固態(tài)聯(lián)合發(fā)酵生產(chǎn)棗渣生物飼料的工藝研究

(1.天津科技大學(xué),天津,300457；2.寧夏伊品生物科技股份有限公司，寧夏 銀川 750100)

我國(guó)紅棗產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的98%，產(chǎn)地廣泛分布于山西、陜西、寧夏、河北、新疆等地[1]。紅棗發(fā)酵酒是一種低酒精度、高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的滋補(bǔ)飲品，以紅棗為原料，經(jīng)過(guò)篩選、破碎、低溫發(fā)酵、陳釀、調(diào)制等工藝釀制而成[2]。棗渣是棗酒、棗汁生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的含有水、細(xì)胞碎片和豐富膳食纖維的副產(chǎn)物[3]。近年來(lái)，利用廢棄物進(jìn)行發(fā)酵來(lái)增加產(chǎn)品附加值已成為研究的熱點(diǎn)，如利用廢渣或廢棄木質(zhì)纖維素等[4-5]。關(guān)于廢渣的研究，如對(duì)葡萄渣、刺梨果渣、馬鈴薯渣和柑橘皮渣的利用研究已有了一定的進(jìn)展，但對(duì)棗渣的綜合利用的研究報(bào)道甚少[6-10]。酵母菌和乳酸菌作為益生菌不僅廣泛應(yīng)用于單純發(fā)酵，還應(yīng)用于以上各類廢渣的發(fā)酵中[11-13]。侯蓓等[14]使用棗渣為原料培養(yǎng)嗜酸乳桿菌，尋求嗜酸乳桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)配方。乳酸菌和酵母菌作為常見(jiàn)發(fā)酵菌種，它們之間存在著穩(wěn)定的共生關(guān)系，這種可靠的關(guān)系使得微生物對(duì)于復(fù)雜的食品系統(tǒng)具有更高的適應(yīng)性[15]。乳酸桿菌在發(fā)酵中起到產(chǎn)酸的作用，抑制雜菌生長(zhǎng)的同時(shí)還能有效改善飼料的適口性。釀酒酵母在發(fā)酵過(guò)程中可以利用底物的營(yíng)養(yǎng)成分短時(shí)間內(nèi)合成菌體蛋白[16]。因此，利用這兩種菌種混合發(fā)酵既能夠發(fā)揮乳酸菌的益生和抑菌的作用[17]，還可以生產(chǎn)相應(yīng)優(yōu)質(zhì)蛋白。

筆者使用嗜酸乳酸桿菌和釀酒酵母菌作為發(fā)酵菌種，對(duì)棗渣進(jìn)行發(fā)酵研究。對(duì)培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高單細(xì)胞蛋白含量，從而提高棗渣資源化利用價(jià)值，拓寬飼料原料來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)為試驗(yàn)室自有菌種。

1.1.2 原料與試劑

棗渣，由寧夏盛康源紅棗酒業(yè)生物科技有限公司負(fù)責(zé)提供；玉米、麩皮均為公司正常批次采購(gòu)；硫酸銨、碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀為分析純級(jí)別試劑。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵工藝及控制點(diǎn)

1) 主要原料處理：將除去核的棗渣在50 ℃下烘干48 h，粉碎，以m(棗渣)∶m(玉米)∶m(麩皮)=50∶20∶30比例混合均勻，過(guò)40目篩備用。

2) 輔助原料處理：將輔助原料以m(硫酸銨)：m(硫酸鎂)：m(磷酸二氫鉀)∶m(碳酸鈣)=1∶0.5∶1∶0.5的比例混合均勻，溶于100 g純化水中備用。

3) 發(fā)酵培養(yǎng)基配制：將主要原料和輔助原料以m(主要原料)∶m(輔助原料)=1∶1的比例混合均勻，116 ℃滅菌15 min，冷卻備用。

4) 活化接種：將嗜酸乳酸桿菌和釀酒酵母菌進(jìn)行傳代活化，至少傳代3代，將兩種菌液按m(釀酒酵母)∶m(嗜酸乳酸桿菌)=2∶1比例混合，再按每100 g培養(yǎng)基接種15 mL活化菌液的比例接入菌液。最后稱取100 g培養(yǎng)基裝入500 mL三角瓶中，充分混合均勻。

