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    低劑量納曲酮對小鼠巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用及機(jī)理研究①

    2016-08-09 07:37:57郭勝男王曉楠單風(fēng)平
    中國免疫學(xué)雜志 2016年7期
    關(guān)鍵詞:巨噬細(xì)胞表型細(xì)胞因子

    郭勝男 李 巖 王曉楠 單風(fēng)平

    (中國醫(yī)科大學(xué)免疫教研室,沈陽110001)

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    低劑量納曲酮對小鼠巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用及機(jī)理研究①

    郭勝男李巖王曉楠單風(fēng)平

    (中國醫(yī)科大學(xué)免疫教研室,沈陽110001)

    [摘要]目的:探討納曲酮(Naltrexone,NTX)對小鼠腹膜巨噬細(xì)胞表型,分泌細(xì)胞因子及吞噬功能的影響。 方法:本實(shí)驗(yàn)利用新型四唑化合物比色法測得NTX對RAW264.7細(xì)胞作用的最佳劑量;再將培養(yǎng)的腹膜巨噬細(xì)胞分為3組,RPMI1640空白對照組、脂多糖(LPS)陽性對照組和NTX處理組,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD206、CD64的陽性表達(dá)率及對葡聚糖的吞噬能力;ELISA法檢測白介素10(IL-10)、白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的分泌表達(dá)。結(jié)果:10-11mol/L劑量可顯著促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖;NTX(10-11mol/L)處理可明顯提高腹膜巨噬細(xì)胞表面CD64的陽性表達(dá),減少CD206的表達(dá);提高對葡聚糖的吞噬能力;TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)顯著增加,IL-10的表達(dá)無明顯差異。結(jié)論:低劑量納曲酮可改變巨噬細(xì)胞表型及功能,起免疫調(diào)節(jié)作用。

    [關(guān)鍵詞]納曲酮;巨噬細(xì)胞;表型;細(xì)胞因子;吞噬能力

    納曲酮(Naltrexone,NTX)是一種有效的非選擇性阿片受體拮抗劑,特定劑量下能明顯阻斷μ、κ、δ阿片受體,其在結(jié)構(gòu)和功能上都與阿片類拮抗劑納洛酮相似[1]。NTX在臨床中主要被用于戒斷阿片等毒品所致的成癮[2],低劑量納曲酮(Low dose of naltrexone,LDN)指的每日劑量大約是阿片類藥物成癮劑量的1/10,現(xiàn)納曲酮的每日劑量常為4.5 mg[3]。現(xiàn)有研究表明,LDN具有顯著的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[4]。課題組的研究已表明LDN可以促進(jìn)樹突細(xì)胞的成熟,提高其抗原遞呈能力[5]。目前就LDN對巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用尚未見報(bào)道。本文通過LDN作用于小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,以觀察對巨噬細(xì)胞表型及功能的影響。

    1材料與方法

    1.1材料

    1.1.1細(xì)胞與動(dòng)物小鼠巨噬細(xì)胞系 RAW264.7購自中科院上海細(xì)胞庫,所用培養(yǎng)基為含10%FBS的DMEM,于37℃、5%CO2孵箱中傳代培養(yǎng);雌雄各一半的BALB/c小鼠,重量19~23 g,周齡6~8周,購自中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

    1.1.2藥物與試劑納曲酮(C20H23NO4·HCl,分子量為377.86,由嘉事瑞康醫(yī)藥有限公司惠贈(zèng));MTS細(xì)胞增殖試劑盒購自Sigma公司;F4/80、CD206、CD64抗體購自Biolegend公司;IL-12、IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒購自eBioscience公司。

    1.2方法

    1.2.1小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離與培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)前3 d,將10%可溶性淀粉肉湯注射到小鼠腹腔,劑量為1 ml/只,3 d后處死,在75%乙醇溶液中浸泡10~15 min后向小鼠腹腔注射含1%胎牛血清的PBS5 ml,輕揉腹部15~20 min,在腹壁剪一小口,將灌洗液吸出,1 000 r/min離心10 min。棄上清,PBS洗滌2次,含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞,計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106ml-1。將細(xì)胞分別接種于6孔板和96孔板中,置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),4 h后換液,去除未貼壁的細(xì)胞,貼壁細(xì)胞即巨噬細(xì)胞。

