抗PD-L1單抗的研制及其對(duì)乙型肝炎病毒的抑制效果初步研究①

吳　勇　張?zhí)煊ⅰ∷螢g偉　夏寧邵　袁　權(quán)

(廈門大學(xué)分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，公共衛(wèi)生學(xué)院，廈門361102)

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抗PD-L1單抗的研制及其對(duì)乙型肝炎病毒的抑制效果初步研究①

吳勇張?zhí)煊ⅱ谒螢g偉③夏寧邵袁權(quán)

(廈門大學(xué)分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，公共衛(wèi)生學(xué)院，廈門361102)

[摘要]目的：獲得具有阻斷PD-1/PD-L1結(jié)合活性的Anti-PD-L1單克隆抗體，并在體內(nèi)和體外模型中初步探索其應(yīng)用于慢性HBV感染治療的潛力。方法：利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)和離子交換柱層析純化手段，表達(dá)純化獲得具有體外結(jié)合活性的人源和鼠源的PD-1/PD-L1蛋白，采用純化后的人PD-L1蛋白作為免疫原免疫BALB/c小鼠，制備小鼠抗人PD-L1的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，基于間接化學(xué)發(fā)光免疫法評(píng)估了這些抗體與人源和鼠源重組蛋白的結(jié)合活性，并定量評(píng)估它們對(duì)PD-L1體外相互作用的阻斷活性。利用慢乙肝病人PBMC體外刺激方法評(píng)估其對(duì)T細(xì)胞功能的促進(jìn)作用，在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中評(píng)估其抑制HBV的效果。結(jié)果：本研究獲得了8株穩(wěn)定分泌Anti-PD-L1的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其中Anti-PD-L1 Ab5和Ab6兩株單抗與人和小鼠的PD-L1具有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)性，且均可阻斷人和小鼠的PD-1/PD-L1結(jié)合活性。在慢乙肝病人PBMC刺激培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，Ab5和Ab6可促進(jìn)γ干擾素水平升高；在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中單劑注射Ab6，48 h后血清HBV DNA水平降低20倍，血清HBsAg水平降低至基線水平的30%。結(jié)論：獲得了2株具有阻斷人和小鼠PD-1/PD-L1結(jié)合活性的單克隆抗體，其在PBMC體外刺激培養(yǎng)系統(tǒng)中可促進(jìn)慢乙肝病人的T細(xì)胞功能，在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中具有顯著的抗病毒效果，具備一定的治療應(yīng)用潛力。

[關(guān)鍵詞]程序性細(xì)胞死亡蛋白配體1；治療性單克隆抗體；乙型肝炎病毒；免疫治療

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染會(huì)導(dǎo)致急性或慢性的肝臟炎癥，其中慢性肝炎可能會(huì)進(jìn)一步進(jìn)展為肝硬化或肝癌，目前全球仍有超過2.4億慢性HBV感染者[1]。在慢性感染期間，病毒復(fù)制與宿主免疫應(yīng)答的動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系對(duì)于疾病的進(jìn)展至關(guān)重要。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為獲得性免疫應(yīng)答，尤其是細(xì)胞免疫應(yīng)答介導(dǎo)了HBV的清除[2,3]。然而，慢乙肝病人體內(nèi)的HBV特異性T細(xì)胞的功能是有缺陷的，表現(xiàn)為抗病毒細(xì)胞因子分泌水平較低，細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)活性較弱以及持續(xù)的病毒血癥[4]。但是目前對(duì)于慢乙肝感染后T細(xì)胞功能缺陷的機(jī)制并不清楚。

程序性細(xì)胞死亡受體-1 (Programed cell death l,PD-1)，最初是在凋亡的T細(xì)胞雜交瘤中利用削減雜交的方法得到的，由于其和細(xì)胞凋亡相關(guān)而得名，其N 端酪氨酸殘基參與構(gòu)成一個(gè)免疫受體酪氨酸抑制基序[5]。PD-1/PD-L1通路已被廣泛報(bào)道在T細(xì)胞激活和增殖以及細(xì)胞因子分泌過程中起負(fù)向調(diào)節(jié)作用[6,7]。已有證據(jù)表明PD-1信號(hào)通路在抑制慢性病毒性感染病人體內(nèi)的病毒特異CD8+T細(xì)胞過程中起重要作用，包括HIV感染、HCV感染和HBV感染[8-10]。最近的研究通過誘導(dǎo)T細(xì)胞失活、在外周T淋巴細(xì)胞上高表達(dá)PD-1分子、阻斷PD-1介導(dǎo)的通路表明PD-1/PD-L1負(fù)調(diào)控信號(hào)是導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭的重要因素[11-13]。