5) 發(fā)酵培養(yǎng)條件：在32 ℃恒溫的條件下，進(jìn)行普通有氧發(fā)酵84 h，每隔12 h翻動(dòng)一次。

6) 發(fā)酵產(chǎn)物處理：在45 ℃恒溫條件下，將發(fā)酵產(chǎn)物烘干至恒重，將烘干后的樣品用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)40 目篩。

1.2.2 棗渣培養(yǎng)基主要成分分析

研究所用棗渣，屬于釀酒發(fā)酵后的剩余物，營(yíng)養(yǎng)成分較低。為充分滿足微生物生長(zhǎng)需求，培養(yǎng)基中必須添加適量的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子和水。因此，對(duì)棗渣培養(yǎng)基中的主要原材料進(jìn)行水分、粗蛋白和總糖進(jìn)行檢測(cè)分析，以確定添加比例。

1.2.3 菌種考察試驗(yàn)

1) 混菌比例試驗(yàn)

嗜酸乳酸桿菌和釀酒酵母的混合比例會(huì)影響到發(fā)酵的產(chǎn)物形成，需對(duì)其最適配比進(jìn)行試驗(yàn)考察，所使用的培養(yǎng)基中各成分為m(棗渣)∶m(玉米)∶m(麩皮)∶m(硫酸銨)∶m(碳酸鈣)∶m(硫酸鎂)∶m(磷酸二氫鉀)=50∶20∶30∶1.0∶0.6∶0.4∶1.5?；炀浔纫?jiàn)表1。

表1 混菌配比Table 1 Mixed bacteria ratio

1～5號(hào)培養(yǎng)基按10%的接種量進(jìn)行接種，絕對(duì)接種量為3×107cfu/mL，6號(hào)培養(yǎng)基接種量為0，每組3個(gè)平行，在發(fā)酵條件下培養(yǎng)并進(jìn)行處理，檢測(cè)真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2) 接種量試驗(yàn)

以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，10%，15%，20%和25%的混菌接種量，分別接種至配制好的培養(yǎng)基中，每組3個(gè)平行，培養(yǎng)溫度32 ℃，恒溫培養(yǎng)時(shí)間84 h，對(duì)其真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

采用正交試驗(yàn)，對(duì)培養(yǎng)基中4種無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行考察，以發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為判斷依據(jù)，以確定最適合的培養(yǎng)基配方。

1.2.5 相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)方法

試驗(yàn)中的粗蛋白的測(cè)定采用凱氏定氮法；水分檢測(cè)采用烘箱法；總糖的測(cè)定采用DNS法[18]；真蛋白的測(cè)定采用硫酸銅沉淀法[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 棗渣培養(yǎng)基主要成分分析結(jié)果

棗渣培養(yǎng)基各主要成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)見(jiàn)表2。

表2 棗渣培養(yǎng)基各主要成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2 Mass fraction of main components of the slag medium

由表2可知：棗渣中含有未被利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)低是由于制酒過(guò)程中會(huì)消耗大量的糖和蛋白質(zhì)，致使棗渣中的糖和蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)偏低，適當(dāng)添加其他輔料可有效補(bǔ)充不足。添加玉米和麩皮能有效提高可利用糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.2 菌種考察試驗(yàn)

2.2.1 混菌比例試驗(yàn)

混菌比例對(duì)真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響見(jiàn)圖1。

圖1 混菌比例對(duì)真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.1 Effect of mixed bacteria ratio on true protein content

由圖1可看出：隨著釀酒酵母配比的提高，真蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯提高，5號(hào)配比中，當(dāng)m(釀酒酵母)∶m(嗜酸乳酸桿菌)=2∶1時(shí)，產(chǎn)物中的真蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到15.45%；4號(hào)培養(yǎng)基中當(dāng)m(釀酒酵母)∶m(嗜酸乳酸桿菌)=2∶1時(shí)，產(chǎn)物中真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)也達(dá)到15.13%。試驗(yàn)結(jié)果表明：釀酒酵母才是影響真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的主要因素,而嗜酸乳酸桿菌的影響較小，釀酒酵母與嗜酸乳桿菌的最佳混菌質(zhì)量比例為m(釀酒酵母)∶m(嗜酸乳酸桿菌)=2∶1。

