腺苷的主要功能和發(fā)酵法生產(chǎn)研究進(jìn)展

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

腺苷是一種遍布人體細(xì)胞的內(nèi)源性嘌呤核苷物質(zhì)[1]，以其擴(kuò)充血管的功能被人們熟知，自1909年有研究者[2]從苦味酸鹽中提取出腺苷以后，其合成方法和應(yīng)用領(lǐng)域就得到了廣泛的研究。筆者將系統(tǒng)地講述腺苷的功能和發(fā)酵合成，并詳細(xì)介紹腺苷發(fā)酵法生產(chǎn)的代謝途徑、育種思路及存在的主要問(wèn)題。

1 腺苷的主要功能

1.1 作為重要中間體

腺苷可以以ATP和ADP形式進(jìn)行能量傳遞，以環(huán)磷酸腺苷(cAMP)形式進(jìn)行信號(hào)的傳導(dǎo)，也可以以cAMP作為第二信使來(lái)參與細(xì)胞癌變、增殖和反轉(zhuǎn)錄等一系列過(guò)程[1-2]。

此外，腺苷還能用于阿糖腺苷和腺嘌呤核苷酸衍生物的合成，阿糖腺苷主要用于抑制DNA，RNA類病毒活性和抗單純孢疹病毒。腺嘌呤核苷酸衍生物大多是抗菌素，如高瓜氨基腺苷、賴氨酰氨基腺苷、嘌呤霉素、腺苷乙硫氨酸、腺苷乙硫氨酸和S-腺苷蛋氨酸(SAM)等，嘌呤霉素與氨基酰tRNA結(jié)構(gòu)相似，能與正在延伸的多肽鏈結(jié)合，結(jié)合后，多肽會(huì)以肽基嘌呤霉素的形式從核糖核蛋白體上解離，從而抑制蛋白質(zhì)的合成。大多數(shù)SAM的生產(chǎn)和消耗在肝臟中進(jìn)行，超過(guò)40種的代謝反應(yīng)涉及到把甲基從SAM轉(zhuǎn)移到各種底物上，如核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物，它們是多肽合成的抑制劑，有廣譜抑菌的作用。

1.2 作用于心血管

腺苷作用于心血管時(shí)，主要副作用是導(dǎo)致室性早搏和短暫的竇性心動(dòng)過(guò)緩[4]，因此有竇性心動(dòng)過(guò)緩或房室阻病癥的患者應(yīng)慎用。腺苷在美國(guó)己經(jīng)成為FDA批準(zhǔn)的一種治療陣發(fā)性室上性心動(dòng)過(guò)速(PSVT)的一線藥物，臨床上可用于治療急性心肌梗死，PSVT，心律失常和冠狀動(dòng)脈疾病等疾病。

腺苷可以促進(jìn)血管擴(kuò)張，因此可以防止血栓的形成[4]，還能調(diào)節(jié)腎上素的分泌和心臟房室信號(hào)的傳導(dǎo)；也可以使細(xì)胞膜通透性降低，對(duì)皮內(nèi)損傷的修復(fù)以及促進(jìn)血小板的凝聚有一定作用[5]。

1.3 作用于大腦

腺苷可以用作抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)調(diào)節(jié)質(zhì)，能夠使大腦在能量的輸出和輸入過(guò)程中給出適當(dāng)信號(hào)，讓大腦的能量在兩者之間保持平衡。

當(dāng)大腦中血氧量不足時(shí)，糖原和葡萄糖快速分解產(chǎn)生的ATP可用于能量的輸出，ATP降解后生成大量的腺苷，導(dǎo)致胞內(nèi)的腺苷含量迅速上升，細(xì)胞膜的通透性會(huì)使腺苷被運(yùn)送到細(xì)胞膜外，這時(shí)細(xì)胞外液中腺苷的釋放就起到了調(diào)節(jié)作用[5]。當(dāng)血氧逐漸恢復(fù)時(shí)，胞內(nèi)的腺苷又可以合成ATP，這種調(diào)節(jié)使細(xì)胞的存活時(shí)間增長(zhǎng)。

