基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討牛膝治療骨質(zhì)疏松的潛在有效成分及作用機制

趙杰 許波 劉金豹 梁學振 張凱博 陳帥 劉雨晴 李剛

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）22-3090-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.22.13

摘 要 目的：探討牛膝治療骨質(zhì)疏松（OP）的潛在有效成分及作用機制。方法：利用中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺數(shù)據(jù)庫（TCMSP）篩選牛膝的有效成分，并收集其對應的作用靶點;使用疾病基因綜合數(shù)據(jù)庫（DisGeNET）檢索與OP相關(guān)的靶點;使用TBtools 1.0繪圖軟件繪制韋恩圖，篩選牛膝有效成分與疾病OP的交集靶點;采用Cytoscape 3.6.1軟件和STRING數(shù)據(jù)庫進行“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析，通過DAVID生物信息學資源數(shù)據(jù)庫進行KEGG通路富集分析。結(jié)果：共篩選出牛膝有效成分19個，有效成分與疾病OP的交集靶點有32個。“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)中，含節(jié)點45個[牛膝、OP節(jié)點各1個，有效成分11個（19個有效成分中有8個無對應的OP靶點），交集靶點32個]、邊119條，其中槲皮素、山柰酚、漢黃岑素、黃芩苷、大黃藤素等為該網(wǎng)絡(luò)中較為重要的有效成分。PPI網(wǎng)絡(luò)中，含節(jié)點31個（32個交集靶點中有1個與其余蛋白不關(guān)聯(lián)）、邊212條，其中白細胞介素6（IL6）、雌激素受體1、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、IL8、MAPK14等為該網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點。KEGG富集通路共67條，涉及類風濕性關(guān)節(jié)炎、乙型肝炎、Toll樣受體信號通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路、Janus激酶/信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子信號通路、核因子κB信號通路等。結(jié)論：牛膝中治療OP的潛在有效成分主要包括槲皮素、山柰酚、漢黃岑素、黃芩苷等，其作用機制可能與參與細胞分化和凋亡、代謝、炎癥反應等途徑有關(guān)，具有多成分、多靶點、多系統(tǒng)的特點。

關(guān)鍵詞 牛膝;骨質(zhì)疏松;網(wǎng)絡(luò)藥理學;有效成分;作用機制

Study on Potential Effective Components and Mechanism of Achyranthes bidentata in the Treatment of Osteoporosis Based on Network Pharmacology

ZHAO Jie1，XU Bo1，LIU Jinbao1，LIANG Xuezhen1，ZHANG Kaibo1，CHEN Shuai2，LIU Yuqing1，LI Gang1（1. First Clinical Medical College， Shandong University of TCM， Jinan 250014， China; 2. College of TCM， Shandong University of TCM， Jinan 250014， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To investigate the potential effective components and mechanism of Achyranthes bidentata in the treatment of osteoporosis （OP）. METHODS： The effective components of A. bidentata were retrieved from the TCMSP database， and corresponding targets of them were collected. The targets related to OP were retrieved from DisGeNET database. TBtools 1.0 mapping software was used to draw the Wayne diagram， and screen the intersecting targets of effective components of A. bidentata and disease OP. Cytoscape 3.6.1 software and STRING database were used to construct and analyze the “drug-component- disease-target” network and protein-protein interaction （PPI） network; KEGG pathway enrichment analysis was conducted by using DAVID bioinformatics resource database. RESULTS： A total of 19 effective components were screened from A. bidentata， and there were 32 intersecting targets between effective components and disease OP. In “drug-component-disease-target” network， there were 45 nodes [1 for A. bidentata， 1 for OP， 11 for effective components （8 of the 19 effective components had no corresponding OP target）， 32 for intersecting targets] and 119 edges between nodes; quercetin， kaempferol， wogonin， baicalein and palmatine were important effective components. In PPI network， there were 31 nodes （1 of 32 intersecting targets was not associated with other proteins） and 212 edges， among which IL6， ESR1， MAPK1， IL8 and MAPK14 were the core targets of the network. There were 67 KEGG enrichment pathways， including rheumatoid arthritis， hepatitis B， Toll-like receptor signaling pathway， PI3K/Akt signaling pathway， JAK/STAT signaling pathway， NF-κB signaling pathway and so on. CONCLUSIONS： The main potential effective components of A. bidentata in the treatment of OP are quercetin， kaempferol， wogonin， baicalein and palmatine， the mechanism of which may be associated with cell differentiation and apoptosis， metabolism， inflammation reaction， etc. It ? ? has multi-component， multi-target and multi-system chara- cteristics.

