3例16p11.2微缺失綜合征胎兒的產(chǎn)前診斷及其產(chǎn)前超聲分析*

（湖北省婦幼保健院 優(yōu)生遺傳科，湖北 武漢 430070）

16p11.2 微缺失綜合征是因?yàn)?6號(hào)染色體p11.2存在復(fù)發(fā)性雜合缺失區(qū)域而引起的一類綜合征。16p11.2微缺失綜合征于2008年由KUMAR等在自閉癥譜系障礙病因的研究中首次提出[1]。國(guó)外流行病學(xué)研究其人群發(fā)病率為0.3‰[2]?；颊叩闹饕R床癥狀包括：發(fā)育遲緩、智力障礙和/或自閉癥譜系障礙?；颊叩闹巧掏ǔＴ谳p度智力障礙到正常之間，但智力正常的也往往有其他發(fā)育問題，如語(yǔ)言發(fā)育遲緩或者自閉癥譜系障礙[3]。大部分患者還有發(fā)生超重和肥胖的風(fēng)險(xiǎn)[4]。20%患者有癲癇發(fā)作，2歲之前常出現(xiàn)巨頭畸形。16p11.2微缺失綜合征的各種出生缺陷均略微增加，但以椎體畸形最為常見。

16p11.2 微缺失綜合征可以由拷貝數(shù)變異的方法如染色體微陣列（chromosomal microarray analysis,CMA）或目標(biāo)缺失分析方法如熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization,FISH）技術(shù)檢出。單核苷酸多態(tài)性微陣列（single nucleotide polymorphism array,SNP array）技術(shù)能夠檢出 ＞50 kb 的 CNVs，能準(zhǔn)確地檢測(cè)出16p11.2微缺失綜合征。目前，16p11.2微缺失綜合征的產(chǎn)前診斷報(bào)道較少，本研究通過對(duì)3例16p11.2微缺失綜合征胎兒的產(chǎn)前遺傳學(xué)分析，結(jié)合其超聲異常特點(diǎn)，探討其基因型與表型的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

病例1，漢族，G4P1，孕23周因胎兒超聲提示胸腰段脊柱側(cè)彎，L12～S1呈半椎體畸形，單臍動(dòng)脈（右側(cè)缺如），右心室強(qiáng)光斑，經(jīng)孕婦知情同意后于孕24周行羊水穿刺術(shù)。病例2，漢族，G3P1，孕24周因胎兒超聲提示胎兒脊柱側(cè)彎（L11～12，S1椎體向右側(cè)側(cè)彎），椎體排列不整齊（半椎體），羊水指數(shù)位于正常值上限，經(jīng)孕婦知情同意后于孕25周行羊水穿刺術(shù)。病例3，漢族，G1P0，孕13周因胎兒超聲提示NT 4.8 mm，胎兒鼻骨顯示不清，經(jīng)孕婦知情同意后于孕18周行羊水刺術(shù)。病例4，漢族，G3P1，胎兒系統(tǒng)超聲檢測(cè)未見異常，孕19周因高齡（41歲）經(jīng)孕婦知情同意后行羊水穿刺術(shù)，為正常對(duì)照組。4個(gè)病例所抽取的羊水均行常規(guī)G顯帶染色體核型分析和SNP array檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)羊水染色體核型分析孕婦在超聲連續(xù)引導(dǎo)定位下行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取胎兒羊水28 ml，無(wú)菌操作下分別進(jìn)行體外培養(yǎng)。培養(yǎng)好的羊水細(xì)胞經(jīng)收獲、固定、核型制備和G顯帶。染色體異常的描述依據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制2016版》。

1.2.2 全基因組DNA 提取 使用 QIAamp ? DNA Mini Kit（250）試劑盒抽提取羊水的全基因組DNA，提取的DNA置于-20℃冰箱冷凍儲(chǔ)存?zhèn)溆?。芯片?shí)驗(yàn)前使用Nanodrop one分光光度計(jì)定量，標(biāo)準(zhǔn)化并稀釋樣本濃度至 50 ng/μl。

