高效液相色譜法測定蔗糖-6-乙酯的研究

陳虹

【摘 ?要】蔗糖-6-乙酯是制備三氯蔗糖的關(guān)鍵中間體，建立一種準確、快速的分析方法測定蔗糖-6-乙酯是這種甜味劑生產(chǎn)質(zhì)控關(guān)鍵。采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法（HPLC-ELSD）檢測蔗糖-6-乙酯，使用ZORBAXSB-Aq色譜柱，以甲醇/水（5：90，v/v）為流動相，流速為0.8mL/min，蒸發(fā)光漂移管溫度為85℃，氮氣流速為1.5L/min。對外標法檢測蔗糖-6-乙酯進行了方法學(xué)驗證。兩種方法的線性范圍均為1.10～11.03mg/mL，線性相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，其中外標法的RSD值均小于3.0%。這種方法能檢測蔗糖-6-乙酯。本研究建立的方法可用于蔗糖-6-乙酯的含量檢測，并為蔗糖酯的檢測分析提供了參考。

【關(guān)鍵詞】高效液相色譜法;測定蔗糖-6-乙酯;分析研究

[中圖分類號]F66 ? ? ? ? ? ? ?[文獻標識碼]A

1材料與方法

1.1儀器與試劑

固定化疏棉狀噬熱絲孢菌脂肪酶（TLIM酶），250IUN/g，諾維信生物技術(shù)有限公司;蔗糖八乙酸酯，分析純，純度為98%，阿拉丁試劑有限公司;蔗糖-6-乙酯為實驗室自制，純度>95%;甲醇、乙腈為色譜純，Sigma;蔗糖、乙酸乙烯酯、叔戊醇、二甲基亞砜均為化學(xué)純。Agilent1200高效液相色譜儀，美國Agilent公司;Alltech3300蒸發(fā)光散射檢測器，美國Grace公司;HH-4水浴恒溫震蕩器，金壇市江南儀器廠。

1.2試驗方法

1.2.1樣品的制備

稱取10.3g蔗糖（0.3mol/L）、25.8g（3mol/L）乙酸乙烯酯、4gTLIM酶、1g4A分子篩于250mL具塞三角瓶中，再加入叔戊醇：二甲基亞砜（83：17）的溶劑，置于恒溫搖床中，30℃、180r/min的條件下反應(yīng)16h。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液在3500r/min的條件下離心10min，取上清液，進液相分析，每組3個平行。

1.2.2高效液相色譜條件的選擇

高效液相色譜法是一種較為普遍的分析方法，其分離度好、檢測靈敏度高、方便快捷，通常與紫外檢測器或示差折光檢測聯(lián)用。由于蔗糖與蔗糖酯不含發(fā)色團，因此用紫外檢測器無法檢測分離;示差折光檢測器雖然對糖類的檢測較為靈敏，但其容易受溫度與流動相的影響，并且不適用于梯度洗脫。蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）是近年來使用廣泛的通用型檢測器，其能檢測不含發(fā)色團的化合物，適用于梯度洗脫，并且成本低、操作簡單、不受溫度影響。有文獻報道糖類更適合用ELSD進行檢測，其靈敏度高于示差折光檢測器。通過先前試驗室的研究基礎(chǔ)得知，蔗糖-6-乙酯的檢測采用ELSD，并以水作流動相，可以在20min內(nèi)將產(chǎn)物和試劑洗脫。

2結(jié)果

2.1.1色譜柱的選擇

選定HPLC條件為：檢測器：ELSD;流動相：甲醇/水（10：90，v/v）;流速：0.8mL/min;柱溫：30℃;進樣量：5?L。蒸發(fā)光檢測器溫度：85℃;氮氣流速：1.5L/min。分別考察ZORBAXSB-Aq（4.6mm×250mm，5?m）、ZORBAXSB-C18（4.6mm×250mm，5?m）、EclipseXDB-C18（4.6×250mm，5?m）、Extend-C18（4.6mm×250mm，5?m）對分離效果的影響。采用ZORBAXSB-C18、EclipseXDB-C18、Extend-C18柱的色譜圖中蔗糖多酯峰形矮胖、分離效果不好，而ZORBAXSB-Aq柱不僅對蔗糖、蔗糖-6-乙酯和蔗糖多酯的分離效果都較好，并且保留時間較短，因此選擇ZORBAXSB-Aq進行后續(xù)試驗。

2.1.2流動相的選擇

選定HPLC條件為：檢測器：ELSD;色譜柱：ZORBAXSB-Aq（4.6×250mm，5?m）;流速：0.8mL/min;柱溫：30℃;進樣量：5?L。蒸發(fā)光檢測器溫度：85℃;氮氣流速：1.5L/min。對超純水、甲醇/水（5：95，v/v）、甲醇/水（10：90，v/v）、甲醇/水（15：85，v/v）、甲醇/水（20：80，v/v）、甲醇/水（30：70，v/v）六種流動相系統(tǒng)進行考察。隨著流動相極性減小，保留時間變短，但各組分距離變近，分離度變小，分離效果不好。但考慮超純水保留時間較長，最后選擇甲醇/水（5：95）為流動相，來進行后續(xù)試驗。

2.1.3柱溫的選擇

在2.1.2的試驗條件下，分別考察柱溫為：20、25、30、35、40℃時對分離效果的影響。隨著溫度的升高，蔗糖保留時間不變，蔗糖-6-乙酯保留時間變短，蔗糖多酯保留時間變長，同時蔗糖多酯的峰在30℃時分離效果較好，因此綜合考慮最終選擇柱溫為30℃，進行后續(xù)試驗。

2.1.4色譜條件的確定

蔗糖保留時間為3.732min，蔗糖-6-乙酯保留時間為7.143min，蔗糖多酯保留時間為17.272min。

2.2外標法

將不同濃度樣品溶液進行HPLC分析，由于蒸發(fā)光散射檢測器響應(yīng)值與濃度關(guān)系較為復(fù)雜，查閱相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)糖類或糖酯類的ELSD分析采用的線性關(guān)系主要有兩種：濃度與峰面積直接作線性回歸、濃度的對數(shù)與峰面積的對數(shù)作線性回歸。于是對兩種線性關(guān)系進行了比較，結(jié)果如圖1所示。

結(jié)果表明將濃度與峰面積直接進行線性回歸關(guān)系更加良好。上圖表明，在1.10～11.03mg/mL的范圍內(nèi)，蔗糖-6-乙酯濃度與其峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為A=2427.8C-3355.4，相關(guān)系數(shù)為R2=0.994。

3討論

本文對蔗糖-6-乙酯的檢測分析方法進行了條件優(yōu)化，建立了能夠快速準確測定蔗糖-6-乙酯的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測方法（HPLC-ELSD）。首次對檢測蔗糖-6-乙酯所建立的分析方法進行了方法學(xué)驗證，得到較好的結(jié)果。同時通過HPLC-ELSD進行外標法檢測，結(jié)果表明這種方法各項指標都能滿足試驗室要求。外標法無需前處理，可以通過標準曲線直接計算含量，更簡便快速;因此可以根據(jù)試驗室條件與需求對進行選擇。與現(xiàn)有的檢測蔗糖-6-乙酯的分析方法相比，本文所建立的分析方法穩(wěn)定、快捷、方便、準確，并且所做的方法學(xué)驗證確保了該分析方法的可靠性，為蔗糖酯的檢測分析提供了參考。

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（作者單位：浙江京新藥業(yè)股份有限公司）