應(yīng)用HPLC法對(duì)5種花色鈴兒花花青素的定量分析

王志廣 張盟雨 易禮江

摘要? ? 利用高效液相色譜法（HPLC）分析不同花色鈴兒花中花青素組分及其含量。樣品經(jīng)處理后，分析柱為C18柱、流動(dòng)相為4%磷酸水溶液與乙腈、等梯度洗脫、檢測(cè)波長(zhǎng)520 nm、外標(biāo)法定量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在玉色、白色、淺粉色、粉色、紅色5個(gè)典型花色中，淺粉色鈴兒花的花青素種類(lèi)最多，為24種。隨著鈴兒花顏色的加深，花青素總含量逐漸增加，紅色鈴兒花花青素含量最高，達(dá)411.19 μg/g。不同花色的鈴兒花中，HPLC峰面積與峰高比值與芍藥素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草色素和錦葵色素含量成正相關(guān)趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞? ? 花青素;鈴兒花;高效液相色譜法

中圖分類(lèi)號(hào)? ? S685.21? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

文章編號(hào)? ?1007-5739（2019）14-0130-02? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Abstract? ? The anthocyanin constituents and contents in Enkianthus quinqeuflorus Lour with different colors were analyzed by high performance liquid chromatography（HPLC）.After treating the samples ，the analytical column was C18，with 4% phosphoric acid aqueous solution and acetonitrile as the mobile phase，the isometric elution，520 nm of detection wavelength，and the external standard method were used for quantification.The results showed that in the jade，white，light pink，pink and red of E. quinqeuflorus Lour，the number of anthocyanin components of light pink was the highest，reaching 24.With the deepening of the color of E .quinqeuflorus Lour，the total anthocyanin content increased gradually，the highest content of which was red flower，reaching 411.19 μg/g.The ratio of peak area to height in HPLC was positively correlated with the contents of peonidin-3-O-glucoside，delphinidin chloride and malvidin chloride.

Key words? ? anthocyanin;Enkianthus quinqeuflorus Lour;high performance liquid chromatography

鈴兒花（Enkianthus quinqeuflorus Lour.），屬于杜鵑花科吊鐘花屬落葉或半常綠灌木（或小喬木），其野生群落可使?jié)M山紅遍，深紅與粉紅相間，其葉色秋季呈鮮艷的黃褐色至紅色，以絢麗多彩的大色塊表現(xiàn)群體的色彩美[1]?；ㄇ嗨兀置ㄉ?，是一類(lèi)廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，具有抗氧化性、清除自由基、抗腫瘤、減輕肝機(jī)能障礙等生理功能[2]。目前，已知的花青素有23種[3]，主要有天竺葵色素、矢車(chē)菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、矮牽牛色素、錦葵色素[4]等。其中，天竺葵色素呈磚紅色，矢車(chē)菊色素和芍藥色素表現(xiàn)為紫紅色，飛燕草色素、矮牽牛色素與錦葵色素為藍(lán)紫色[5-6]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于鈴兒花花青素的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)超聲法快速提取鈴兒花花青素，建立鈴兒花花青素組分的高效液相色譜定量分析方法，同時(shí)比較了不同花色鈴兒花中花青素含量，以期為鈴兒花色素的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 材料與試劑

鈴兒花樣品，采集于廣東省沙頭角林場(chǎng)。芍藥素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草色素、錦葵色素、矮牽牛色素等4種花青素標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;磷酸、甲醇和鹽酸均為分析純，分別購(gòu)于天津市富宇精細(xì)化工有限公司、天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司和珠海市華成達(dá)化工有限公司;乙腈為色譜純，購(gòu)于北京邁瑞達(dá)科技有限公司。

1.2? ? 儀器與設(shè)備

LC30 AD雙泵高效液相色譜儀和SPD-20A UV/VIS檢測(cè)器，SHIMADZU公司生產(chǎn);反相InertSustain C18柱（4.6 mm×250 mm），島津技邇（上海）高貿(mào)有限公司生產(chǎn);SB-5200 DTN超聲波清洗器，寧波新芝生物科技有限公司生產(chǎn);AR 423CN電子天平，奧豪斯公司生產(chǎn);ADW-2002-M超純水系統(tǒng)，艾科浦公司生產(chǎn)。

1.3? ? 試驗(yàn)方法

1.3.1? ? 材料采集。2019年2月下旬，當(dāng)日為陰天有霧、空氣濕度95%以上、氣溫22℃，選擇玉色、白色、淺粉色、粉色和紅色鈴兒花，采集帶花枝條，在保濕狀態(tài)下快速帶回實(shí)驗(yàn)室，擦干花序表面水分。收集花序于75 ℃烘干至恒重，研磨過(guò)60目篩，置于干燥器內(nèi)備用。當(dāng)天測(cè)定鈴兒花水分含量。

1.3.2? ? 花青素提取。準(zhǔn)確稱取0.5 g樣品，并溶于10 mL 1%鹽酸甲醇（V∶V）中，充分混勻;將浸泡液避光置于超聲波處理30 min;使用0.45 μm濾膜過(guò)濾浸泡液，將濾液置于4 ℃冰箱中保存，殘?jiān)偈褂?0 mL 1%鹽酸甲醇浸泡，重復(fù)上述操作2次后，將30 mL提取液合并于棕色瓶中，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取適量提取液用1%鹽酸甲醇稀釋一定濃度后取10 μL上樣。

1.3.3? ? 花青素測(cè)定。采用外標(biāo)法定量分析花青素，用高效液相色譜儀測(cè)定。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：精確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品適量溶于1%鹽酸甲醇溶液中，配制成1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.01、0.05、0.10、0.20、1.00 mL定容至1 mL的1%鹽酸甲醇溶液中，配制成濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.20、1.00 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，將標(biāo)準(zhǔn)溶液用0.22 μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣10 μL。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4? ? 色譜分析。色譜柱為C18柱，流動(dòng)相為4%磷酸∶乙腈（體積比為88∶12，pH值2.0），流速為0.8 mL/min，0.45 μm濾膜抽濾，等梯度洗脫，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)520 nm，靈敏度1.0 AUFS，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.5? ? 提取液中花青素含量的計(jì)算。花青素含量計(jì)算公式為x（%）=■×f×100。式中，x為花青素含量;A為樣品中花青素峰面積;C為標(biāo)準(zhǔn)溶液中花青素的濃度（mg/mL）;V為樣品最終定容體積（mL）;AS為標(biāo)準(zhǔn)溶液中花青素峰面積;m為試樣質(zhì)量（g）;f為稀釋倍數(shù)。鈴兒花花序中總花青素含量為芍藥素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草色素、錦葵色素、矮牽牛色素4種花青素之和。

1.4? ? 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用峰面積歸一化法計(jì)算花青素含量，以鮮質(zhì)量計(jì)。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 不同花色鈴兒花花青素種類(lèi)比較

本試驗(yàn)在廣東梧桐山國(guó)家森林公園采集玉色、白色、淺粉色、粉色和紅色5種不同花色鈴兒花（圖1），經(jīng)HPLC分析，測(cè)得花青素色譜峰有8～24種。其中，玉色和白色鈴兒花樣品中花青素種類(lèi)最少，分別只有8種和9種;淺粉色鈴兒花花青素種類(lèi)最多，達(dá)24種（圖2）。結(jié)果表明，淺粉色鈴兒花花青素種類(lèi)最豐富。

2.2? ? 不同花色鈴兒花花青素含量比較

采用高效液相色譜法分別對(duì)不同花色的鈴兒花序中芍藥素-3-O-葡萄糖苷（PG）、飛燕草色素（DC）、錦葵色素（MC）和矮牽牛色素（PC）進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，在5種鈴兒花中均未檢測(cè)出PC成分。

PG、DC和MC在不同花色鈴兒花中含量均不相同。由圖3可知，PG和DC含量隨鈴兒花顏色加深，呈先上升后下降的趨勢(shì)。PG含量在淺粉色鈴兒花中最高，達(dá)267.78 μg/g，此時(shí)HPLC色譜峰面積與峰高比值（A/H）為11.08;DC在粉色鈴兒花中含量最高，為5.57 μg/g，A/H為5.78。MC在玉色、白色和淺粉色鈴兒花中未檢出，在紅色鈴兒花中含量最高，達(dá)405.89 μg/g，此時(shí)A/H為11.03。PG、DC和MC等3種花青素在HPLC中A/H的變化趨勢(shì)均與含量成正比，因而可直接采用A/H進(jìn)行花青素定性分析。隨著鈴兒花顏色逐漸加深，3種花青素總含量也逐漸增加，玉色鈴兒花花青素總含量最少，為213.60 μg/g;紅色鈴兒花花青素總含量最高，達(dá)411.19 μg/g。

3? ? 結(jié)論

鈴兒花含有花青素資源，在開(kāi)發(fā)天然色素、保健食品和天然抗氧化劑等方面具有潛在的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。本文采集的玉色、白色、淺粉色、粉色、紅色5種典型花色中測(cè)得花青素 8～24種，其中淺粉色鈴兒花樣品中花青素種類(lèi)最多（24種），其顏色表型也最豐富。紅色鈴兒花樣品顏色最深，檢測(cè)獲得的芍藥素-3-O-葡萄糖苷（PG）、飛燕草色素（DC）和錦葵色素（MC）3種花青素總含量最高（411.19 μg/g）。峰面積與峰高比值（A/H）可反應(yīng)MC、PG和DC的變化趨勢(shì)。

4? ? 參考文獻(xiàn)

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