1.4 其他功能

腺苷能夠降低腎素的分泌水平，減小腎血流量，降低腎小球的濾過(guò)率；對(duì)肺的作用包括收縮支氣管、選擇性降低肺動(dòng)脈壓和降低肺血管的阻力；在肝臟方面，腺苷能收縮肝臟血管，增加肝內(nèi)糖原分解[6]；腺苷還能抑制機(jī)體脂肪分解，增加葡萄糖吸收；在腺苷影響免疫功能方面也有報(bào)道。

2 腺苷的生物合成

生物合成法主要有RNA降解和微生物發(fā)酵兩 種方法。

2.1 RNA降解法

RNA降解法又可分為酵母RNA的化學(xué)水解、微生物RNA的自身酶解以及酵母RNA的微生物酶解[7]，其中酵母RNA酶解效率最理想。酵母RNA酶解具體步驟是：將培養(yǎng)好的酵母菌液離心、抽提、超濾，用RNA酶酶解得到4種單核苷酸的混合物，用離子交換樹脂、親和層析和密度梯度離心法等方法分離后得到磷酸腺苷，磷酸腺苷與5′-AMP反應(yīng)脫磷酸化得到腺苷。

RNA降解法曾經(jīng)是腺苷的主要生產(chǎn)方法，廣東湛江、海南?？诤透＝ㄆ翁锏鹊毓S曾用該方法生產(chǎn)腺苷，但該方法生產(chǎn)腺苷所使用的酶成本高、提純工藝復(fù)雜且產(chǎn)量有限，目前已基本淘汰。

2.2 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷是指利用物理或者化學(xué)方法處理出發(fā)菌株，改變其代謝路徑或遺傳標(biāo)記，或者通過(guò)改善發(fā)酵條件、發(fā)酵培養(yǎng)基成分等來(lái)提高腺苷產(chǎn)量。發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷的生產(chǎn)菌株有大腸桿菌、短小芽孢桿菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌。生產(chǎn)中常用枯草芽孢桿菌作為腺苷生產(chǎn)菌株?？莶菅挎邨U菌是一種好氧的產(chǎn)芽孢型革蘭氏陽(yáng)性菌，易于分離和鑒定。大部分枯草芽孢桿菌菌株具有強(qiáng)烈的單磷酸降解酶系，因此常作為核苷類物質(zhì)的生產(chǎn)菌[8]。

1930年Christman等[9]通過(guò)分解核酸得到腺苷后，腺苷的生產(chǎn)得到了廣泛的研究。發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷產(chǎn)苷量最高的是日本Haneda等[10]的研究，但是該方法中菌株退化嚴(yán)重，目前國(guó)外發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷的研究鮮有報(bào)道。國(guó)內(nèi)對(duì)腺苷的研究是近幾十年才開始的，但研究進(jìn)展較快。

2.2.1 枯草芽孢桿菌產(chǎn)苷途徑

枯草芽孢桿菌生產(chǎn)嘌呤核苷酸的途徑[11]有兩條：全合成途徑和補(bǔ)救途徑。全合成途徑也稱作從頭合成途徑，是指通過(guò)一些簡(jiǎn)單的前體物質(zhì)一步一步合成核苷酸；補(bǔ)救途徑是指從培養(yǎng)基中獲取嘌呤等物質(zhì)來(lái)進(jìn)一步合成嘌呤核苷酸的途徑。

枯草芽孢桿菌利用葡萄糖(Glu)為碳源合成腺苷[12]全合成途徑如下：

Glu經(jīng)過(guò)戊糖磷酸途徑(HMP)生成5-磷酸核糖(R5P)，R5P再經(jīng)過(guò)11步反應(yīng)才合成腺苷，其中5-磷酸核糖焦磷酸(PRPP)和肌苷酸(IMP)是所有嘌呤核苷酸合成的重要前體。IMP向下共有兩條代謝途徑，一條是IMP由腺苷琥珀酸合成酶催化合成腺苷琥珀酸(SAMP)，再經(jīng)過(guò)腺苷琥珀酸裂解酶催化生成腺嘌呤核苷酸(AMP)，AMP經(jīng)5-核苷酸酶作用生成腺苷；另一條途徑是IMP通過(guò)肌苷酸脫氫酶催化生成黃嘌呤核苷酸(XMP)，XMP再經(jīng)過(guò)鳥苷酸合成酶催化后生成鳥嘌呤核苷酸(GMP)，GMP分解為鳥苷(GR)。同時(shí)，AMP和GMP可分別通過(guò)腺苷酸脫氫酶和鳥苷酸還原酶的作用生成IMP。這3種核苷酸均可以在5-核苷酸酶的作用下脫磷酸形成核苷。