目前用于HBV治療的藥物包括干擾素類(IFN)和核苷類似物類(NAs)，治療策略相對(duì)有限，治療效果不理想[14,15]，針對(duì)慢性HBV感染者發(fā)展創(chuàng)新的、能促進(jìn)逆轉(zhuǎn)免疫耐受的創(chuàng)新治療藥物和方法是迫切且必要的。近期研究表明慢性HBV感染與PD-1/PD-L1信號(hào)通路密切相關(guān)，通過抗體阻斷該通路可以刺激特異的T細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)病毒的清除[16,17]。因此，篩選具有阻斷活性的Anti-PD-L1單克隆抗體有望為慢性乙型肝炎病毒感染等免疫耐受性疾病的治療提供新策略。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株E.coli DH5α由本中心保存；E.coli ER2566購自New England Biolabs公司。

1.1.2載體和質(zhì)粒pMD18-T購自TaKaRa公司；pTO-T7載體由本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建。

1.1.3細(xì)胞小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0細(xì)胞由廈門萬泰公司饋贈(zèng)，培養(yǎng)于含10% 胎牛血清、50 μg/ml青霉素/鏈霉素的1640HT培養(yǎng)基(pH7.2)中，5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。

1.1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c品系小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠由臺(tái)灣大學(xué)陳培哲教授惠贈(zèng)，飼養(yǎng)于分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)動(dòng)物房內(nèi)，本實(shí)驗(yàn)遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》。

1.1.5主要試劑生化藥品為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純；質(zhì)粒小量提取試劑盒、微量膠回收試劑盒均購自Tiangen公司；HBsAg檢測試劑盒、HBV DNA熒光定量PCR試劑盒、人干擾素定量檢測試劑盒均購自北京萬泰生物公司；DNA Marker DL2000購自TaKaRa公司；考馬斯亮藍(lán)染色試劑(SDS-PAGE)購自HyClone公司；SYBR Green DNA熒光染料購自Clare Chemical公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自美國Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司。

1.2方法

1.2.1質(zhì)粒構(gòu)建從Genbank獲得人和小鼠的PD-1/PD-L1基因全長序列，本研究設(shè)計(jì)表達(dá)了人PD-1/PD-L1和小鼠PD-1/PD-L1的膜外區(qū)域，分別為：Human PD-1-aa21-aa170、Human PD-L1-aa20-aa238、Mouse PD-1-aa1-a167、Mouse PD-L1-aa20-aa240(以下簡稱hPD-1、hPD-L1、mPD-1、mPD-L1)，引物設(shè)計(jì)如表1所示；以人PD-1和人PD-L1的cDNA為模板擴(kuò)增出hPD-1、hPD-L1目的片段，提取C57BL/6小鼠的脾臟細(xì)胞的mRNA作為模板，反轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增出mPD-1、mPD-L1目的片段。

將擴(kuò)增獲得的DNA片段分別與pMD18-T載體連接，得到以下四種質(zhì)粒：T-hPD-1、T-hPD-L1、T-mPD-1、T-mPD-L1經(jīng)測序鑒定正確后用BglⅡ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切后與pTO-T7載體連接并轉(zhuǎn)入E.coli菌株ER2566挑克隆，經(jīng)BglⅡ/EcoRⅠ雙酶切及DNA測序鑒定獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pT-hPD-1、pT-hPD-L1、pT-mPD-1、pT-mPD-L1。

表1人和小鼠PD-L1 PCR擴(kuò)增正反向引物序列

Tab.1Upper and lower primers of human and mouse PD-L1

PrimernamePrimersequenceHumanPD-1(21-170)FTTTAGATCTATGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCHumanPD-1(21-170)RTTTGAATTCTCACCAGGGTTTGGAACTGGCCHumanPD-L1(20-238)FTTTAGATCTATGACTGTCACGGTTCCCAAGGACCTHumanPD-L1(20-238)RTTTGAATTCTTACCTTTCATTTGGAGGATGTGCCAMousePD1(1-167)FTTTAGATCTA6TGTGGGTCCGGCAGGTACCCTGGTCAMousePD1(1-167)RTTTGAATTCTTATTGAAACCGGCCTTCTGGTTTGGGCGAMousePD-L1(20-240)FTTTAGATCTATGACTATCACGGCTCCAAAGGACMousePD-L1(20-240)RTTTGAATTCTTACCAGTGAGTCCTGTTCTGTGGAGGAT