KEYWORDS ? Achyranthes bidentata; Osteoporosis; Net- work pharmacology; Effective components; Effect mecha- nism

骨質(zhì)疏松（Osteoporosis，OP）是以單位骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)發(fā)生退化為特征，骨內(nèi)有機質(zhì)和無機質(zhì)減少，致使骨的彈性降低、脆性增加，極易發(fā)生脆性骨折的一種全身性骨骼疾病。OP是繼心腦血管疾病、糖尿病、癌癥之后，在世界范圍內(nèi)引起學者廣泛關(guān)注的老年疾病[1]。OP早期一般無明顯癥狀，但隨著疾病的逐漸進展，患者可出現(xiàn)腰背痛、全身骨痛等癥狀體征，嚴重者甚至會出現(xiàn)脊柱變形、骨折等不可逆的并發(fā)癥[2]。OP在祖國醫(yī)學中屬于“骨痿”范疇，《素問》中記載“腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿”，中醫(yī)治療以補腎益精、活血祛瘀為基本原則[3]。

牛膝為莧科植物牛膝（Achyranthes bidentata Bl.）的干燥根，味苦、酸，性平，歸肝、腎經(jīng)，具有活血通經(jīng)、補肝腎、強筋骨、利尿通淋、引火（血）下行等功效，可用于治療經(jīng)閉、痛經(jīng)、腰膝酸痛、筋骨無力、淋證、水腫、頭痛、眩暈等癥[4]。相關(guān)研究表明，牛膝提取物中含有皂苷成分，能有效抑制維甲酸致OP模型大鼠的骨吸收[5];同時，牛膝醇提取物可促進去卵巢大鼠骨細胞的表達，促進Ⅰ型膠原蛋白生成和骨細胞形成，從而發(fā)揮預防OP的作用[6]。由此可見，牛膝具有一定的抗OP藥理基礎(chǔ)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是一種藥物設(shè)計的新方法，涉及生物信息學、多向藥理學、計算機科學等多學科的技術(shù)和知識，可多方位地闡釋藥物治療疾病的潛在作用機制，能體現(xiàn)藥物作用的整體性和系統(tǒng)性[7]。鑒于此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，從網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中篩選牛膝的有效成分，將有效成分的靶點與OP的疾病靶點進行匹配，篩選出藥物作用的交集靶點;對上述交集靶點進行生物信息學分析，并在此基礎(chǔ)上分別構(gòu)建了“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，以期為臨床使用牛膝治療OP提供依據(jù)，為臨床用藥提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 牛膝有效成分的篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺數(shù)據(jù)庫（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索牛膝中所含有效成分[8]。根據(jù)藥動學原理，以藥物口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18（其中，OB是客觀評價藥物分子口服生物利用度的重要指標，DL則是用以評價藥物分子成藥性高低的指標）[9]為標準，篩選牛膝的有效成分。

1.2 牛膝作用靶點與OP疾病靶點的預測

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫中的成分靶點預測功能，收集牛膝有效成分的作用靶點。鑒于數(shù)據(jù)處理的便捷性與標準性，使用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），將靶點的“蛋白名”統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為“基因名（Gene name）”[10]。合并有效成分中重復的作用靶點，并刪除無對應基因名的靶點，以便后續(xù)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與通路分析。

以“OP”“Osteoporosis”等為關(guān)鍵詞，在疾病基因綜合數(shù)據(jù)庫（DisGeNET，http：//www.disgenet.org/）中組合檢索與OP相關(guān)的靶點（即疾病相關(guān)基因）[11]，檢索時限截至2019年2月26日。使用TBtools 1.0繪圖軟件將藥物靶點與疾病靶點（以對應蛋白表示）進行映射，并以韋恩圖的方式進行展示，初步獲得牛膝與疾病OP的交集靶點，即牛膝治療OP的潛在作用靶點。