2.2.2 枯草芽孢桿菌產(chǎn)腺苷育種思想

菌種選育過(guò)程中可以根據(jù)其合成途徑，有目的地進(jìn)行代謝控制育種，可以用5個(gè)字進(jìn)行概括，即進(jìn)、通、節(jié)、堵和出。具體來(lái)說(shuō)，是通過(guò)采取增加前體物質(zhì)、消除自身反饋?zhàn)饔?、切斷代謝支流、解除相關(guān)酶的抑制作用和阻斷產(chǎn)物的分解等手段，選育營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株、滲漏型菌株和抗性菌株[13-14]或者關(guān)鍵酶缺失菌株，使能量和物質(zhì)盡量多地通向目的產(chǎn)物。

產(chǎn)腺苷枯草芽孢桿菌代謝途徑中可通過(guò)以下方法增強(qiáng)腺苷的合成：1) 外源加入PRPP和次黃嘌呤等前體物質(zhì)；2) 選育黃嘌呤或鳥嘌呤營(yíng)養(yǎng)缺陷型；3) 切斷IMP向XMP的分支代謝通路；4) 降低腺苷酸脫氨酶活性；5) 選育抗腺苷結(jié)構(gòu)類似物菌株。此外，改變細(xì)胞膜的通透性可以消除腺苷(酸)對(duì)琥珀酸腺苷酸合成酶的反饋抑制[15]，因此改變細(xì)胞膜的通透性也是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。

目前腺苷產(chǎn)菌菌株大多是經(jīng)過(guò)化學(xué)或者物理誘變所得，再使用一般的誘變劑處理很難篩選出更高產(chǎn)量的菌株，所以今后研究者可以考慮使用新的誘變手段，提高誘變效率。

通過(guò)基因工程手段改善腺苷產(chǎn)生菌也有報(bào)道，任韶霞等[16-17]通過(guò)基因敲除提高了腺苷產(chǎn)量?；蚯贸夹g(shù)主要應(yīng)用于兩個(gè)方面：1)通過(guò)基因的功能分析，為改造提供直接有效的證據(jù)；2)應(yīng)用于生物育種[18]上，基因敲除技術(shù)與代謝工程相結(jié)合，通過(guò)引入突變位點(diǎn)或阻斷某種代謝支路，定向改變目的產(chǎn)物的質(zhì)量和產(chǎn)量，也能增強(qiáng)細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性，從而達(dá)到生物育種的目的。

2.2.3 枯草芽孢桿菌產(chǎn)腺苷參數(shù)控制

生產(chǎn)菌株的選育和系統(tǒng)優(yōu)化是腺苷發(fā)酵的關(guān)鍵，任何菌株都必須落實(shí)到反應(yīng)器水平的發(fā)酵控制才能最終應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。國(guó)內(nèi)發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷的研究主要以具有單磷酸降解酶的肌苷產(chǎn)生菌枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株[7]，柏建新等[19]于2003年通過(guò)NTG和DES等誘變選育8-氮雜鳥嘌呤抗性突變株，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)苷量達(dá)12.05 g/L；施慶珊等[20]在2005年對(duì)枯草芽孢桿菌HJ-9進(jìn)行UV結(jié)合LiCl等誘變，得到8-氮黃嘌呤抗性菌株，搖瓶產(chǎn)量為16.3 g/L；王紅連等[21]于2007年在22 L發(fā)酵罐中流加酵母膏和葡萄糖，其產(chǎn)量達(dá)18.2 g/L；2012年劉劍等[22]用50 L發(fā)酵罐控制溶氧(DO)，產(chǎn)苷量達(dá)20.1 g/L；2015年劉國(guó)生[13]采用N離子注入和DES誘變，得到腺苷高產(chǎn)菌株B.subtilisDI4-24，搖瓶產(chǎn)量高達(dá)16.37 g/L，500 L發(fā)酵罐放大，產(chǎn)苷量高達(dá)28.9 g/L。近年來(lái)通過(guò)基因工程手段[15-18]改善腺苷的研究也有所報(bào)導(dǎo)。2017年任韶霞等[17]以B.subtilisDI4-24的退化菌株B.subtilisDI4-24R為出發(fā)菌株，進(jìn)行ARTP誘變處理得到B.subtilisAR-27，搖瓶產(chǎn)苷量達(dá)16.12 g/L。

