酸性乳飲料專用型黃原膠的研究與制備

(山東阜豐發(fā)酵有限公司，山東 臨沂 276600)

酸性乳飲料酸甜適中，爽滑可口，既具備了酸奶的特殊風味，又包含了酸奶的大部分營養(yǎng)成分和功能，且價格便宜，深受廣大消費者的喜愛。為滿足消費者對酸性乳飲料日益增長的需求，乳制品企業(yè)致力于開發(fā)形式多樣的酸性乳飲料產(chǎn)品。但是由于酪蛋白在酸性乳飲料生產(chǎn)過程中易聚合，導致產(chǎn)品在貯存過程中發(fā)生分層、絮凝，帶來蛋白質(zhì)沉淀問題，影響產(chǎn)品品質(zhì)[1]，給生產(chǎn)廠家?guī)砗艽蟮睦_，一直制約著酸性乳飲料產(chǎn)品的生產(chǎn)和開發(fā)。

添加穩(wěn)定劑可以有效解決酸性乳飲料中蛋白質(zhì)絮凝沉淀的問題。其中，應用最廣泛的穩(wěn)定劑是CMC[2]，單獨使用CMC可以達到產(chǎn)品穩(wěn)定的效果，但產(chǎn)品的口感和風味欠佳，加入黃原膠可以給產(chǎn)品帶來更爽滑的口感，但黃原膠與CMC復配導致產(chǎn)品穩(wěn)定性波動很大[3]，限制了黃原膠在酸性乳飲料行業(yè)中的應用。目前，尚未見通過改性黃原膠，使其與CMC復配使用得到穩(wěn)定性好、口感好的酸性乳飲料的文獻資料報道。筆者通過對復配穩(wěn)定性好的酸性乳飲料專用型黃原膠(下稱專用型)和普通黃原膠進行各項指標的檢測，找到了二者之間的差別；通過改變發(fā)酵和提取工藝，達到對黃原膠進行改性處理的目的；得到的黃原膠與CMC復配應用于酸性乳飲料中，不會出現(xiàn)產(chǎn)品分層和絮凝沉淀的現(xiàn)象，使產(chