地高辛對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡作用的研究

呂雨晨 吳苗苗 房坤

[摘要] 目的 探討地高辛對(duì)體外培養(yǎng)的三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響，并揭示其發(fā)生的可能機(jī)制。 方法 體外培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，分為對(duì)照組和給藥組（25、50、100、200 nmol/L地高辛）。CCK-8法檢測(cè)不同濃度的地高辛、不同作用時(shí)間（24、48、72 h）對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響。流式細(xì)胞術(shù)定量考察不同濃度的地高辛對(duì)細(xì)胞凋亡的作用及對(duì)線粒體膜電位的影響。Western blot檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞中Bax、Bcl-2和P62、LC3B蛋白的表達(dá)情況。透射電鏡觀察不同濃度的地高辛對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞自噬體產(chǎn)生的影響。 結(jié)果 CCK-8結(jié)果提示，與對(duì)照組比較，在不同時(shí)間點(diǎn)，給藥組使MDA-MB-231細(xì)胞活力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。Annexin V/PI雙染結(jié)果提示，與對(duì)照組比較，給藥組使細(xì)胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。JC-1染色結(jié)果提示，與對(duì)照組比較，50、100、200 nmol/L地高辛使MDA-MB-231細(xì)胞線粒體膜電位電位降低，JC-1所占比例減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。透視射電鏡結(jié)果提示，與對(duì)照組比較，給藥組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生凋亡樣改變，給藥組可見自噬體的形成。Western blot結(jié)果提示，與對(duì)照組比較，給藥組上調(diào)促凋亡因子Bax，下調(diào)抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)，并上調(diào)自噬標(biāo)志性蛋白LC3B表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）;與對(duì)照組比較，50、100、200 nmol/L地高辛使P62表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 地高辛抑制MDA-MB-321細(xì)胞的活力，促進(jìn)凋亡，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，可能對(duì)三陰性乳腺癌有潛在作用。

[關(guān)鍵詞] 三陰性乳腺癌;地高辛;凋亡;自噬;MDA-MB-231細(xì)胞

[中圖分類號(hào)] R737.9 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2019）12（c）-0014-06

Effect of Digoxin on apoptosis of MDA-MB-231 cells in triple negative breast cancer

LYU Yuchen1 ? WU Miaomiao2 ? FANG Kun2 ? CHEN Wenxu1 ? SHEN Aizong2 ? LIU Tongzhu2 ? WANG Ning1

1.College of Pharmacy， Anhui University of Chinese Medicine， Anhui Province， Hefei ? 230012， China; 2.Biomedical Engineering Agency， the First Affiliated Hospital of USTC ?Anhui Provincial Hospital， Anhui Province， Hefei ? 230001， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Digoxin on apoptosis of MDA-MB-231 cells of triple negative breast cancer in vitro， and to reveal its possible mechanism. Methods Breast cancer MDA-MB-231 cells were cultured in vitro and divided into control group and drug administration group （25， 50， 100， 200 nmol/L Digoxin）. CCK-8 method was used to detect the effects of Digoxin at different concentrations on the activity of MDA-MB-231 cells at different action time （24， 48， 72 h）. The effects of Digoxin at different concentrations on apoptosis and mitochondrial membrane potential were quantitatively investigated by flow cytometry. Expression of Bax， Bcl-2， P62 and LC3B in MDA-MB-231 cells was detected by Western blot. The effects of Digoxin at different concentrations on autophagosomes in MDA-MB-231 cells were observed by transmission electron microscopy. Results CCK-8 results indicated that， compared with the control group， the activity of MDA-MB-231 cells decreased in the drug administration group at different time， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. Annexin V/PI double staining results indicated that compared with the control group， the apoptosis rate of the treated group increased with a statistically significant difference （P < 0.05 or P < 0.01）. The results of JC-1 staining indicated that compared with the control group， 50， 100 and 200 nmol/L of Digoxin reduced the mitochondrial membrane potential of MDA-MB-231 cells， and the proportion of JC-1 decreased， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. The results of fluoroscopy indicated that， compared with the control group， the cell morphology of the drug administration group underwent apoptotic changes， and the formation of autophagosomes was observed in the drug administration group. Western blot results indicated that， compared with the control group， the administration group up-regulated the expression of pro-apoptotic factor Bax， down-regulated the expression of anti-apoptotic factor Bcl-2， and up-regulated the expression of autophagy marker protein LC3B， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）; compared with the control group， 50， 100 and 200 nmol/L of Digoxin decreased the expression of P62， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Digoxin inhibits the activity of MDA-MB-231 cells， promotes apoptosis， induces autophagy， and may have a potential effect on triple negative breast cancer.