1.3 “藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將“1.2”項下所得牛膝有效成分與OP疾病交集靶點的數(shù)據(jù)輸至Cytoscape 3.6.1軟件中，構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)。其中，節(jié)點代表中藥牛膝及其有效成分、疾病、靶點等;邊代表中藥牛膝與成分、成分與靶點、疾病與靶點之間的相互關(guān)系。使用該軟件的“Network analyzer”插件對上述網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點度值進行分析，其值越大，表示該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越重要[12]。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將“1.2”項下所得交集靶點的數(shù)據(jù)輸至STRING數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org）中，將物種定義為“人”，構(gòu)建牛膝治療OP的PPI網(wǎng)絡(luò)。將網(wǎng)絡(luò)節(jié)點與邊的信息輸入至Cytoscape 3.6.1軟件中，進行PPI網(wǎng)絡(luò)可視化展示。使用該軟件的“Network analyzer”插件對上述網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點度值進行分析，其值越大，表明該節(jié)點中在網(wǎng)絡(luò)中越重要[12]。將節(jié)點度值排序前10位（即前1/3）的節(jié)點定義為牛膝治療OP的關(guān)鍵靶點[13]，并使用Excel 2016軟件將分析結(jié)果以條形圖的形式進行展示。

1.5 KEGG通路的富集分析

以“1.4”項下PPI網(wǎng)絡(luò)中的所有靶點為對象，使用DAVID生物信息學資源數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進行KEGG通路富集分析[14]。將物種定義為“人”，設(shè)置P<0.05[15]。利用Omicshare云平臺（http：//omicshare.com/）的繪圖工具對富集基因數(shù)排序前28位的通路進行可視化展示。

2 結(jié)果

2.1 牛膝有效成分的篩選結(jié)果

TCMSP數(shù)據(jù)庫共收錄牛膝化學成分176種，其中OB≥30%的成分40種，DL≥0.18的成分79種，OB≥30%且DL≥0.18的有效成分共19種，包括大黃藤素、槲皮素、β-蛻皮甾酮、豆甾醇、表小檗堿等，詳見表1。

2.2 牛膝治療OP潛在作用靶點的預測結(jié)果

共收集到牛膝有效成分作用靶點183個，OP疾病靶點440個，藥物與疾病靶點的韋恩圖見圖1。由圖1可見，兩者交集靶點共32個，即為牛膝治療OP的潛在作用靶點。

2.3 “藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果

牛膝治療OP的“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)見圖2[圖中，“矩形”代表中藥牛膝，“菱形”代表OP，“三角形”代表牛膝的有效成分，“圓形”代表有效成分與疾病的交集靶點（以基因表示）]。由圖2可見，在該網(wǎng)絡(luò)中，共包含節(jié)點45個，其中牛膝、OP節(jié)點各1個，牛膝有效成分節(jié)點11個（表1內(nèi)19個牛膝有效成分中，有8個成分無對應的OP靶點），牛膝治療OP潛在作用靶點32個;含邊119條。槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、黃芩苷、大黃藤素的節(jié)點度值分別為30、13、12、7、5，為該網(wǎng)絡(luò)中較為重要的有效成分。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果

牛膝治療OP的PPI網(wǎng)絡(luò)見圖3，關(guān)鍵靶點的條形圖見圖4（圖中，RUNX2為骨轉(zhuǎn)錄因子;IFNG為干擾素γ;CYP3A4、CYP1A1、CYP1B1為細胞色素P450亞型;IL6、IL8、IL1A、IL1B為白細胞介素亞型;PPARG、PPARA分別為過氧化物酶體增殖物激活受體γ、α;BCL2、BAX為凋亡相關(guān)蛋白;ICAM1為細胞間黏附分子1;POR為細胞色素P450氧化還原酶;ESR1、ESR2分別為雌激素受體1、2;MMP1、MMP2分別為基質(zhì)金屬蛋白酶1、2;NR1I2為核受體亞家族I組成員2;SPP1為血清骨橋素1;COL1A1為Ⅰ型膠原蛋白;STAT1為轉(zhuǎn)錄活化蛋白;ADRB2為β2腎上腺素受體;HIF1A為缺氧誘導因子1a;MAPK1、MAPK14分別為絲裂原活化蛋白激酶1、14;MYC為原癌基因蛋白;IGF2為胰島素樣生長因子2;CCND1為細胞周期調(diào)控因子;AR為雄激素受體）。由圖3可見，該網(wǎng)絡(luò)中共有節(jié)點31個[其中，花生四烯酸-12-脂加氧酶（ALOX12）與其余靶點蛋白均不關(guān)聯(lián)，故不在該網(wǎng)絡(luò)中]、邊212條。由圖4可見，節(jié)點度值較高的靶點蛋白包括IL6、ESR1、MAPK1、IL8、MAPK14等，是該網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點，可能在牛膝治療OP中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.5 KEGG通路富集分析結(jié)果