1.2.2蛋白表達(dá)純化將鑒定正確的單克隆表達(dá)菌株于37℃大量培養(yǎng)至菌液OD600=0.5左右，加入IPTG至終濃度1 mmol/L， 37℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h，經(jīng)鑒定，4種蛋白均表達(dá)在包涵體。hPD-1和mPD-1純化步驟一致，以hPD-1為例詳述純化步驟，超聲破碎表達(dá)菌體后高速離心后棄上清，以含有2% Triton X-100的PBS緩沖液洗滌兩次，每次在室溫條件下攪拌洗滌1 h，完成洗滌后以20 mmol/L PBS洗一次，不溶解的沉淀部分以適量的2 mol/L Urea+10 mmol/L DTT的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)，4 mol/L Urea+10 mmol/L DTT的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)及8 mol/L Urea+10 mmol/L DTT的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)逐級(jí)溶解；經(jīng)過包涵體洗滌后溶解于4 mol/L Urea+10 mmol/L DTT的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液的蛋白進(jìn)一步進(jìn)行陰離子交換層析(GE公司DEAE-FF-Sepharose、Q-FF-Sepharose層析柱)純化。純化后將蛋白透析至20 mmol/L MES緩沖液pH5.5中，于-20℃保存。hPD-L1和mPD-L1的純化步驟一致，其蛋白包涵體洗滌、溶解、柱層析純化過程與hPD-1基本相同，差別之處在于其復(fù)性過程相對(duì)簡單，DEAE柱層析純化后的hPD-L1蛋白處于4 mol/L Urea+10 mmol/L DTT的20 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)緩沖液中，采用Sephadex G25脫鹽柱將緩沖液置換為20 mmol/L TB8.0(pH8.0)緩沖液中，于-20℃保存。

1.2.3Anti-PD-L1單抗制備初次免疫選取6周齡BABL/c雌性小鼠皮下多點(diǎn)注射弗氏完全佐劑乳化后的免疫原h(huán)PD-L1，劑量為100 μg/只，同時(shí)經(jīng)眼球采集空白陰性血。2周后以相同途徑、相同劑量的抗原與弗氏不完全佐劑乳化后皮下加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)2次后小鼠血清抗體滴度達(dá)到平臺(tái)期，脾臟沖擊免疫20 μg，進(jìn)行融合實(shí)驗(yàn)。每次免疫前眼底采血，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱30 min，12 000 r/min高速離心 10 min后，取血清-80 ℃保存，利用間接法 ELISA檢測血清Anti-PD-L1抗體滴度。

融合前三天進(jìn)行脾臟免疫加強(qiáng)，無菌條件下取小鼠脾臟制備脾細(xì)胞懸液，使用PEG 1500促進(jìn)脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合；用hPD-L1蛋白包板，通過常規(guī)間接ELISA差異篩選特異性陽性融合株，有限稀釋法進(jìn)行克隆化，獲得的穩(wěn)定細(xì)胞株擴(kuò)增、腹腔注射BALB/c小鼠，1周后收集腹水，硫酸銨沉淀法、Protein A柱純化得到單克隆抗體?？贵w進(jìn)行12%的SDS-PAGE分析，觀察樣品純度。

1.2.4單抗阻斷hPD-1/hPD-L1、mPD-1/mPD-L1結(jié)合活性檢測實(shí)驗(yàn)分別將mPD-1和hPD-1蛋白包被于聚苯乙烯微孔板中作為固相受體，100 ng/孔，再將生物素標(biāo)記的PD-L1蛋白和Anti-PD-L1單抗混合樣品于微孔板中孵育，待其充分反應(yīng)之后將樣品中未結(jié)合的游離蛋白洗去，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素進(jìn)行反應(yīng)，將未結(jié)合的酶標(biāo)記親和素洗去，最終加入化學(xué)發(fā)光顯色底物，通過酶標(biāo)儀讀取數(shù)值判斷反應(yīng)強(qiáng)弱，進(jìn)而分析待檢測的Anti-PD-L1單抗的阻斷活性。