[Key words] Triple negative breast cancer; Digoxin; Apoptosis; Autophagy; MDA-MB-231 cells

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是一種侵襲性、轉(zhuǎn)移性、復(fù)發(fā)性較強(qiáng)的惡性腫瘤[1]。目前，化療是臨床術(shù)后治療TNBC的主要治療手段，但其治愈率低，易產(chǎn)生耐藥性[2]。因此，迫切需要尋求對(duì)TNBC治療有效的藥物。研究報(bào)道洋地黃類藥物可有效抑制惡性腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，促腫瘤細(xì)胞凋亡[3]。有研究證實(shí)自噬是洋地黃類藥物治療腫瘤的重要機(jī)制，其可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性凋亡[4]。地高辛是臨床上最常用的洋地黃類藥物，且許多研究顯示，其對(duì)多種惡性腫瘤均具有顯著的抗腫瘤作用，可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞自噬[5-6]。目前，已有研究報(bào)道地高辛可誘導(dǎo)肺癌發(fā)生自噬，促進(jìn)肺癌的治療[7]。然而，地高辛對(duì)人乳腺癌的作用機(jī)制尚不清楚，本研究選用乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株作為研究對(duì)象，研究地高辛對(duì)乳腺癌凋亡作用的影響，為三陰性乳腺癌臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞株與主要儀器 ?MDA-MB-231細(xì)胞株來源于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);SpectraMax？誖Ⅰ3全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)MD公司）;A00-1-1102型流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter 公司）;HF型二氧化碳培養(yǎng)箱（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）;DMI3000B倒置顯微鏡（德國(guó)萊卡公司）。

1.1.2 主要試劑 ?地高辛（純度≥98%）（MCE公司，貨號(hào)：HY-B1049）;DMEM高糖（美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：SH30022.01）;胰酶細(xì)胞消化液（碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：C0201）;胎牛血清（fatal bovine serum，F(xiàn)BS杭州四季青生物工程有限公司，批號(hào)：11012-8611）;CCK-8細(xì)胞增殖-細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（上海貝博生物有限公司，批號(hào)：BB4202-3）;Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海貝博生物有限公司，批號(hào)：BB4101-3）;細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：KGA604）;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（杭州四季青生物工程有限公司，批號(hào)：P0010S）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) ?將MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清），置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性 ?取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將密度為1×104個(gè)/mL，每孔100 μL，接種于96孔板中，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。實(shí)驗(yàn)分為空白組、對(duì)照組及給藥組，空白組在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入CCK-8，對(duì)照組在含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入CCK-8，給藥組（25、50、100、200 nmol/L地高辛），進(jìn)行給藥孵育24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃孵育，在30 min、1 h、2 h、3 h、4 h時(shí)間點(diǎn)，測(cè)定各孔在450 nm的吸光度值（OD）。按照下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)活力：細(xì)胞活力% =[（OD給藥組-OD空白組）/（OD對(duì)照組-OD空白組）]×100%。