牛膝治療OP的31個潛在作用靶點共富集在67條通路上，主要集中在類風濕性關(guān)節(jié)炎、乙型肝炎、Toll樣受體信號通路、破骨細胞分化、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路、Janus激酶/信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK/STAT）信號通路、核因子κB（NF-κB）信號通路等。富集基因數(shù)排序前28位的通路見圖5。

3 討論

流行病學調(diào)查顯示，在我國50歲以上人群中，女性O(shè)P患病率約為20.7%、男性約為14.4%[16]。OP的發(fā)病受性別及年齡的影響很大，同時還與患者體質(zhì)量指數(shù)、種族、遺傳、激素水平和基礎(chǔ)疾病等因素密切相關(guān)，其起病隱匿，老年患者致殘、致死率均較高[17]。中醫(yī)認為，OP的病因病機較為復雜，其發(fā)生的根本原因為腎精虧虛、不能濡養(yǎng)骨髓[18]，如《靈樞·經(jīng)脈》言“足少陰氣絕，則骨枯”，《扁鵲心書》言“骨縮病，此由腎氣虛憊，腎主骨，腎水既涸則諸骨皆枯，漸至短縮”，《醫(yī)述·雜證匯參·痹》言“經(jīng)熱則痹，絡(luò)血則痿，邪中于經(jīng)則痹，邪中于絡(luò)則痿也”，可見該癥發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)是血瘀[19]。

機體對疾病的內(nèi)在調(diào)控是一個相當復雜的過程，單一靶點或者單一信號通路并不能發(fā)揮治療作用，需要不同靶點和不同信號通路相互關(guān)聯(lián)、相互協(xié)作才能發(fā)揮藥效[20]。牛膝作為傳統(tǒng)中藥材，功擅補肝腎、強筋骨，針對OP人群且正對病機[21]。本研究TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索和“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、黃芩苷、大黃藤素等成分的節(jié)點度值較高，是牛膝的主要有效成分。其中，槲皮素、山柰酚等成分是目前研究的熱點之一。鄭紅等[22]研究表明，槲皮素是牛膝中的主要活性成分，其不僅具有增加成骨細胞分化的能力，而且還能抑制破骨細胞骨吸收并誘導其凋亡，從而維持骨代謝的平衡，防止OP的進一步發(fā)展。丁淑琴等[23]研究表明，山柰酚可通過影響骨形成標志物堿性磷酸酶及骨吸收關(guān)鍵酶組織蛋白酶K的活性來調(diào)節(jié)骨的形成與破壞。上述研究結(jié)果與本研究基本一致，提示牛膝有效成分具有一定的OP治療作用。

牛膝治療OP的PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，31個靶點蛋白中，節(jié)點度值排序前10位的依次為IL6、ESR1、MAPK1、IL8、MAPK14、HIF1A、SPP1、STAT1、IFNG、IGF2，可能為牛膝發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵靶點。其中，IL6、IL8、IL1A、IL1B等炎癥因子的表達在與淋巴細胞、單核細胞分化有關(guān)的分泌細胞中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是OP進展的重要環(huán)節(jié)[24]。ESR1、ESR2可參與骨細胞的代謝過程，并可有效抑制骨細胞的凋亡[25]。MAPK1、MAPK14可通過促進成骨細胞的增殖與分化、誘導血管內(nèi)皮細胞的形成來發(fā)揮對OP的防治作用[26]。HIF1A可促進間充質(zhì)干細胞成骨誘導分化，從而增強機體的成骨能力[27]。SPP1對骨代謝具有多重調(diào)節(jié)作用，且對成骨細胞、破骨細胞的增殖與分化具有調(diào)控作用[28]。STAT1可通過參與成骨細胞的凋亡過程來誘導機體骨量的改變[29]。IFNG能促進細胞外基質(zhì)合成，促進細胞成骨分化及膠原合成，與成骨活動密切相關(guān)[30]。IGF2受體的介導作用能促進細胞進行有絲分裂，同時還可促進分裂后的細胞進一步分化，在成骨過程中發(fā)揮重要作用[31]。

