶,其通過使蛋白質發(fā)生可逆性去磷酸化,在細胞信號轉導、細胞分化和DNA復制等多種生物學事件中發(fā)揮調控作用[8]。文獻報道,PP2A可使eNOS Ser1177去磷酸化而下調eNOS活性[9-10]。AngⅡ是激活PP2A的多種因素之一。研究表明,AngⅡ與心肌細胞膜上AT1R結合后可介導PP2A激活,進而使心肌細胞翻譯延長因子2去磷酸化,調控細胞內蛋白質的合成和心肌肥大[11]。本課題組前期研究[12-13]也觀察到雙腎單夾 (two-kidney one-clip, 2K1C) 腎血管性高血壓大鼠血清AngⅡ含量升高,腸系膜動脈PP2A活性增加、eNOS Ser1177磷酸化水平下調、eNOS活性降低及NO生成減少,并且利用PP1/PP2A抑制劑岡田酸 (okadaic acid,OA) 以及AT1R阻滯劑坎地沙坦 (candesartan,CAN) 均可逆轉上述現(xiàn)象,表明AngⅡ/AT1R通路可激活PP2A,降低eNOS活性。但是,AngⅡ激活血管內皮細胞PP2A,進而導致內皮功能障礙的分子機制目前仍不清楚。因此,本研究利用微量滲透泵持續(xù)灌注AngⅡ的方法構建高血壓大鼠模型,從動物整體水平探討AngⅡ/AT1R通路激活腸系膜動脈PP2A的分子機制,以期為臨床防治與AngⅡ密切相關的心血管疾病提供實驗依據(jù)。

    材 料 和 方 法

    1 實驗動物

    清潔級雄性6周齡Sprague-Dawley (SD)大鼠40只,體重160~200 g,由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供,許可證號為SCXK (黔) 2012-0001。本研究的動物實驗方案經(jīng)貴州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準。

    2 實驗試劑與儀器

    3 方法

    3.1高血壓大鼠模型復制方法及實驗分組 大鼠常規(guī)適應性喂養(yǎng)1周后,隨機分為對照(control)組 (n=10)、AngⅡ組 (n=10)、CAN+AngⅡ組 (n=10)和CAN組 (n=10)。高血壓大鼠模型復制方法簡單描述如下:腹腔注射3%戊巴比妥鈉 (1 mL·kg-1)麻醉后,行頸背部皮膚橫切口,在皮下埋置預先嚴格按照產(chǎn)品說明書充填AngⅡ或生理鹽水的微量滲透泵,然后用手術絲線縫合切口,所有操作均按照外科無菌術原則。AngⅡ組及CAN+AngⅡ組埋置AngⅡ微量滲透泵 (500 ng·kg-1·min-1),control組及CAN組埋置生理鹽水微量滲透泵 (500 ng·kg-1·min-1)。CAN+AngⅡ組與CAN組于皮下埋泵術后第1天給予坎地沙坦酯 (10 mg·kg-1·d-1) 灌胃,control組和AngⅡ組給予等量生理鹽水灌胃。各組大鼠均以普通飼料、自由飲水喂養(yǎng)14 d。

    3.2血壓測量及高血壓判定 采用BP-300A大鼠無創(chuàng)血壓測量儀測定大鼠清醒狀態(tài)下尾動脈收縮壓,測量時間為埋置微量滲透泵前及埋置后3 d、7 d和14 d。每次測量均連續(xù)測6次,去掉最高值及最低值,取其余數(shù)值的平均值為當天收縮壓值。血壓在85~120 mmHg范圍為正常血壓大鼠,凡術后血壓比自身術前血壓升高≥30 mmHg者判定為高血壓。

    3.3標本收集

    3.3.1分離血清 SD大鼠取材前禁食10 h,用3%戊巴比妥鈉 (1 mL·kg-1) 腹腔麻醉后股動脈放血,留取血液至15 mL離心管中,于4℃靜置30 min后,4 ℃、3 000×g離心15 min,取上清,置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    3.3.2分離腸系膜動脈 取血后迅速剪開大鼠腹腔,于心臟未停止搏動前沿腸管壁剪取腸系膜組織,置于預冷的無菌PBS中,輕柔地將血管外脂肪、結締組織剝離后留取腸系膜動脈血管,迅速放入液氮中冷凍,用錫箔紙包裝冷凍后的動脈,置-80 ℃保存待用。