2.2.2 接種量對(duì)真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

接種量對(duì)真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響見(jiàn)圖2。

圖2 接種量對(duì)真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 Effect of inoculum size on true protein content

由圖2可看出：在一定范圍內(nèi)，接種量與真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)成正比，當(dāng)接種量達(dá)到20%時(shí)，真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢(shì)，這可能是由于接種量過(guò)高，菌種生長(zhǎng)較快，出現(xiàn)了抑制作用。當(dāng)混菌接種量為15%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)到15.58%。試驗(yàn)結(jié)果表明：在相同條件下，最適的混菌接種量為15%。

2.3 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)

在最適混菌比例和接種量條件下，對(duì)硫酸銨、碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀4個(gè)影響因素進(jìn)行正交試驗(yàn)驗(yàn)證，培養(yǎng)基配方因素水平見(jiàn)表3，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4,正交試驗(yàn)方差分析見(jiàn)表5。

表3 培養(yǎng)基配方L1645正交試驗(yàn)因素水平表Table 3 Medium formula L1645 orthogonal test factor level table

表4 培養(yǎng)基配方L1645正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

表5 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)方差分析表Table 5 Medium optimization orthogonal test variance analysis

注：*表示影響較顯著。

表3中的K值是同一因素某一水平試驗(yàn)條件下，真蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測(cè)結(jié)果平均值，其下標(biāo)為對(duì)應(yīng)的水平代碼。R表示同一因素不同水平試驗(yàn)條件下，真蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測(cè)結(jié)果的極差，其值代表著某一因素對(duì)真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加的影響程度。S值表示同一因素的偏差平方和，對(duì)其進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，得到F值。查F分布數(shù)值表得到Fa值，通過(guò)比較F與Fa值大小，以確定各因素的顯著性。

由表4，5可以看出：硫酸銨影響最顯著，主次因素順序?yàn)榱蛩徜@>磷酸二氫鉀>硫酸鎂>碳酸鈣。由表4中的K值，可以比較出同一因素不同水平對(duì)真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響的程度，從而得出最優(yōu)組合為A2B3C4D3。由于最優(yōu)配方組合沒(méi)有含在表3的16組試驗(yàn)中，另外進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果真蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.1%，高于表3中最佳組合A2B3C4D2的結(jié)果。

2.4 發(fā)酵前后棗渣蛋白質(zhì)含量變化情況

綜上所述，使用最適培養(yǎng)基配方，其各組分的質(zhì)量比為：m(棗渣)∶m(玉米)∶，m(麩皮)∶m(硫酸銨)∶m(碳酸鈣)∶m(硫酸鎂)∶m(磷酸二氫鉀)=50∶20∶30∶1.0∶0.6∶0.4∶1.5；在培養(yǎng)溫度為32 ℃的條件下發(fā)酵84 h，發(fā)酵前后的真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 發(fā)酵前后棗渣真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由表6可知：使用釀酒酵母和嗜酸乳桿菌混合菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵棗渣，產(chǎn)物真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化比較明顯，發(fā)酵后比發(fā)酵前提高了5.38%。

3 結(jié) 論

筆者采用固體發(fā)酵技術(shù)，利用釀酒酵母和嗜酸乳桿菌對(duì)棗渣進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，試驗(yàn)最終確定了最佳發(fā)酵工藝為m(釀酒酵母)∶m(嗜酸乳酸桿菌)=2∶1，活化菌液的接種量為15%，培養(yǎng)基各成分最佳質(zhì)量配比為m(棗渣)∶m(玉米)∶m(麩皮)∶m(硫酸銨)∶m(碳酸鈣)∶m(硫酸鎂)∶m(磷酸二氫鉀)=50∶20∶30∶1.0∶0.6∶0.4∶1.5。在32 ℃的恒溫培養(yǎng)條件下，發(fā)酵84 h后，發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.1%，比發(fā)酵前提高了5.38%。利用釀酒酵母和嗜酸乳桿菌對(duì)廢棄棗渣進(jìn)行生物發(fā)酵處理，明顯的提高了廢棄棗渣的飼用價(jià)值。