    1.2.2以MTS細(xì)胞增殖試劑盒測定RAW264.7細(xì)胞增殖率,確定LDN的最佳作用濃度用消化液消化RAW264.7細(xì)胞,收集細(xì)胞懸浮液,經(jīng)1 000 r/min,3 min離心后以10%FBS的DMEM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞,然后以細(xì)胞密度5×104/孔注入96孔板中,設(shè)實(shí)驗(yàn)組(即終濃度分別為10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15mol/L的NTX)、對照組(DMEM組),37℃培養(yǎng)24 h。于4 h前加入試劑液,繼續(xù)培養(yǎng),4 h后在酶標(biāo)儀上測定490nm處吸光度。根據(jù)公式計(jì)算RAW264.7在藥物刺激下的增殖作用。巨噬細(xì)胞增殖作用(%)=[(實(shí)驗(yàn)孔A值-空白孔A值)/(對照孔A值-空白孔A值)-1]×100%。

    1.2.3藥物處理以上述方法測得的LDN最佳劑量,加入分離后培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中,用RPMI1640培養(yǎng)作空白對照組,10 ng/ml的LPS刺激培養(yǎng)作為陽性對照,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

    1.2.4免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞經(jīng)藥物作用24 h后,用胰酶消化為細(xì)胞懸液,用FACS(含2%FCS的PBS)洗1次,1 500 r/min離心5 min,調(diào)整細(xì)胞濃度1×107個(gè)/ml,每管加入100 μl,細(xì)胞懸液,加入FITC標(biāo)記的F4/80、Percp-Cy5.5標(biāo)記的CD64、PE標(biāo)記的CD206單克隆抗體。4℃避光溫育30 min,用FACS緩沖液洗3遍,然后用300 μl FACS緩沖液重懸細(xì)胞置于流式細(xì)胞儀(FACScan B.D.)檢測。

    1.2.5吞噬作用檢測巨噬細(xì)胞經(jīng)24 h刺激后,消化收集細(xì)胞,加入FITC-dextran抗體,37℃避光溫育1 h,用FACS緩沖液洗3遍,然后用300 μl FACS緩沖液重懸細(xì)胞置于流式細(xì)胞儀(FACScan BD)檢測。

    1.2.6細(xì)胞因子檢測巨噬細(xì)胞經(jīng)藥物作用24 h后收集上清,應(yīng)用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α含量,試驗(yàn)按照試劑盒說明書中的步驟操作,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定所測細(xì)胞因子的濃度。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行處理分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間兩兩比較采用Scheffe法,P<0.05為差異有顯著性。

    2結(jié)果

    2.1LDN最佳作用濃度的確定RAW264.7細(xì)胞經(jīng)不同濃度的NTX處理后,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,MTS比色法檢測其細(xì)胞生長情況,發(fā)現(xiàn)不同劑量對細(xì)胞增殖的影響有顯著差異(P<0.05),10-3mol/L的NTX可抑制細(xì)胞的增殖,而10-4mol/L劑量以下濃度的NTX可促進(jìn)細(xì)胞的增殖,根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖率,發(fā)現(xiàn)在10-11mol/L劑量時(shí)細(xì)胞的增殖作用最強(qiáng),見圖1。

    2.2LDN對CD206、CD64表達(dá)的影響小鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)藥物刺激培養(yǎng)24 h后,流式細(xì)胞儀檢測膜分子CD206、CD64的表達(dá)情況。與RPMI1640組相比較,LPS組和LDN組巨噬細(xì)胞表達(dá)CD64+CD206+降低,CD64+CD206-增多(P<0.05),見圖2。

    圖1 納曲酮對細(xì)胞增殖作用的影響(n=3,%)Fig.1 Effects of naltrexone on cell proliferation(n=3,%)

    圖2 巨噬細(xì)胞膜表面分子CD206和CD64的表達(dá)(n=3)Fig.2 Expression of CD206 and CD64 on macrophages (n=3)Note: A.Blank control;B.LPS treated group;C.NTX treated group.Compared with RPMI1640 group,*.P<0.01.