1.2.3 SNParray 檢測(cè)缺失基因 采用 Cyto Scan 750K芯片（包括55萬(wàn)個(gè)拷貝數(shù)探針和20萬(wàn)個(gè)SNP探針）進(jìn)行檢測(cè)。芯片檢測(cè)所需DNA總量為250 ng。采用Affymetrix公司配套檢測(cè)試劑盒及優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，進(jìn)行酶切、連接、PCR、PCR產(chǎn)物純化、片段化、標(biāo)記、雜交、洗染、掃描等幾個(gè)步驟。整個(gè)過程嚴(yán)格按照質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。用 Affymetrix Chromosome Analysis Suite Software進(jìn)行分析。利用國(guó)際基因組變異數(shù)據(jù)庫(kù)DGV（http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home）剔除常見的多態(tài)性CNV，其余CNV與CNVs數(shù)據(jù)庫(kù)DECIPHER（https://decipher.sanger.ac.uk/patient/）、OMIM（https://omim.org）、ISCA（https://www.iscaconsortium.org/）比對(duì)分析，在 PubMed數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）上檢索相同或相似區(qū)段的CNV研究的文獻(xiàn)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitativerealtime polymerase chain reaction,qRT-PCR） 根據(jù) 3個(gè)16p11.2微缺失病例DNA缺失區(qū)域，選擇共有缺失序列區(qū)域?yàn)閿U(kuò)增子，設(shè)計(jì)正反向引物，選擇ALB基因?yàn)閮?nèi)參，作為靶標(biāo)拷貝數(shù)相對(duì)定量的依據(jù)；所有引物設(shè)計(jì)及序列特異性比對(duì)均使用Primer 5.0 and National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool software（blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。該驗(yàn)證靶標(biāo)及內(nèi)參引物序列見表1，擴(kuò)增體系使用 ABI SYBR Green PCR Master Mix，樣本均使用TE稀釋成5 ng/μl，加樣時(shí)取2 μl作模板；使用ABI 7500 熒光定量 PCR 儀，選擇 SYBR Green Reagent模式。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min及熱啟動(dòng)酶激活，95℃變性 15 s、60℃退火 40 s，45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品檢測(cè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

表1 16p11.2（hg19）微缺失區(qū)域?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè)所用引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用 Microsoft Office Excel 2010 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)算相對(duì)值、均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 G顯帶核型分析結(jié)果

病例1和病例2胎兒羊水染色體核型為46，XX，病例3和病例4胎兒羊水染色體核型為46，XY。見圖1。

2.2 SNP array分析結(jié)果

病例 1 的 SNP array結(jié)果為 arr [hg19]16p11.2（29，428，531 ～ 30，350，748）X1，即 16p11.2 存在 922 kb的缺失。病例2的SNP array結(jié)果為arr[hg19]16p11.2（29，591，326～30，176，508）X1，即16p11.2存在585 kb 的缺失。病例 3 的 SNP array結(jié)果為 arr[hg19]16p11.2（29，428，531～30，176，508）X1，即16p 11.2存在748 kb的缺失（見圖2）。3個(gè)病例均未檢測(cè)到其他基因組位點(diǎn)的致病性或可疑致病性變異。病例4的SNP array結(jié)果未檢測(cè)到致病性或可疑致病性變異。

2.3 qRT-PCR結(jié)果

病例1～3在16p11.2（hg19）相對(duì)拷貝數(shù)幾乎均是病例4的50%，病例1～3胎兒羊水細(xì)胞存在16p11.2雜合缺失，而病例4不存在缺失。見表2。

2.4 妊娠結(jié)局

病例1、病例2和病例3分別于孕27周、孕28周和孕21周行引產(chǎn)術(shù)，但均未同意進(jìn)行引產(chǎn)后的病理解剖。病例4于孕38+2周剖宮產(chǎn)健康男嬰1例。