1.2.3 Annexin V-FITCH和PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 ?取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔板，每板1×105個(gè)，對(duì)照組不做處理，給藥組（25、50、100、200 nmol/L地高辛），孵育MDA-MB-231細(xì)胞24 h后，收取細(xì)胞。用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌2次，取3×105個(gè)細(xì)胞加入500 μL 1×結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5 μL FITC混勻，避光孵育15 min，再加入10 μL PI混勻，置于常溫避光孵育5 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)各組凋亡率。

1.2.4 JC-1染色檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位 ?取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔板，每板1×105個(gè)，對(duì)照組不做處理，給藥組（25、50、100、200 nmol/L地高辛），孵育MDA-MB-231細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞用冷PBS洗滌2次。取2×105個(gè)細(xì)胞加入400 μL 1× JC-1工作液混勻，在37℃中孵育20 min，用1× Incubation Buffer清洗后，再加入400 μL 1× Incubation Buffer充分混勻，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5透射電鏡觀察凋亡體和自噬體的形成 ?取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔板，每板1×105個(gè)，對(duì)照組不做處理，給藥組（25、50、100、200 nmol/L地高辛），孵育MDA-MB-231細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞用PBS清洗后，離心收集細(xì)胞，緩慢加入1.5 mL電鏡固定液固定，再用1%鋨酸固定1.5 h，PBS清洗，在不同濃度的乙醇中進(jìn)行逐級(jí)脫水，將脫水后的樣品 滲透Spurr樹脂中，在放入聚合器中聚合，將聚合后的樣品在顯微鏡下包埋切片。用乙酸鈾酰-檸檬酸鉛雙重染色，自然干燥后透射電子顯微鏡下觀察自噬小體的形態(tài)。

1.2.6 Western blot檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞中Bax、Bcl-2、P62和LC3B蛋白表達(dá)水平 ?取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔板，每板1×105個(gè)，對(duì)照組不做處理，給藥組（25、50、100、200 nmol/L地高辛），孵育MDA-MB-231細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞PBS清洗后，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，BCA試劑盒檢測(cè)樣品蛋白濃度，采用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜法，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉水溶液封閉2 h，將膜放入相應(yīng)一抗HIF-1α、Bax、Bcl-2、P62和LC3B（1∶1000）和GAPDH（1∶5000），4℃孵育過夜，用PBST洗膜3次，放入HRP標(biāo)記的二抗（1∶10 000）。室溫孵育1 h后，顯影，掃描曝光，用Image J軟件分析，并計(jì)算目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 地高辛對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響

2.2 地高辛對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞促凋亡的作用

與對(duì)照組比較，給藥組使細(xì)胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見圖2。與對(duì)照組比較，50、100、200 nmol/L地高辛使MDA-MB-231細(xì)胞線粒體膜電位電位降低，JC-1所占比例減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見圖3。與對(duì)照組比較，給藥組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，核內(nèi)染色邊緣化聚集，細(xì)胞核空泡變性，線粒體變性壞死，出現(xiàn)凋亡小體及壞死性細(xì)胞。見圖4。與對(duì)照組比較，給藥組上調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中促凋亡因子Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見圖5。

2.3地高辛誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞自噬的發(fā)生

與對(duì)照組比較，給藥組MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)自噬囊泡雙層膜結(jié)構(gòu)。見圖7。與對(duì)照組比較，給藥組使細(xì)胞自噬因子LC3B表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）;與對(duì)照組比較，50、100、200 nmol/L地高辛使P62表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見圖8。

3 討論

研究提示洋地黃類藥物通過調(diào)節(jié)凋亡、自噬等途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成及轉(zhuǎn)移[8-9]，洋地黃類藥物靶向作用于腫瘤細(xì)胞的多種信號(hào)通路，具有潛在的抗腫瘤特性[10-11]。目前已有兩種洋地黃類藥物，分別為夾竹桃植物提取物Anvirzel和PBI-02504（Oleandrin）因其良好的抗腫瘤效果在美國(guó)通過Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)[12-13]。本研究將不同濃度地高辛在不同時(shí)間點(diǎn)作用于乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度地高辛在不同時(shí)間點(diǎn)可使MDA-MB-231細(xì)胞活力下降。

