楓香根中水晶蘭苷定性定量分析方法研究

黃琳蕓 黃瑞松 陸崢琳

摘要：目的 建立楓香根中水晶蘭苷的定性定量分析方法。方法 采用薄層色譜法對(duì)楓香根中水晶蘭苷進(jìn)行定性鑒別。采用HPLC測(cè)定樣品中水晶蘭苷含量，色譜柱為依利特SinoChrom ODS-BP柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液（1∶99），檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 ?L。結(jié)果 薄層色譜法可鑒別出水晶蘭苷。水晶蘭苷在0.150 1～1.501 0 ?g（r=0.999 8）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為95.93%（RSD=0.60%）。10個(gè)不同產(chǎn)地楓香根中水晶蘭苷含量在0.20%～1.15%之間。結(jié)論 該方法操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好，可作為楓香根藥材質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞：楓香根；水晶蘭苷；薄層色譜法；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.020

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）09-0083-03

Abstract： Objective To establish qualitative and quantitative methods for analyzing monotropein in Liquidambaris Radix. Methods Monotropein in Liquidambaris Radix was identified by using TLC. The contents of monotropein in the samples were determined by HPLC on an SinoChrom ODS-BP column （4.6 mm × 250 mm， 5 ?m） with methanol-0.1% phosphoric acid solution （1：99） as the mobile phase at the flow rate of 1.0 mL/min； the detection wavelength was 235 nm； the column temperature was 25 ℃； the injection volume was 10 ?L. Results Monotropein in Liquidambaris Radix could be identified by TLC. Monotropein showed good linear relation in the range of 0.150 1– 1.501 0 μg （r=0.999 8）， and the average recovery rate was 95.93% （RSD=0.60%）. The contents of monotropein in Liquidambaris Radix from 10 different producing areas were among the range of 0.20%–1.15%. Conclusion The method is simple， stable， reliable and reproducible， which can be used for the quality control of Liquidambaris Radix.

Keywords： Liquidambaris Radix； monotropein； TLC； HPLC

楓香根為金縷梅科植物楓香樹(shù)Liquidambar formosana Hance的干燥根，又名楓果根、杜東根[1]，為廣西壯族和瑤族常用藥材。壯醫(yī)認(rèn)為其具有調(diào)龍路、火路，利谷道，祛風(fēng)毒，除濕毒的功效，可用于治療發(fā)旺（痹病）、唄農(nóng)（癰腫）、唄叮（疔）等[2]；瑤醫(yī)認(rèn)為其具有祛風(fēng)除濕、活血散瘀、消腫止痛、解毒、行氣、止癢功效，可用于治療風(fēng)濕痹痛、腰肌勞損、手足無(wú)力、產(chǎn)后風(fēng)癱、跌打損傷、腸炎、痢疾、癰瘡腫毒、乳腺炎等[3]。楓香樹(shù)主要分布于我國(guó)秦嶺及淮河以南各省，廣西各地均有分布。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，楓香樹(shù)主要含有萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、揮發(fā)油、鞣質(zhì)類(lèi)等化學(xué)成分[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，楓香樹(shù)具有抑菌、止血、保肝、抗血栓等作用[5-7]，其中環(huán)烯醚萜苷成分水晶蘭苷具有明顯抗炎、鎮(zhèn)痛作用[8-9]，為楓香樹(shù)的主要藥效物質(zhì)。

有關(guān)楓香樹(shù)的藥用，2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》收載其樹(shù)脂及成熟果序，藥材名分別為“楓香脂”和“路路通”。楓香根在國(guó)家藥典和廣西地方標(biāo)準(zhǔn)均未見(jiàn)收載，使該藥材的質(zhì)量控制無(wú)標(biāo)準(zhǔn)可依，給臨床用藥和生產(chǎn)、流通帶來(lái)諸多問(wèn)題。為此，本研究采用薄層色譜法和HPLC對(duì)不同產(chǎn)地楓香根中的水晶蘭苷進(jìn)行定性定量分析，為楓香根藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津），UV-2401PC紫外光譜儀（日本島津公司），XS205 DualRange電子分析天平（瑞士梅特勒公司），KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），Master-S15純水器（上海和泰公司）。

楓香根藥材采集于廣西10個(gè)不同地區(qū)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院黃云峰副研究員鑒定為金縷梅科植物楓香樹(shù)Liquidambar formosana Hance的干燥根。水晶蘭苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111870-201303，供含量測(cè)定用），甲醇（Fisher公司，色譜純），磷酸（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，色譜純），水（純化水），其余試劑均為分析純。硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠，批號(hào)20131118）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