圖1 胎兒羊水染色體核型

圖2 3例SNP array結(jié)果

表2 qRT-PCR數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3 討論

16p11.2 微缺失綜合征根據(jù)缺失區(qū)域主要分為2類：①典型16p11.2缺失綜合征（OMIM：611913），為 16 號(hào)染色體 29.5～ 30.1 Mb 區(qū)域上 500 ～ 600 kb的缺失，是最常見的類型。該區(qū)域覆蓋有：PRRT2、KCTD13、TBX6、HIRIP3、SEZ6L2等29個(gè)基因。②非典型16p11.2缺失（OMIM：613444），為16p11.2末端28.73～28.95 Mb區(qū)域上200～220 kb的缺失，這類型缺失較少見。此區(qū)域包含SH2B1、CD19、SPNS1等9個(gè)基因[5]。兩種類型16p11.2微缺失綜合征因?yàn)槿笔^(qū)域的基因不同，臨床癥狀也不同，本文主要討論典型16p11.2缺失綜合征。

16p11.2 微缺失綜合征的發(fā)生是因?yàn)樵?6p11.2區(qū)域兩端有低拷貝重復(fù)序列（low copy repeats,LCRs），它位于微缺失區(qū)域兩端，長(zhǎng)約147 kb片段（147A和147B），它們之間有99.5%序列同源[6]。2段低拷貝重復(fù)序列造成基因組的不穩(wěn)定性，使得在細(xì)胞減數(shù)分裂過程中易引起同源染色體上非等位基因的重組（nonallelic homologous recombination,NAHR），從而導(dǎo)致微缺失和微重復(fù)的產(chǎn)生。

16p11.2 微缺失內(nèi)部包含25個(gè)注釋基因或轉(zhuǎn)錄子，同時(shí)在低拷貝重復(fù)序列中還包含4個(gè)額外的基因，其中包含幾個(gè)重要的功能基因如PRRT2、KCTD13、TBX6、HIRIP3、SEZ6L2等。目前，這些基因的缺失是如何導(dǎo)致患者表型的機(jī)制尚不明確，但是最近的一些研究逐步揭示該關(guān)鍵基因的作用以及它們引起表型的功能通路。PRRT2基因可能是引起16p11.2微缺失綜合征患者癲癇或嬰兒性驚厥的關(guān)鍵基因。PRRT2基因雜合功能丟失型致病變異可以導(dǎo)致發(fā)作性運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)性運(yùn)動(dòng)障礙及引起良性家族性嬰兒性癲癇與舞蹈手足徐動(dòng)綜合征[7]。KCTD13基因是斑馬魚和小鼠神經(jīng)元增殖的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子，也是引起16p11.2微缺失綜合征巨頭畸形的主要驅(qū)動(dòng)因子，缺失區(qū)域內(nèi)的MAPK3和MVP基因可能作為修飾基因增強(qiáng)KCTD13基因的表達(dá)[8]。HIRIP3基因產(chǎn)物和HIRA結(jié)合形成HIRA-HIRIP3復(fù)合物，在染色質(zhì)和組蛋白代謝中發(fā)揮重要的功能，16p11.2缺失后可能因?yàn)镠IRIP3基因單倍劑量不足，從而導(dǎo)致主動(dòng)脈瓣畸形的發(fā)生[9]。SEZL6L2基因的單倍劑量不足可能是導(dǎo)致16p11.2微缺失綜合征語(yǔ)言遲緩、認(rèn)知障礙和自閉癥的重要因素。與SEZL6L2基因同源的SEZ6基因缺陷性小鼠顯示出空間記憶受損、運(yùn)動(dòng)障礙和焦慮程度降低。SEZ6L2基因不僅在人類大腦中有高表達(dá)，且與導(dǎo)致癲癇和言語(yǔ)障礙的SRPX2基因高度同源[10]。TXB6基因是引起16p11.2微缺失綜合征患者椎體畸形的關(guān)鍵基因[11]。TBX6基因編碼一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，它在小鼠的體節(jié)發(fā)生中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[12]。POURQUIE等[13]研究發(fā)現(xiàn)TXB6基因敲除小鼠出現(xiàn)與人類相同的脊椎肋骨發(fā)育不全和先天性脊柱側(cè)彎等表型。SPARROW等[14]證明TXB6基因突變后影響TBX6蛋白的轉(zhuǎn)錄活性從而導(dǎo)致脊椎肋骨發(fā)育不全，并發(fā)現(xiàn)攜帶1個(gè)TBX6無(wú)功能等位基因的小鼠胚胎，46%有輕度的頸椎缺陷，30%存在骶骨缺損。FEI等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)漢族人群中TBX6基因上的2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)：rs2289292和rs3809624，這2個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性在先天性脊柱側(cè)彎的發(fā)病機(jī)制中起重要的作用。WU等[16]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在中國(guó)漢族人群中TBX6基因以一種特殊的作用形式：無(wú)功能等位基因（包括16p11.2微缺失綜合征中TBX6基因的缺失）合并另一個(gè)常見的亞效等位基因單體型T-C-A（3個(gè)常見的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)：rs2289292、rs3809624、rs3809627）而導(dǎo)致半椎體和脊柱側(cè)彎。