在腫瘤細(xì)胞中，凋亡被認(rèn)為是癌癥治療的一種重要機(jī)制[14]。細(xì)胞凋亡主要階段性標(biāo)志是細(xì)胞核形態(tài)的變化，如細(xì)胞核膜整體損傷及凋亡小體的形成[15]。為證實(shí)細(xì)胞凋亡的激活，通過透射電鏡觀察及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，與對(duì)照組比較，給藥組細(xì)胞核內(nèi)染色邊緣化聚集，細(xì)胞核核內(nèi)胞漿出現(xiàn)空泡變性，線粒體變性壞死，出現(xiàn)凋亡小體及壞死性細(xì)胞，進(jìn)一步運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)研究，結(jié)果提示，與對(duì)照組比較，細(xì)胞凋亡率增加。除此之外;細(xì)胞凋亡受多種促凋亡和抗凋亡因子的控制，抗凋亡和促凋亡蛋白Bax和Bcl-2是細(xì)胞凋亡的主要調(diào)節(jié)因子[16]，進(jìn)一步確認(rèn)細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)過程，研究地高辛處理的細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白變化，Western-Blot結(jié)果提示，與對(duì)照組比較，不同濃度地高辛可上調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中促凋亡因子Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)。同時(shí)，凋亡相關(guān)蛋白Bax 和Bcl-2是介導(dǎo)調(diào)節(jié)線粒體膜電位的關(guān)鍵因子，維持線粒體膜的完整性和通透性[17]。在癌細(xì)胞中，Bcl-2蛋白高表達(dá)對(duì)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有抑制作用，而促凋亡蛋白Bax在凋亡細(xì)胞刺激的激活下，導(dǎo)致線粒體膜電位通透性的損傷破壞，線粒體膜電位的降低，是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式之一[18]。利用JC-1染色檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位的變化，結(jié)果提示與對(duì)照組比較，給藥組線粒體膜電位逐漸降低，以上結(jié)果顯示地高辛調(diào)節(jié)凋亡蛋白的表達(dá)，同時(shí)又破壞線粒體膜電位，誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡。

研究提示，自噬是一種細(xì)胞死亡機(jī)制，對(duì)各種癌細(xì)胞具有抗癌療法的反應(yīng)[19-20]，自噬可能成為治療乳腺癌的有效途徑。在自噬過程中，LC3B和P62參與自噬體的形成，隨著自噬的進(jìn)展，LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-Ⅱ分布并積聚在自噬體的膜上，揭示了自噬狀態(tài)，LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-Ⅱ一般用于評(píng)估自噬過程，作為自噬的早期標(biāo)志物[21]。P62作為一種傳統(tǒng)的自噬受體，結(jié)合LC3B選擇性地滲入自噬體并在自噬過程中降解，P62表達(dá)減少，激活自噬;P62缺失導(dǎo)致LC3-Ⅱ形成[22]。本研究提示與對(duì)照組比較，給藥組細(xì)胞自噬因子LC3B表達(dá)上升，LC3-Ⅱ的表達(dá)水平均升高， 同時(shí)，50、100、200 nmol/L地高辛使P62表達(dá)下降，細(xì)胞的自噬活性增加。在透視電鏡下觀察，與對(duì)照組比較，給藥組形態(tài)變化，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)雙層膜的自噬體結(jié)構(gòu)，內(nèi)含待降解物的單層膜自噬溶酶體結(jié)構(gòu)。提示地高辛誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞自噬的產(chǎn)生。

綜上所述，地高辛調(diào)節(jié)凋亡蛋白的改變，損傷線粒體膜電位，抑制癌細(xì)胞的活力，促進(jìn)其凋亡，并誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，發(fā)揮抗腫瘤的作用。

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