    表1細(xì)胞因子的表達(dá)情況(n=3)

    Tab.1Expression of cytokines on different groups(n=3)

    GroupsTNF-α(pg/ml)IL-6(pg/ml)IL-1β(pg/ml)IL-10(pg/ml)Blankcontrol15.59±5.4394.697±4.53012.08±9.063191.1±228.6NTX70.08±6.59727.56±15.23125.40±35.21203.6±77.82LPS31.92±9.187190.6±12.9974.28±5.7051768±787.1

    圖3 不同處理組巨噬細(xì)胞吞噬能力的改變(n=3)Fig.3 Phagocytosis of macrophages on different groups(n=3)Note: A.Blank control;B.LPS treated group;C.NTX treated group.Compared with RPMI1640 group,*.P<0.05.

    2.3LDN促進(jìn)巨噬細(xì)胞對葡聚糖的吞噬能力巨噬細(xì)胞經(jīng)藥物刺激培養(yǎng)24h后,再加入FITC-dextran后37℃避光溫育1 h,在流式細(xì)胞儀上檢測陽性細(xì)胞的百分比,以此代表Mφ吞噬FITC-dextran的量,反映Mφ的吞噬能力。與空白對照組(即RPMI1640組)相比較,經(jīng)10-11mol/L的NTX處理后巨噬細(xì)胞吞噬能力明顯提高(P<0.05)。見圖3。

    2.4LDN對巨噬細(xì)胞Mδ分泌IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α的影響ELISA結(jié)果顯示,與空白對照(即RPMI1640組)比較,LPS處理組分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10表達(dá)明顯提高;10-11mol/L的NTX處理組分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)也顯著提高(P<0.01),分泌IL-10水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;與LPS處理組比較,10-11mol/L的NTX處理組能分泌高水平的TNF-α和IL-1β(P<0.01),詳情見表1、圖4。

    圖4 細(xì)胞因子的表達(dá)情況(n=3)Fig.4 Expression of cytokines on different groups(n=3)Note: A.TNF-α;B.IL-6;C.IL-1β;D.IL-10.Compared with RPMI1640 group,*.P<0.05,**.P<0.01.

    3討論

    巨噬細(xì)胞作為重要的固有免疫細(xì)胞,是機(jī)體抗感染的第一道防線,在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和免疫防御中扮演非常重要的角色。巨噬細(xì)胞是一類具有可塑性、異質(zhì)性的細(xì)胞群體,在不同微環(huán)境條件下,可被誘導(dǎo)激活,發(fā)生極化現(xiàn)象。M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞是國際上多數(shù)學(xué)者所認(rèn)可的一種分類方法,兩型巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出各自的功能及區(qū)分標(biāo)志。M1型可由LPS、IFN-γ誘導(dǎo)產(chǎn)生,高表達(dá)iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β,表現(xiàn)出較強(qiáng)的促炎和抗腫瘤作用;M2型可由IL-4誘導(dǎo)產(chǎn)生,高表達(dá)TGF-β、Arg-1等,可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性和清理能力,同時(shí)促進(jìn)組織修復(fù)[6]。

