正交試驗優(yōu)選鼻舒寧溫敏凝膠提取工藝

原泉　李傳勛　呂佳　周藝璇

【摘 要】 目的：探討優(yōu)化鼻舒寧凝膠的提取工藝，確定其最佳提取工藝參數(shù)。方法：采用L9（3）.4正交試驗，以鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿為評價指標(biāo)，優(yōu)選最佳提取工藝。結(jié)果：處方的最佳提取工藝為8、6倍量的水提取2次，每次1.5h。結(jié)論：優(yōu)化的提取方法合理可行，可作為該制劑合理開發(fā)的依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 鼻舒寧溫敏凝膠;鹽酸麻黃堿;鹽酸偽麻黃堿;正交試驗;提取工藝

【中圖分類號】R284.2 【文獻標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2019）15-0038-04

過敏性鼻炎（lergic rhinitis，AR）屬中醫(yī)鼻鼽范疇，主要癥狀有鼻癢、鼻塞、打噴嚏、流鼻涕等，是一種常見的多發(fā)性鼻病[1]。過敏性鼻炎病因分為外因與內(nèi)因。外因多為氣候變化、環(huán)境污染、風(fēng)寒及火熱之邪內(nèi)侵[2]。內(nèi)因則多責(zé)之于肺脾腎三臟功能失調(diào)。過敏性鼻炎雖然不會給患者帶來嚴重的健康和生命安全威脅，但是卻會導(dǎo)致患者出現(xiàn)情緒失調(diào)、疲勞、食欲減退、注意力減退、睡眠紊亂以及學(xué)習(xí)障礙等問題，降低患者生活質(zhì)量，所以必須重視過敏性鼻炎的臨床治[3]。

鼻用溫敏凝膠（nasal thermosensitive in situ ge1）是指以溶液狀態(tài)制備和給藥，在用藥部位因溫度變化刺激而發(fā)生相轉(zhuǎn)變，形成凝膠化半固體的制劑，獨特的溶液—凝膠轉(zhuǎn)變性質(zhì)兼有制備簡單、使用方便，可延長藥物在鼻腔內(nèi)的滯留時間等優(yōu)點[4]。泊洛沙姆（poloxamer）是目前研究較為深入的一類溫敏型高分子凝膠材料，具有良好的生物相容性[5]。此次實驗根據(jù)鼻腔的生理特點，制備鼻舒寧溫敏型原位凝膠，以期延長藥物在鼻黏膜上的滯留時間，從而提高藥物的生物利用度。

中醫(yī)外治法不但能夠有效控制過敏性鼻炎的癥狀，而且還可以有效降低復(fù)發(fā)率。鼻舒寧溫敏凝膠由麻黃、白芷、皂角等八味中藥組成，臨床上治療過敏性鼻炎有良好的療效。本試驗以鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿提取量為考察指標(biāo)， 通過正交試驗， 優(yōu)選鼻舒寧凝膠提取工藝條件， 為該制劑的制備工藝研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津LC-2010HT高效液相色譜儀（包括四元泵、VWD檢測器，自動進樣器，lab solution 化學(xué)工作站），日本島津有限公司;AE240型十萬分之一電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對照品（批號：171241-201809、171237-201510），中國食品藥品檢定研究院;乙腈色譜純，水為二次蒸餾水，其余所用試劑皆為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品測定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：月旭Welch ultimate XB-C18（4.6mm×150mm， 5μm）;流動相：乙腈-0.02mol/mL磷酸二氫鉀溶液（每100mL加入0.28mL三乙胺，磷酸調(diào)節(jié)pH值到3） （5∶95 ）;流速：1.0mL/min;柱溫：30℃;檢測波長：210nm。

2.1.2 對照品溶液的制備 對照品儲備溶液制備：精密稱定鹽酸麻黃堿對照品0.01060g，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。濃度為：0.1060mg/mL。精密稱定

鹽酸偽麻黃堿對照品0.00692g，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。濃度為：0.0692mg/mL。

對照品溶液制備：精密量取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對照品溶液各5mL，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。濃度分別為：鹽酸麻黃堿0.0530mg/mL、鹽酸偽麻黃堿0.0346mg/mL。

2.1.3 供試品溶液的制備 分別精密吸取各試驗項下提取液5mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45um微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.1.4 線性關(guān)系考察 依次吸取“2.1.2”項下制備好的混合對照品溶液1、5、10、15、20μL，按“2.1.1”項下的色譜條件分別進樣，記錄其各自的峰面積。以鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的進樣量（μg）為橫坐標(biāo)，各自的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制曲線，求得回歸方程分別為：Y=2215237X+8658.343，r=0.999925;Y=2313705X-5101.35，r=0.999978。結(jié)果表明，在鹽酸麻黃堿在0.0530～1.0600μg，鹽酸偽麻黃堿在0.0346～0.6920μg的范圍內(nèi)進樣，進樣量與峰面積成良好的線性關(guān)系，如圖1所示。

2.1.5 含量測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各 10μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以外標(biāo)法計算含量。

2.2 提取工藝的考察

2.2.1 正交試驗因素與水平設(shè)計 方中麻黃為君藥，其中主要含有鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿[6-7]。采用正交試驗優(yōu)化提取工藝，以方中君藥麻黃中所含鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿提取量為