KEGG通路富集結(jié)果顯示，牛膝治療OP的潛在作用靶點編碼基因主要富集在類風濕性關(guān)節(jié)炎、乙型肝炎、Toll樣受體信號通路、破骨細胞分化、PI3K/Akt信號通路、JAK/STAT信號通路、NF-κB信號通路等通路上，主要涉及細胞分化和凋亡、代謝、炎癥反應等多種復雜的生物學過程[32]。（1）細胞分化和凋亡相關(guān)通路：細胞的分化和凋亡需要通過多種機制進行調(diào)節(jié)，以保證機體生命活動的正常運行，與此相關(guān)的通路包括PI3K/Akt、JAK/STAT、HIF-1、FoxO、MAPR、TGF-β等[33]。其中，PI3K/Akt信號通路及其下游靶蛋白在骨形成及骨重建過程中發(fā)揮了重要作用[34];JAK/STAT信號通道能夠?qū)Υ傺苌梢蜃拥谋磉_起到調(diào)控作用，從而參與骨細胞的形成及血管生成[35];HIF-1信號通路是一個低氧信號通路，其能有效加強骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨及成血管分化能力[36]。（2）代謝相關(guān)通路：體內(nèi)物質(zhì)可通過內(nèi)分泌、神經(jīng)等其他相關(guān)系統(tǒng)直接或間接影響/干預骨微環(huán)境的建立及穩(wěn)定[37]。其中，甲狀腺激素信號通路與機體甲狀腺水平密切相關(guān)，當甲狀腺激素分泌亢進時，機體骨代謝將受到影響，骨吸收速度大于骨形成速度，從而導致骨密度降低[38]。體外過量的類固醇可抑制鈣在胃腸道和腎小管中的吸收，使血鈣含量明顯降低，從而抑制成骨活動并降低骨量，可見類固醇激素生物合成這一通路可能與OP的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[39]。（3）炎癥相關(guān)通路：炎癥因子在OP的發(fā)病機制中起著重要作用，可誘導骨質(zhì)的侵蝕并加速OP的進展[40]，相關(guān)通路包括NF-κB通路、nod樣受體信號通路等。其中，NF-κB與其抑制蛋白Ⅰ κB結(jié)合并以復合物的形式存在于體內(nèi)，當其受到IL1、TNF等炎癥因子的刺激時，該復合物會發(fā)生降解，隨后轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，激活目標基因轉(zhuǎn)錄，進而參與慢性炎癥的發(fā)生[41];nod樣受體能調(diào)控半胱氨酸蛋白酶的活化而進一步促進IL1B的分泌，參與炎癥反應調(diào)控，最終加速OP的進展[42]。（4）與其他疾病相關(guān)的通路：疾病之間存在著微妙的調(diào)控機制，不同疾病之間相互關(guān)聯(lián)、相互影響[43]。如類風濕性關(guān)節(jié)炎為一種侵襲關(guān)節(jié)滑膜的炎癥性疾病，炎癥因子及增生的滑膜組織破壞了關(guān)節(jié)面軟骨及軟骨下骨，致使破骨細胞活性增強，從而使骨吸收進程加快[44];糖尿病患者的高血糖狀態(tài)會影響膠原蛋白及活性氧的形成，進而影響骨形成的過程，導致OP的發(fā)生[45];非酒精性脂肪肝會引起肝纖維化、胰島素抵抗、脂肪代謝紊亂等問題，并通過影響多條代謝通路參與骨密度的調(diào)節(jié)[46]，等等。由此可見，與類風濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、非酒精性脂肪肝等疾病相關(guān)的通路也有可能成為牛膝治療OP的靶點。

綜上所述，牛膝治療OP的潛在有效成分主要包括槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、黃芩苷、大黃藤素等，上述成分可通過直接或間接參與細胞分化和凋亡、代謝、炎癥反應等途徑來發(fā)揮對OP的治療作用，具有多成分、多靶點、多系統(tǒng)的特點。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學分析可獲得牛膝治療OP的可能有效成分及潛在作用靶點，但本研究僅為預測分析，上述結(jié)論及具體作用機制有待后續(xù)研究加以論證。

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（收稿日期：2019-02-26 修回日期：2019-09-05）

（編輯：張元媛）