1.2.5單抗功能評(píng)價(jià)體外刺激T細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)：分離慢乙肝患者的外周血單核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行體外刺激培養(yǎng)，方法參考文獻(xiàn)[18]。在培養(yǎng)基中加入去類毒素的HBV核心蛋白(10 μg/ml)刺激HBV-core 特異的T細(xì)胞活性，分別加入不同劑量的待測抗體或?qū)φ湛贵w(0、1、5、20 μg/ml)，刺激培養(yǎng)48 h后檢測其分泌的γ干擾素水平以反應(yīng)其T細(xì)胞應(yīng)答的水平。

體內(nèi)抗病毒效果評(píng)估實(shí)驗(yàn)：以20 mg/kg的劑量單劑尾靜脈注射的方式注入HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，每組4只HBV轉(zhuǎn)基因小鼠。通過眼眶后靜脈叢取血的方式監(jiān)測小鼠血清中的HBsAg水平和HBV DNA水平的變化。HBsAg化學(xué)發(fā)光檢測及HBV DNA定量檢測按照試劑盒說明書操作。

2結(jié)果

2.1PD-1與PD-L1蛋白的表達(dá)、純化與鑒定

2.1.1PD-1與PD-L1蛋白的表達(dá)、純化本研究成功構(gòu)建了hPD-1、hPD-L1、mPD-1和mPD-L1四種原核重組表達(dá)質(zhì)粒，通過大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)并純化了這四種蛋白。純化最終得到蛋白純度均在85%以上，如圖1A所示。

2.1.2PD-1與PD-L1蛋白的生物活性鑒定利用化學(xué)發(fā)光免疫法分析本研究制備的PD-1和PD-L1之間的相互作用活性，人和小鼠的PD-1/PD-L1進(jìn)行同種屬及種屬間的相互配對(duì)檢測，結(jié)果如圖1B所示，hPD-1與mPD-L1的結(jié)合力最強(qiáng)，hPD-1與hPD-L1、mPD-1與mPD-L1兩者結(jié)合力都較強(qiáng)且強(qiáng)度相當(dāng)，mPD-1與hPD-L1的結(jié)合力最弱。此結(jié)果表明，重組表達(dá)的4種蛋白具備很好的生物活性，可作為免疫原用于制備特異的Anti-PD-L1小鼠抗體，并為后續(xù)的抗體性質(zhì)評(píng)估提供基礎(chǔ)。

2.2Anti-PD-L1單克隆抗體性質(zhì)鑒定

2.2.1Anti-PD-L1單抗與重組抗原反應(yīng)性鑒定本研究共計(jì)制備了8株穩(wěn)定分泌鼠Anti-PD-L1的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株(Ab1-Ab8)，分別將重組蛋白hPD-L1和mPD-L1包被于96孔化學(xué)發(fā)光板，將抗體濃度稀釋至0.1 μg/ml，利用間接法CLEIA鑒定這8株單抗的反應(yīng)性，結(jié)果如圖2A所示，與無關(guān)對(duì)照單抗相比，8株單抗均具有特異的反應(yīng)活性，其中Ab5和Ab6兩株單抗與人和小鼠的PD-L1具有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)活性。

2.2.2Anti-PD-L1單抗阻斷hPD-1/hPD-L1、mPD-1/mPD-L1結(jié)合的活性鑒定基于1.2.4所述方法，通過摸索生物素標(biāo)記的PD-L1-biotin的濃度，使其在未加入阻斷抗體時(shí)最終讀值為log10(RLU)=6.3，該讀值處于儀器設(shè)備線性讀值范圍的中間區(qū)域；經(jīng)過條件優(yōu)化，最終確定反應(yīng)條件如下：hPD-1或mPD-1稀釋于50 mmol/L 碳酸鹽緩沖液至2 μg/ml，100 μl/孔，于4℃過夜包被至96孔化學(xué)發(fā)光板中； hPD-L1-biotin或mPD-L1-biotin使用20%牛血清稀釋至終濃度為2 μg/ml作為工作液，抗PD-1或抗PD-L1單抗初始濃度為20 μg/ml，3倍梯度稀釋，檢測稀釋的抗體對(duì)人和小鼠的PD-1/PD-L1的阻斷效果。

