氣相色譜法同時測定扎沖十三藥材中6種揮發(fā)性成分的含量

楊彩靜 曹人酈 趙穎 王小鳳 劉勛 顧艷麗

摘 要 目的：建立同時測定扎沖十三藥材中丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、α-細辛腦、木香烴內酯、肉豆蔻醚等6種揮發(fā)性成分含量的方法。方法：采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，采用氣相色譜法測定揮發(fā)油中6種成分含量。色譜柱為ov-1701毛細管，氫火焰離子化檢測器，載氣為氮氣，進樣口溫度為220 ℃，檢測器溫度為240 ℃，流速為1.0 mL/min，進樣量為1 μL，分流比為10 ∶ 1，程序升溫。結果：丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、α-細辛腦、木香烴內酯、肉豆蔻醚檢測質量濃度線性范圍分別為2.00～12.00、1.00～6.00、0.60～3.60、0.05～0.30、0.05～0.30、0.60～3.60 mg/mL（r均為0.999 9），檢測限分別為0.01、0.01、0.02、0.01、0.01、0.01 mg/mL，定量限分別為0.05、0.03、0.06、0.02、0.02、0.03 mg/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD均小于3%；平均加樣回收率為99.33%～100.04%，RSD為0.02%～0.35%（n=6）；耐用性試驗的RSD均小于5%。結論：本研究所建方法操作簡單、重復性好，可用于扎沖十三藥材中6種揮發(fā)性成分含量的同時測定。

關鍵詞 扎沖十三；氣相色譜法；含量測定；揮發(fā)性成分

Simultaneous Determination of the Contents of 6 Volatile Components in Zhachong Shisan by GC

YANG Caijing1，CAO Renli1，ZHAO Ying1，WANG Xiaofeng1，LIU Xun2，GU Yanli1（1. College of Pharmacy，Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010110， China； 2. Dept. of Medicine and Food， Tongliao Vocational College， Inner Mongolia Tongliao 028000， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneously determining the contents of 6 volatile components such as eugenol， methyl eugenol， isoeugenol， α-asarone， alkaloid and myristyl ether in Zhachong shisan. METHODS：Volatile oil was extracted by steam distillation and analyzed by gas chromatography. The chromatographic column was ov-1701， with hydrogen flame ionization detector. The carrier gas was nitrogen， the inlet temperature was 220 ℃， the detector temperature was 240 ℃， the flow rate was 1.0 mL/min， the injection volume was 1 μL， the split ratio was 10 ∶ 1， with programmed temperature. RESULTS： The linear ranges of eugenol， methyl eugenol， isoeugenol， α-asarone， costunolide and myristyl were 2.00-12.00， 1.00-6.00， 0.60-3.60， 0.05-0.30， 0.05-0.30， 0.60-3.60 mg/mL（r=0.999 9）. The detection limits were 0.01， 0.01， 0.02， 0.01， 0.01， 0.01 mg/mL， respectively； the limits of quantification were 0.05， 0.03， 0.06， 0.02， 0.02， 0.03 mg/mL， respectively. RSDs of precision， stability and reproducible tests were all lower than 3%； average recovery rates were 99.33%-100.04%， RSDs were 0.02%-0.35% （n=6）； RSDs of durability test were all lower than 5%. CONCLUSIONS： The established method was simple and reproducible. It can be used for simultaneous determination of the contents of 6 volatile components in Zhachong shisan.

KEYWORDS Zhachong shisan； Gas chromatography； Content determination； Volatile component

扎沖十三，又名嘎日迪-13，現(xiàn)收載于《衛(wèi)生部藥品標準·蒙藥分冊》，為蒙醫(yī)經(jīng)典方劑[1]。處方由訶子、制草烏、石菖蒲、木香、麝香、丁香、肉豆蔻、沉香等13味藥組成[2]，用于治療半身不遂、左癱右瘓、四肢麻木、腰腿不利、神經(jīng)麻痹、言語不清、筋骨疼痛、風濕、關節(jié)疼痛等疾病[3-4]。由于扎沖十三味丸原生產(chǎn)工藝比較落后，質量標準僅有顯微鑒別和理化鑒別，而該藥組方中既有毒性藥材，又有貴重藥材，還有礦物藥，成分眾多；且有研究發(fā)現(xiàn)，扎沖十三保護心血管系統(tǒng)、松弛平滑肌、解痙和抗血栓作用的活性成分主要是揮發(fā)性成分[5]?！缎l(wèi)生部藥品標準·蒙藥分冊》并沒有記載扎沖十三藥材中揮發(fā)性成分的含量測定方法。鑒于此，筆者從扎沖十三處方出發(fā)，選擇該方中含揮發(fā)油的藥材為研究對象，提取其揮發(fā)油，并同時測定揮發(fā)油中丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、α-細辛腦、木香烴內酯和肉豆蔻醚等6種成分的含量，旨在提高該方制劑的質量標準和推動相應新劑型的開發(fā)。