除了優(yōu)良的生產(chǎn)菌株，發(fā)酵條件的控制對(duì)腺苷的生產(chǎn)也至關(guān)重要[23]，甚至成為生產(chǎn)上影響產(chǎn)苷的主要因素。發(fā)酵生產(chǎn)主要控制點(diǎn)為培養(yǎng)基配比[23-24](碳氮源和無(wú)機(jī)鹽)、溫度、pH值、通氣量[25]、轉(zhuǎn)速、DO[22-25]和表面活性劑[26]等。

碳源和氮源是影響微生物生長(zhǎng)和繁殖的重要因素。碳源主要影響菌株的生長(zhǎng)，一般使用速效碳源葡萄糖提高菌株的生長(zhǎng)速率，發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)初糖質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致底物抑制現(xiàn)象，不利于菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的形成，流加葡萄糖是一種不錯(cuò)的選擇。氮源[24]不僅影響菌株的生長(zhǎng)還會(huì)對(duì)產(chǎn)苷周期產(chǎn)生作用。培養(yǎng)基中有多種氮源時(shí)，菌株會(huì)二次生長(zhǎng)。腺苷發(fā)酵培養(yǎng)基中同時(shí)加入玉米漿、豆餅粉水解液和酵母粉。酵母粉屬于遲效氮源，適量添加酵母粉可以延長(zhǎng)產(chǎn)苷周期從而提高產(chǎn)苷量。溫度主要影響酶活性和細(xì)胞膜的流動(dòng)性。

pH除了影響酶活和細(xì)胞膜流動(dòng)性還會(huì)影響細(xì)胞膜的通透性，從而影響某些物質(zhì)的吸收和釋放。產(chǎn)腺苷的枯草芽孢桿菌多屬于好氧菌，但枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)苷階段的最佳需氧量不同，DO過(guò)高會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵后期菌體活力降低，而DO過(guò)低會(huì)影響發(fā)酵前期菌體的生長(zhǎng)，因此控制DO對(duì)提高腺苷產(chǎn)量至關(guān)重要[25]。有報(bào)道[22]稱以DO為反饋指標(biāo)，流加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，當(dāng)發(fā)酵液中底物消耗到一定范圍時(shí)，細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺失，耗氧能力下降，導(dǎo)致DO迅速上升，但是，通過(guò)補(bǔ)加底物，細(xì)胞再次利用基質(zhì)，DO又開始下降，通過(guò)這種方式可以維持DO在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平。王超明等[24]通過(guò)兩階段控制DO和pH，使腺苷產(chǎn)量明顯增加，說(shuō)明在菌株生長(zhǎng)和生產(chǎn)階段分別調(diào)節(jié)是很有效的。

高淑紅等[26]研究了非離子表面活性劑Tween 80、陽(yáng)離子表面活性劑CTAB和陰離子表面活性劑SDS對(duì)芽孢桿菌ATCC21616的腺苷合成和菌體生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)表面活性劑對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)影響的順序是Tween 80

3 結(jié) 論

發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷具有生產(chǎn)成本低、反應(yīng)條件溫和、原材料廣泛等優(yōu)點(diǎn)，但在生產(chǎn)中也存在一些瓶頸。發(fā)酵法產(chǎn)腺苷產(chǎn)量提高有限，高產(chǎn)菌株多次傳代后，產(chǎn)腺苷性能極易下滑，主要原因是菌株的某些遺傳標(biāo)記不能夠穩(wěn)定傳代，培養(yǎng)或保種條件的不當(dāng)造成菌種回復(fù)突變，從而導(dǎo)致產(chǎn)量下降。打破腺苷生產(chǎn)中的瓶頸，腺苷的市場(chǎng)前景將會(huì)更美好。