考察指標(biāo)，對影響提取效果的提取次數(shù)、提取時間、溶媒用量因素進行考察，因素水平見表1。采用 L9（3.4）正交表安排試驗。

2.2.2 正交試驗設(shè)計 提取液的制備：分別取處方量的麻黃、白芷、川芎等藥材，按正交試驗表安排試驗，進行提取，濾過，即得正交試驗提取液1～9號。按2.1.1項下色譜條件，分別測定鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的含量，計算正交試驗提取液1～9號中指標(biāo)成分的含量，記錄各份提取液體積。結(jié)果見表2、3。

由方差分析可知，以鹽酸麻黃堿、偽麻黃堿總含量為指標(biāo)時，提取次數(shù)（A）和提取時間（B）有顯著性差異。由直觀分析可知，提取次數(shù)（A）和提取時間（B）的2、3水平優(yōu)于1而且兩者差異小，結(jié)合實際生產(chǎn)，確定最優(yōu)提取工藝為A2B3C2，即加8、6倍量的水回流提取2次，每次1.5h，麻黃堿、偽麻黃堿總轉(zhuǎn)移率高于80%。

2.2.3 驗證試驗 取同批復(fù)方藥材3份，分別按照最優(yōu)提取工藝進行試驗，制得的樣品測定鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量。結(jié)果見表4。

2.3 陰性供試品溶液的制備 取處方中除麻黃外的其余藥味，按優(yōu)選出的提取工藝提取，得到提取液，同供試品溶液的制備方法處理，制得陰性供試品溶液。

2.4 專屬性試驗 分別取對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，并分別記錄色譜圖，結(jié)果顯示陰性供試品對該實驗無干擾，如圖2、圖3、圖4所示。

2.5 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液適量，按“2.1.1”項下分別在0、2、6、8、12、24h依次進樣10μL，鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿峰面積的RSD分別為0.50%、0.76%（n=6），表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10μL，注入液相色譜儀，按“2.1.1”項下連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，測定峰面積，RSD分別為0.27%、0.24%，表明儀器有良好的精密度。

2.7 重復(fù)性試驗 取同一批樣品6份，每份5mL，按供試品溶液制備方法制備樣品，并依法測定計算含量及RSD，結(jié)果鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的RSD分別為0.71%、1.15%（n=6）。表明該法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的樣品2.5mL，共6份，至10mL量瓶中，依次加入鹽酸麻黃堿對照品溶液（0.0530mg/mL）3mL和鹽酸偽麻黃堿對照品溶液（0.0346mg/mL）3mL，按供試品制備方法制樣，按“2.1.1”項下進樣進行分析，計算回收率，結(jié)果得鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的平均回收率分別為101.94%和102.12%，RSD分別為1.31%和2.37%。

3 討論

3.1 測定目標(biāo)成分的選擇 麻黃為方中君藥，麻黃中鹽酸麻黃堿及鹽酸偽麻黃堿的含量最高，研究表明，鹽酸偽麻黃堿可選擇性地收縮上呼吸道毛細血管，消除鼻咽部黏膜充血、腫脹、減輕鼻塞等癥狀。對麻黃等藥材的提取工藝中，往往只局限于以麻黃堿含量為指標(biāo)進行工藝的優(yōu)選，具有一定的局限性; 本實驗增加了偽麻黃堿的含量測定。本實驗以鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量之和為指標(biāo)，優(yōu)選最佳提取工藝。

3.2 方法考察 采用紫外分光光度法對其進行全波長掃描，確定210nm處有最大吸收波長。查閱文獻[8-10]，確定HPLC法的液相條件為乙腈-0.02mol/mL磷酸二氫鉀溶液，該方法能夠縮短鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的出峰時間。并考慮使用三乙胺防止峰拖尾。在紫外波長范圍內(nèi)，磷酸的紫外吸收干擾比乙酸弱。在低吸收波長處，乙酸在220nm左右有吸收，會干擾吸收峰，故選用磷酸調(diào)節(jié)PH值，優(yōu)化峰型。

3.3 柱溫考察 分別考察柱溫為25℃、30℃、35℃等間隔的不同溫度對鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿色譜行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同溫度對兩者的系統(tǒng)適應(yīng)性考察參數(shù)及保留時間無明顯影響，故柱溫最終為30℃。

3.4 流速考察 分別選擇流速為0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min等流速對鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿色譜行為的影響，結(jié)果顯示不同流速對兩者的系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)和保留時間無明顯影響，故流速最終為1.0mL/min。

3.5 提取參數(shù)的確定 因鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿均具有揮發(fā)性，故回流提取的溫度不宜過高。因此不將溫度梯度作為正交試驗的考察因素。前期試驗及文獻[11-13]查閱確定了提取的次數(shù)、時間、溶媒量水平。

實驗結(jié)果顯示，液相條件小的變動對指標(biāo)成分的峰型，分離度，保留時間均影響較小，此色譜條件可靠，可用于日常含量測定。采用正交設(shè)計的方法優(yōu)化出最佳的提取工藝為加8、6倍量的水提取2次，每次提取1.5h，且驗證試驗證明回流方法的提取率大于80%。

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（收稿日期：2019-05-17 編輯：程鵬飛）