1 材料

1.1 儀器

7890B型氣相色譜儀，包括氫火焰離子化檢測器（FID）、5190型手動進樣器（美國Agilent公司）；10 mL揮發(fā)油提取器（鄭州玻璃儀器廠）；AB135-S型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）； MH-500型調溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）；SB25-12 DTD型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；914B型高扭力粉碎機（中山市方天電器制造有限公司）。

1.2 藥材與試劑

石菖蒲（產(chǎn)地：安徽省合肥市長豐縣，批號：20170502）、木香（產(chǎn)地：云南省昆明市晉寧縣，批號：20170541）、沉香（產(chǎn)地：山西省大同市廣靈縣，批號：20170525）、肉豆蔻（產(chǎn)地：廣東省廣州市番禺區(qū)，批號：20170523）、丁香（產(chǎn)地：湖南省長沙市長沙市區(qū)，批號：20170511）藥材均購于內蒙古天力藥業(yè)有限責任公司，均經(jīng)內蒙古醫(yī)科大學藥學院藥用植物教研室渠弼教授鑒定為真品。自制揮發(fā)油8批（批號：S1～S8，揮發(fā)油是將木香、沉香、丁香、肉豆蔻、石菖蒲5味藥材按處方比例[6]稱取100 g，粉碎過篩，置于圓底燒瓶內，加適量水冷浸1 h，置電熱套上蒸餾4 h，將水層緩緩放出，收集揮發(fā)油[7]，即得）。

木香烴內酯對照品（批號：111525-201711，純度：99.50%）、甲基丁香酚對照品（批號：111642- 200301，純度：99.98%）、α-細辛腦對照品（批號：100298- 201203，純度：99.98%）、肉豆蔻醚對照品（批號：190180- 201701，純度：99.50%）均購自中國食品藥品檢定研究院；丁香酚對照品（批號：D-064-170508，純度：≥98.00%）、異丁香酚對照品（批號：Y-147-170426，純度：≥98.00%）均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；無水硫酸鈉、正己烷均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱： ov-1701毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.20 μm）；程序升溫（初始溫度為90 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升溫至180 ℃，保持4 min；以10 ℃/min升溫至200 ℃，保持2 min；以10 ℃/min升溫至220 ℃，保持9 min；以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持2 min）；進樣口溫度：220 ℃；檢測器： FID；檢測器溫度：240 ℃；載氣：氮氣（純度：99.99%）；流速：1.0 mL/min；分流比：10 ∶ 1；氫氣流速：20 mL/min；空氣流速；400 mL/min；進樣量：1 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取丁香酚對照品、甲基丁香酚對照品、異丁香酚對照品、α-細辛腦對照品、木香烴內酯對照品、肉豆蔻醚對照品200.04、100.01、60.06、5.02、5.03、60.01 mg，置于10 mL量瓶中，加入正己烷，配制成每1 mL含丁香酚20.00 mg、甲基丁香酚10.00 mg、異丁香酚6.01 mg、α-細辛腦0.50 mg、木香烴內酯0.50 mg、肉豆蔻醚6.00 mg的混合對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取自制揮發(fā)油適量，置于10 mL量瓶中，加正己烷定容；取定容后的溶液1 mL置于2 mL量瓶中，加正己烷定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按樣品的制備工藝和配方比例，分別制備缺木香、缺沉香、缺丁香、缺肉豆蔻、缺石菖蒲的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制備溶液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

分別精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各1 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。結果，在該色譜條件下，各待測成分間與各雜質峰間均能達到基線分離，分離度>1.5；其他成分對待測成分的測定無干擾；理論板數(shù)按丁香酚峰計不低于1 000，詳見圖1。

2.4 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.20、0.40、0.60、0.8、1.0、1.2 mL，分別置于2 mL 量瓶中，加正己烷定容，搖勻，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度為橫坐標（x，mg/mL）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，結果見表1。

2.5 定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10 ∶ 1時，得定量限；當信噪比為3 ∶ 1時，得檢測限。定量限與檢測限結果見表1。

2.6 精密度試驗

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液 1 mL，置于10 mL 量瓶中，加正己烷稀釋并定容，搖勻，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果，丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、α-細辛腦、木香烴內酯、肉豆蔻醚峰面積的RSD分別為1.03%、1.15%、0.98%、0.64%、0.58%、0.86%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、α-細辛腦、木香烴內酯、肉豆蔻醚峰面積的RSD分別為1.05%、0.45%、0.81%、1.00%、1.01%、0.56%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置10 h 內穩(wěn)定性良好。

2.8 重復性試驗

取自制揮發(fā)油（批號：S1）適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并按標準曲線法計算樣品含量。結果，丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、α-細辛腦、木香烴內酯、肉豆蔻醚的平均含量分別為 6.760 6、2.950 1、1.695 5、0.197 3、0.138 6、2.200 1 mg/g，RSD分別為1.05%、1.45%、1.81%、2.01%、1.31%、1.56%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密量取自制揮發(fā)油（批號：S1）適量，共6份，每份2 mL，分別置于10 mL量瓶中，再加入“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