16p11.2 微缺失綜合征患者有明顯表型異質(zhì)性和不同的外顯率。ROSENFELD等報(bào)道16p11.2微缺失綜合征（TBX6）的外顯率46.8%（31.5%～64.2%），這可能與TBX6基因的特殊致病方式（1個(gè)無(wú)功能等位基因合并另一個(gè)常見的亞效等位基因單體型T-C-A）相關(guān)[16-17]。在千人數(shù)據(jù)庫(kù)中，TBX6基因T-C-A單體型在中國(guó)漢族人群中占44%，因此，理論上在中國(guó)漢族人群中16p11.2微缺失綜合征（TBX6）的外顯率應(yīng)為44%。而且TBX6基因雜合性缺失的表型在不同種族中也不盡相同，在中國(guó)漢族人群主要導(dǎo)致半椎體畸形、脊柱側(cè)彎[16，18]。

目前，16p11.2微缺失綜合征的產(chǎn)前診斷報(bào)道較少，僅有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道其超聲異常征象有心臟畸形、單側(cè)多囊腎、鼻骨缺失、單臍動(dòng)脈、宮內(nèi)發(fā)育遲緩等[19-20]。16p11.2微缺失綜合征的其他表型如發(fā)育遲緩、智力障礙和/或自閉癥譜系障礙、肥胖等表型具有年齡依賴性，無(wú)法在宮內(nèi)診斷，而半椎體畸形、脊柱側(cè)彎在中國(guó)漢族人群中外顯率較高，可以依靠產(chǎn)前超聲進(jìn)行診斷。筆者所報(bào)告2例的病例均表現(xiàn)為半椎體畸形、脊柱側(cè)彎。病例1超聲提示胎兒胸腰段脊柱側(cè)彎，L12～S1呈半椎體畸形，單臍動(dòng)脈（右側(cè)缺如），右心室強(qiáng)光斑。病例2超聲提示胎兒脊柱側(cè)彎（L11～12，S1椎體向右側(cè)側(cè)彎），椎體排列不整齊（半椎體），羊水指數(shù)位于正常值上限。而病例3超聲僅提示胎兒頸部半透明膜4.8 mm，鼻骨顯示不清。一方面可能是由于16p11.2微缺失綜合征存在外顯率與表現(xiàn)度的差異；另一方面也可能是由于患者后續(xù)未行胎兒系統(tǒng)彩超進(jìn)一步監(jiān)測(cè)病情的進(jìn)展。在本研究中，筆者采用全基因組SNP array技術(shù)對(duì)3個(gè)病例進(jìn)行分析，不僅在分子水平準(zhǔn)確地檢出胎兒16p11.2微缺失綜合征，而且排除其他基因組位點(diǎn)的異常。

綜上所述，16p11.2 微缺失綜合征在產(chǎn)前可出現(xiàn)各個(gè)系統(tǒng)超聲異常，但椎體畸形最為常見。中國(guó)漢族人群產(chǎn)前超聲中如果出現(xiàn)胎兒半椎體畸形、脊柱側(cè)彎，應(yīng)考慮16p11.2微缺失綜合征的可能。SNP array分析可以有效地診斷16p11.2微缺失綜合征，明確其斷裂點(diǎn)以及所涉及的基因，有助于分析其基因型與表型的對(duì)應(yīng)關(guān)系。