對(duì)8株Anti-PD-L1單抗的阻斷活性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果如圖2B所示，5株抗體人和小鼠PD-1/PD-L1均顯示出不同程度的阻斷效果，其中Ab5與Ab6株單抗對(duì)人和小鼠PD-1/PD-L1的相互作用均顯示出較為顯著的阻斷效果。

2.3Anti-PD-L1抗體的體內(nèi)外功能初步研究挑選對(duì)人和小鼠PD-1/PD-L1阻斷活性較強(qiáng)的Ab5與Ab6兩株抗體進(jìn)行體內(nèi)外功能評(píng)估。本實(shí)驗(yàn)基于慢乙肝患者的PBMC體外刺激培養(yǎng)系統(tǒng)，評(píng)估Ab5和Ab6對(duì)其γ干擾素分泌的影響，該刺激系統(tǒng)中同時(shí)在培養(yǎng)基中加入去類毒素的HBV核心蛋白可刺激HBV-core 特異的T細(xì)胞活性，檢測其分泌的γ干擾素水平以反映其T細(xì)胞應(yīng)答的水平。每組中的單抗劑量分別為0、1、5、20 μg/ml，以無關(guān)單抗作為對(duì)照，結(jié)果如圖3A所示，在刺激培養(yǎng)體系中加入Ab5或Ab6可以刺激慢乙肝患者外周血細(xì)胞的γ干擾素分泌，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，γ干擾素分泌水平隨抗體劑量的升高而上升，提示Ab5和Ab6可增強(qiáng)HBV特異的T細(xì)胞的活性，對(duì)于逆轉(zhuǎn)慢乙肝患者的HBV免疫耐受狀態(tài)具有一定的潛力。

圖1　人和小鼠PD-1/PD-L1蛋白純度與結(jié)合活性鑒定Fig.1　Purity and interaction activity of human and mouse PD-1/PD-L1 Note: A.SDS-PAGE analysis of human and mouse recombinant PD-1/PD-L1；M.Protein ladder;1.hPD-1;2.hPD-L1;3.mPD-1;4.mPD-L1；B.The cross interaction between PD-1/PD-L1.

由于Ab5和Ab6可阻斷mPD-1/mPD-L1結(jié)合，因此可以利用HBV攜帶小鼠評(píng)估其體內(nèi)的抗病毒活性。本實(shí)驗(yàn)所用的模型是基于C57BL/6的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，Anti-PD-L1單抗Ab5和Ab6通過尾靜脈，以20 mg/kg的劑量給藥后，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清中的HBsAg和HBV DNA水平均顯著下降，其中Ab5治療效果較優(yōu)，抗體治療后48 h，小鼠血清中HBsAg平均水平從7 000 U/ml降至2 000 U/ml，HBV DNA水平從106.60 U/ml降至105.30 U/ml(見圖3)。結(jié)果顯示該抗體在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中具有顯著的抗病毒效果，具備一定的治療應(yīng)用潛力。

圖2　Anti-PD-L1單抗性質(zhì)鑒定Fig.2　Properties of Anti-PD-L1 mAbNote: A.Analysis of Anti-PD-1 mAb reactivity;B.Blockade efficiency of Anti-PD-L1 mAbs against human and mouse PD1/PD-L1.

圖3　Anti-PD-L1單抗治療后HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)γ干擾素水平和HBsAg水平變化Fig.3　Change of interferon-gamma level and HBV level post Anti-PD-L1 mAbs treatment in HBV transgenic miceNote: A.Change of interferon-gamma level;B.Change of HBsAg level.

3討論

在持續(xù)性病毒感染動(dòng)物模型中的研究顯示，長期暴露于高濃度的抗原會(huì)造成不同程度的抗病毒T細(xì)胞功能的缺陷，甚至是功能性缺失。慢性HBV感染的病人血清中存在大量的病毒抗原，有研究顯示HBV特異的T細(xì)胞功能與病毒學(xué)水平呈負(fù)相關(guān)，T細(xì)胞耗竭的機(jī)制可能在慢乙肝疾病進(jìn)展中扮演重要角色[8,19,20]。因此，通過抗體阻斷PD-1/PD-L1共抑制信號(hào)通路，從而增強(qiáng)抗病毒特異的T細(xì)胞功能，促進(jìn)免疫耐受的逆轉(zhuǎn)，可能為慢性乙型肝炎的治療提供新途徑。