    研究表明,不同極化狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞在動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性多發(fā)性硬化癥、自身免疫性腦脊髓膜炎、肌萎縮側(cè)索硬化癥及阿爾茨海默病的發(fā)病各個(gè)階段存在明顯差異[7]。巨噬細(xì)胞的極化與動(dòng)脈粥樣硬化形成的機(jī)制相關(guān)[8]。另外,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophage,TAM)是腫瘤進(jìn)展和腫瘤免疫抑制的重要參與者,大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)均證實(shí)了M2型TAM對腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移起著重要作用,而M1型則具有抑制腫瘤生長的作用[9,10]。巨噬細(xì)胞的極化可參與多種疾病的演化過程,進(jìn)一步探索M1和M2型巨噬細(xì)胞間的關(guān)系,逆轉(zhuǎn)M2型向M1型極化,為腫瘤治療和其他免疫相關(guān)疾病提供了一個(gè)新的可能。

    近年來,LDN作為一種新型抗炎制劑,其免疫活性的研究越來越多。已有研究表明其可通過小膠質(zhì)細(xì)胞對中樞神經(jīng)系統(tǒng)起作用,能減輕纖維肌痛癥,克羅恩氏病,多發(fā)性硬化癥等疾病癥狀[11-13]。Donahue研究發(fā)現(xiàn)LDN聯(lián)合抗腫瘤藥物在體外可顯著抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV-3的生長,體內(nèi)則有效抑制小鼠腫瘤發(fā)生進(jìn)程[14]。Abdel等[15,16]研究發(fā)現(xiàn)LDN可以增強(qiáng)AIDS病人對HIV感染的免疫應(yīng)答。關(guān)于LDN調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的具體機(jī)制尚在探索中,眾多研究者普遍認(rèn)為低劑量納曲酮的免疫調(diào)節(jié)作用是與機(jī)體內(nèi)源性阿片物質(zhì)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制相關(guān)聯(lián)的。Brown[17]認(rèn)為LDN誘導(dǎo)產(chǎn)生一個(gè)小的、瞬態(tài)的阿片樣物質(zhì)封鎖,從而促進(jìn)人體上調(diào)內(nèi)源性阿片類物質(zhì)和阿片受體,這種反彈效應(yīng)引起了免疫機(jī)能的改變。本文就LDN可逆轉(zhuǎn)M2型向M1型極化的表型、分泌細(xì)胞因子和吞噬能力等方面做了初步研究,但具體的作用機(jī)制尚不清楚,有待進(jìn)一步研究。

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    [收稿2015-09-22修回2016-02-23]

    (編輯張曉舟)

    doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.008

    作者簡介:郭勝男(1990年-), 女,在讀碩士,主要從事腫瘤免疫調(diào)節(jié)方面的研究,E-mail:drguoshengnan@163.com。 通訊作者及指導(dǎo)教師:單風(fēng)平(1959-),男,博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事腫瘤免疫調(diào)節(jié)研究,E-mail:fpshan@mail.cmu.edu.cn。

    中圖分類號R392.12R392.5

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

    文章編號1000-484X(2016)07-0970-04

    Immuno-regulatory effects on murine macrophages by low dose naltrexone(LDW)

    GUO Sheng-Nan,LI Yan,WANG Xiao-Nan,SHAN Feng-Ping.

    Department of Immunology,China Medical University,Shenyang 110001,China

    [Abstract]Objective:The effect of naltrexone on function of murine peritoneal macrophage in vitro was studied in order to illuminate its immune activity futher.Methods: Peritoneal macrophages were divided in three groups:RPMI1640 blank control group,LPS positive control group and NTX treated group.Various phenotypic and functional indices were tested by MTS,flow cytometry technology,phagocytosis experiment and ELISA.Results: Compared with RPMI1640 group,at a LDN exhibits paradoxical properties;the expression of CD64 on surface increased while the expression of CD206 decreased in NTX group; the expression of tumour necrosis factor-α(TNF-α),interleukin-6(IL-6),interleukin-1β(IL-1β)were increased.Conclusion: The results of experiment had proved that LDN could influence macrophage polarzation,regulate the inflamatory mediators production and affect the phagocytosis function of peritoneal macrophage.

    [Key words]Naltrexone; Macrophage; Phenotype; Cytokine; Phagocytosis

    ①本文為遼寧省科技廳基金項(xiàng)目(No.2012-225014)。

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