取本品粉末1 g，加80%乙醇20 mL，超聲處理30 min，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取水晶蘭苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（2015年版《中華人民共國(guó)藥典》四部0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液3～4 ?L、對(duì)照品溶液2 ?L，分布點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-醋酸-水（7∶1∶3）的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置可見(jiàn)光下檢視。結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的灰藍(lán)色斑點(diǎn)。經(jīng)多批樣品試驗(yàn)，薄層色譜斑點(diǎn)清晰，重現(xiàn)性好，可以作為楓香根藥材的定性鑒別方法。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取水晶蘭苷對(duì)照品7.88 mg，置于50 mL棕色量瓶中，用水溶解并稀釋到刻度，搖勻，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

稱取楓香根粉末（過(guò)4號(hào)篩）0.2 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入水20 mL，稱定質(zhì)量，在60 ℃水浴中提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 ?m微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液，備用。

2.2.3 色譜條件

色譜柱：依利特SinoChrom ODS-BP（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（1∶99）；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 ?L[10]。樣品中水晶蘭苷與其他成分分離度>1.5，按水晶蘭苷峰計(jì)算理論塔板數(shù)大于5000。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取水晶蘭苷對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于5 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，得系列濃度對(duì)照品溶液。分別精密吸取10 ?L，按上述色譜條件注入色譜儀，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量（?g）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸計(jì)算，得回歸方程Y=1300.5X+7.226 6，r=0.999 8，水晶蘭苷在0.150 1～1.501 0 ?g范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定水晶蘭苷的峰面積并計(jì)算，結(jié)果RSD=0.56%，表明方法精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液10 ?L，分別于制備后0、2、4、8、10、14、24 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算水晶蘭苷峰面積的RSD=0.57%，結(jié)果表明供試品溶液中水晶蘭苷在室溫條件下24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批楓香根樣品粉末（過(guò)4號(hào)篩）6份，按上述供試品溶液制備方法，制得6份供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定峰面積并計(jì)算，結(jié)果測(cè)得水晶蘭苷平均含量為0.82%，RSD=0.52%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知水晶蘭苷含量的楓香根藥材粉末6份，每份約0.1 g，精密稱定，分別精密加入水晶蘭苷對(duì)照品溶液（0.043 8 mg/mL）20 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.9 樣品含量測(cè)定

取10個(gè)不同產(chǎn)地楓香根藥材粉末各2份，每份0.2 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按上述色譜條件測(cè)定水晶蘭苷含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

水晶蘭苷易溶于乙醇、甲醇、含水醇溶液和水，本研究分別考察了以甲醇和水作為溶劑的提取效率，對(duì)比水浴加熱提取、超聲提取2種提取方法，確定以水為提取溶劑，提取方法為水浴加熱提取。在此基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計(jì)方法，對(duì)藥材破碎度（過(guò)2、3、4號(hào)篩）、提取時(shí)間（30、45、60 min）、提取溫度（60、80、100 ℃）進(jìn)行三因素三水平考察，最終確定供試品溶液的制備方法為：藥材粉末過(guò)4號(hào)篩，在60 ℃水浴中提取30 min。

本研究在系統(tǒng)性試驗(yàn)過(guò)程中，經(jīng)過(guò)多次選擇條件，最后采用流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液（1∶99），流速1.0 mL/min，可達(dá)到較好的分離效果，雜質(zhì)干擾少，靈敏度高，且峰形對(duì)稱，保留時(shí)間適中。在HPLC耐用性考察中，考察了同類(lèi)型不同廠牌色譜柱對(duì)供試樣品的分離情況，結(jié)果表明，Phenomenex Luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）及Sapphire C18柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）色譜柱的測(cè)定結(jié)果均較好。與此同時(shí)，對(duì)柱溫（25、30、35 ℃）和流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，柱溫對(duì)分離度影響不大，流速1.0 mL/min對(duì)對(duì)照品和供試品溶液的分離效果最好。

目前，對(duì)楓香樹(shù)的研究多集中在葉、成熟果序、樹(shù)脂上，對(duì)根的研究甚少，為保證楓香根藥材臨床用藥安全有效，本研究以水晶蘭苷為指標(biāo)成分建立楓香根的定性定量分析檢測(cè)方法，該方法操作簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可為該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供可靠依據(jù)。

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（收稿日期：2018-01-03）

（修回日期：2018-02-02；編輯：陳靜）