本研究采用大腸桿菌表達(dá)的人PD-L1蛋白作為免疫原免疫BALB/c小鼠，獲得8株穩(wěn)定分泌Anti-PD-L1的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，部分抗體與小鼠PD-L1也具有較強(qiáng)的反應(yīng)活性，其中交叉結(jié)合活性最強(qiáng)的兩株抗體是Ab5和Ab6，且均可阻斷人和小鼠的PD-1/PD-L1結(jié)合活性，提示這部分單抗所識(shí)別的表位可能在PD-L1蛋白中是種屬間保守的，這些交叉反應(yīng)性抗體的存在，為進(jìn)一步利用小鼠動(dòng)物模型評(píng)估Anti-PD-L1單抗的治療作用奠定基礎(chǔ)。

Ab5和Ab6在PBMC體外刺激培養(yǎng)系統(tǒng)中可促進(jìn)慢乙肝病人的T細(xì)胞功能，在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中具有顯著的抗病毒效果，具備一定的治療應(yīng)用潛力。目前的慢性HBV感染治療藥物，如干擾素和核苷類似物，能對(duì)HBV相關(guān)疾病的發(fā)展起一定的控制作用，但它們并不能完全清除病毒感染?？筆D-1/PD-L1類免疫調(diào)節(jié)單抗的治療原理，與上述兩類藥物完全不同，并可能存在互補(bǔ)性，本研究獲得的Ab5和Ab6可能為慢乙肝藥物的研發(fā)提供新的候選分子。

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[收稿2016-03-07]

(編輯倪鵬)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.016

作者簡介：吳勇(1989年-)，男，在讀碩士，主要從事乙肝基因型方面研究，E-mail:uncleyong@163.com。 通訊作者及指導(dǎo)教師：袁權(quán)(1982年-)，男，博士，副教授，主要從事乙型肝炎病毒感染機(jī)制方面研究，E-mail:yuanquan@xmu.edu.cn。

中圖分類號(hào)R392

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)07-1004-06

Development of monoclonal antibodies against PD-L1 and preliminary investigation on potential application in treatment of chronic hepatitis B virus infection

WU Yong,ZHANG Tian-Ying,SONG Liu-Wei,XIA Ning-Shao,YUAN Quan.

State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics,School of Public Health,National Institute of Diagnostics and Vaccine Development of Infectious Diseases,Xiamen University,Xiamen 361102,China

[Abstract]Objective:To get specific monoclonal antibodies (mAbs) against PD-L1 which can block PD-1/PD-L1 binding,and explore the feasibility of its application on the treatment of chronic HBV infection preliminarily by in vitro and in vivo model.Methods: E.coli expression and series chromatography purification system were employed to get human and mouse PD-1/PD-L1 that had binding activity in vitro.By immunizing BALB/c mouse with purified recombination proteins of PD-L1,mAb hybridoma cell lines against PD-L1 were obtained.The reactivity with human/mice PD-L1 of individual antibody and the interaction blocking activity of the mAbs to PD-1/PD-L1 in vitro were examined by indirect chemiluminescence immune assay.Results: 8 cell lines against PD-L1 were obtained and 2 Anti-PDL1 mAbs (Ab5 & Ab6) performed strong immune activity to human/mice PD-L1 and blocking activity to PD-1/PD-L1.In the PBMC stimulation experiment of chronic HBV patient,Ab5 and Ab6 could promote the γ-IFN levels.With HBV infecting mice model,intravenous injections of these mAbs induced dramatically decrease of HBV DNA copies about 20 times,HBsAg levels in serum reduced to 30% of the baseline level.Conclusion: We obtained 2 PD-L1 mAbs with the reactivity to human/mice PD-L1 and blocking activity to PD-1/PD-L1.The 2 mAbs can promote T cell function in PBMC stimulation culture of chronic HBV patient,have significant antiviral effect in HBV transgenic mice and can be candidates for immunotherapy applications.

[Key words]PD-L1;Therapeutic monoclonal antibodies;HBV;Immunotherapy

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·

①本文為國家級(jí)科技重大專項(xiàng)(No.2013ZX10002002-001)。

②廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廈門361102。

③廈門萬泰凱瑞生物技術(shù)有限公司，廈門361000。