2.10 樣品含量測定

取8批自制揮發(fā)油各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品含量，結果見表3。

2.11 耐用性試驗

2.11.1 色譜柱考察 精密量取自制揮發(fā)油（批號：S1）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別設置毛細管柱為 DB-5（30 m×0.32 mm，0.25 μm）、HP-5（30 m×0.32 mm，0.25 μm）、ov-1701（30 m×0.25 mm，0.20 μm），再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并按標準曲線法計算樣品含量，結果見表4。由表4可見，不同品牌、不同柱內徑、不同膜厚度的色譜柱對含量測定結果影響較小，提示本方法耐用性良好。

2.11.2 進樣口溫度考察 精密量取自制揮發(fā)油（批號：S1）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別設置進樣口溫度為210、215、220 ℃，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品含量，結果見表4。由表4可見，當進樣口溫度發(fā)生一定程度變化時，對含量測定結果影響較小，提示本方法耐用性良好。

2.11.3 流速考察 精密量取自制揮發(fā)油（批號：S1）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別設置流速為 1.9、2.0、2.1 mL/min，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品含量，結果見表4。由表4可見，當流速發(fā)生一定程度變化時，對含量測定結果影響較小，提示本方法耐用性良好。

2.11.4 柱溫（初始溫度）考察 精密稱取揮發(fā)油樣品（批號：S1）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別設置柱溫（初始溫度）為89、90、91 ℃，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品含量，結果見表4。由表4可見，柱溫（初始溫度）發(fā)生一定程度變化時，對含量測定結果影響較小，提示本方法耐用性良好。

3 討論

3.1 測定方法的選擇

江明等[8]采用氣相色譜法測定克痢痧膠囊中甲基丁香酚和丁香酚的含量。趙祥升等[9]采用氣相色譜法同時測定肉豆蔻中丁香酚、異丁香酚、肉豆蔻醚和欖香脂素的含量。劉玉云等[10]采用氣相色譜法測定川芎中α-細辛腦的含量。筆者參考上述文獻，采用氣相色譜法測定6種揮發(fā)性成分的含量。

3.2 測定成分的選擇

研究發(fā)現(xiàn)，扎沖十三處方中揮發(fā)性成分在保護心血管系統(tǒng)、松弛平滑肌、解痙和抗血栓中發(fā)揮了重要的作用，方中含有揮發(fā)性成分的藥材有丁香、木香、沉香、石菖蒲、肉豆蔻[11]。其中，丁香中的丁香酚具有麻醉、抑菌、解熱、抗腫瘤、抗氧化、促進透皮吸收等多種藥理活性，甲基丁香酚、異丁香酚具有抗菌、鎮(zhèn)痛抗炎、抗氧化損傷等藥理活性[12]；α-細辛腦是石菖蒲的主要有效成分，具有鎮(zhèn)靜、平喘、止咳、祛痰、解痙、抗驚厥等作用[13]；木香烴內酯是木香揮發(fā)油的主要成分，具有松弛平滑肌、解痙和抗血栓的作用[14]；肉豆蔻醚是肉豆蔻發(fā)揮藥效的主要成分，能透過血腦屏障進入腦組織，具有中度興奮大腦的作用[15]。故筆者選擇對丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、α-細辛腦、木香烴內酯、肉豆蔻醚等6種揮發(fā)性成分進行含量測定。

3.3 進樣方式的選擇

筆者對比了頂空進樣和進樣針進樣的區(qū)別，前者的原理是通過加熱裝置將樣品中可揮發(fā)組分氣化[16]，主要用于檢測沸點不高的殘留溶劑、有機污染物等，避免主成分對色譜柱的傷害[17]；而本研究只是測定揮發(fā)油中各成分的含量，不存在有害成分，且進樣針進樣相比頂空進樣操作簡單，故筆者選擇了進樣針進樣測定扎沖十三處方藥材中6種揮發(fā)性成分的含量。

3.4 升溫程序的選擇

在升溫程序20～25 min，當選擇10 ℃/min的升溫速度時，丁香酚和甲基丁香酚分離度達不到要求；當選擇5 ℃/min的升溫速度時，丁香酚和甲基丁香酚分離度>1.5，故筆者選擇了“2.1”項下的升溫程序。

3.5 含量測定結果分析

本研究中6種揮發(fā)性成分的含量測定結果均高于2015年版《中國藥典》（一部）中規(guī)定的標準[18]，且8批樣品中各揮發(fā)性成分的含量接近，RSD均小于1%（如表3所示）。但同一批樣品中6種成分含量差異較大，含量較高的為丁香酚，含量最低的為木香烴內酯。

綜上，本研究建立了同時測定扎沖十三處方藥材中丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、α-細辛腦、木香烴內酯、肉豆蔻醚等6種揮發(fā)性成分的含量測定方法，該方法操作簡單、重復性好，可為今后扎沖十三處方藥材的質量控制和揮發(fā)油成分的含量測定提供依據(jù)，同時為進一步開發(fā)利用扎沖十三揮發(fā)油奠定一定的基礎。

參考文獻