    3.4血清AngⅡ含量測定 取-80 ℃保存的各組大鼠血清,置常溫下解凍后混勻備用。嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作,用酶標儀在 450 nm 波長下讀取吸光度 (A) 值,并根據(jù)標準曲線計算各樣本AngⅡ含量。

    3.5Western blot檢測蛋白水平 取-80 ℃保存的腸系膜動脈組織,稱重后加液氮研磨至細粉末狀,加入蛋白裂解液 (1 mL/g) 混勻后于冰上裂解45 min,超聲波破碎3次后,4 ℃、 12 000×g離心15 min,取上清液,BCA法測定樣品總蛋白濃度后,加入3×上樣緩沖液煮沸變性。經(jīng)10% SDS-PAGE分離,蛋白質轉移至PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,TBST洗膜后分別加入相應I抗,4℃孵育過夜。次日,洗膜后加入Ⅱ抗室溫孵育1 h,ECL顯影,于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)曝光。曝光后的條帶用Image Lab圖像分析軟件進行分析,以β-tubulin為內參照。

    3.6PP2A酶活性檢測 取-80 ℃保存的腸系膜動脈組織,稱重后加液氮研磨至細粉末狀,加入預冷的磷酸酶貯存緩沖液后冰上裂解45 min,4℃、 12 000×g離心45 min,取250 μL上清液,將上清液過柱后收集濾出液, 嚴格按照PP2A檢測試劑盒說明書操作進行檢測。用酶標儀在600 nm波長處測定吸光度 (A) 值,根據(jù)標準曲線計算樣品PP2A的酶活性。

    4 統(tǒng)計學處理

    采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差 (mean±SD) 表示,組間比較采用單因素方差分析 (one-way ANOVA)。相關性分析采用Pearson相關分析法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    結 果

    1 各組收縮壓變化

    與control組及自身術前相比,AngⅡ組大鼠術后第3天收縮壓顯著升高 (P<0.05),第7天收縮壓進一步升高 (P<0.05),第14天在高水平持續(xù)(P<0.05);與AngⅡ組比較,CAN+AngII組大鼠收縮壓顯著降低 (P<0.05);control組、CAN組及CAN+AngⅡ組大鼠手術前后收縮壓以及各組間收縮壓差異均無統(tǒng)計學意義,見表1。

    表1 各組收縮壓的變化

    *P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsbefore minipump implantation;△P<0.05vs3 d after minipump implantation;▲P<0.05vsAngⅡ group.

    2 血清AngⅡ含量

    與control組相比,AngⅡ組和CAN+AngⅡ組血清中AngⅡ含量均顯著升高 (P<0.05),CAN組血清中AngⅡ含量差異無統(tǒng)計學意義,見表2。

    表2 各組血清AngⅡ含量變化

    Table 2. The changes of serum AngⅡ in each group (ng/L. Mean±SD.n=6)

    GroupAng ⅡControl15.02±3.07AngⅡ18.42±2.07?CAN+AngⅡ17.70±3.99?CAN14.07±2.72

    *P<0.05vscontrol group.

    3 腸系膜動脈eNOS蛋白表達及eNOS Ser1177磷酸化水平

    與control組相比,AngⅡ組腸系膜動脈eNOS Ser1177磷酸化水平顯著降低 (P<0.05),其余兩組差異無統(tǒng)計學意義;與AngⅡ組相比,CAN+AngⅡ組eNOS Ser1177磷酸化水平顯著上調 (P<0.05);各組間eNOS蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義,見圖1。

    4 腸系膜動脈PP2A活性

    與control組相比,AngⅡ組腸系膜動脈PP2A活性顯著增高 (P<0.05),其余兩組差異無統(tǒng)計學意義;與AngⅡ組相比,CAN+AngⅡ組PP2A活性顯著降低 (P<0.05),見圖2。

    5 PP2A活性與eNOS Ser1177磷酸化水平相關性分析

    Pearson相關性分析顯示,PP2A活性變化與eNOS Ser1177磷酸化水平改變呈負相關,相關系數(shù)為r=-0.842 (P<0.05)。

    6 腸系膜動脈PP2Ac Tyr307磷酸化水平和蛋白表達

    Figure 1. The protein levels of eNOS and p-eNOS (Ser1177) in the mesenteric arteries of AngⅡ-induced hypertensive rats and the blocking effect of CAN. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAngⅡgroup.

    圖1 各組大鼠腸系膜動脈eNOS蛋白表達及eNOS Ser1177磷酸化水平的變化

    Figure 2. PP2A activity in the mesenteric arteries of AngⅡ-induced hypertensive rats and the blocking effect of CAN. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAngⅡgroup.

    圖2 各組大鼠腸系膜動脈PP2A活性變化

    Figure 3. The protein levels of PP2Ac and p-PP2Ac (Tyr307) in the mesenteric arteries of AngⅡ-induced hypertensive rats and the blocking effect of CAN. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAngⅡgroup.

    圖3 各組大鼠腸系膜動脈PP2Ac表達和PP2Ac Tyr307磷酸化水平

    討 論

    腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活是導致高血壓的主要機制之一[14],AngⅡ作為該系統(tǒng)中最為關鍵的血管活性物質,參與血流動力學和機體水鈉平衡調節(jié)[2-3]。RAS長期激活,尤其是AngⅡ濃度增加可導致原發(fā)性高血壓的發(fā)生[15]。在自發(fā)性高血壓大鼠[16]和腎血管性高血壓動物模型[17]中均存在RAS激活、血清和 (或) 組織中AngⅡ水平增高。本研究使用微量滲透泵持續(xù)灌注AngⅡ的方法復制高血壓大鼠模型,并檢測了各組血清中AngⅡ含量,觀察到在持續(xù)灌注AngⅡ后,大鼠血清中AngⅡ含量顯著升高,且血壓升高超過術前30 mmHg以上,提示AngⅡ誘導的高血壓大鼠模型復制成功。CAN灌胃治療顯著降低AngⅡ所致的高血壓,表明在高血壓形成過程中增高的AngⅡ通過與AT1R結合使血管發(fā)生收縮導致血壓升高,給予CAN灌胃治療可拮抗AT1R發(fā)揮顯著降壓作用。

    血管內皮功能障礙是多種心血管疾病發(fā)病的共同始動因素,eNOS活性降低導致內皮細胞產(chǎn)生NO減少是引起內皮功能障礙的關鍵環(huán)節(jié)[18]。eNOS的活性調控涉及基因轉錄、蛋白質翻譯和翻譯后修飾等過程,磷酸化和去磷酸化調控是eNOS蛋白質翻譯后修飾的重要機制之一,Ser1177位點磷酸化可顯著上調eNOS活性[7]。AngⅡ是引起eNOS Ser1177降低的一個重要因素。已有研究表明,AngⅡ可下調人主動脈內皮細胞eNOS Ser1177磷酸化水平,減少NO的產(chǎn)生,其作用是通過AT1R通路所介導[19]。在動物整體水平研究中同樣觀察到,高鹽性高血壓大鼠主動脈eNOS Ser1177磷酸化水平下降,給予AT1R阻滯劑CAN治療后顯著增高eNOS Ser1177磷酸化水平,增加NO合成[20];糖尿病小鼠主動脈eNOS Ser1177磷酸化水平下調,AT1R阻滯劑阿奇沙坦可上調eNOS Ser1177磷酸化水平,改善內皮功能[21]。本研究也觀察到AngⅡ誘導的高血壓大鼠腸系膜動脈eNOS Ser1177磷酸化水平顯著下調,而CAN顯著逆轉該效應。這些均提示AngⅡ通過AT1R通路顯著下調eNOS Ser1177的磷酸化水平,本文進一步研究其分子機制。

    既往研究已證實,PP2A參與eNOS Ser1177去磷酸化調節(jié)[9-10]。在本課題組前期研究中已檢測到2K1C高血壓大鼠腸系膜動脈eNOS Ser1177發(fā)生去磷酸化、PP2A活性增高,是由AngⅡ/AT1R 通路介導[12],繼續(xù)用大鼠腸系膜動脈進行離體水平研究,顯示20 nmol/L OA可顯著抑制AngⅡ誘導的eNOS Ser1177下調,進一步驗證了AngⅡ所介導的eNOS Ser1177下調是因PP2A的激活而引起[13]。本研究檢測到AngⅡ誘導大鼠腸系膜動脈PP2A活性顯著增高,通過分析PP2A活性與eNOS Ser1177磷酸化水平的相關性,結果表明二者呈負相關, 提示AngⅡ誘導的高血壓大鼠腸系膜動脈eNOS Ser1177磷酸化水平下調也是由于AngⅡ/AT1R通路激活PP2A所致。

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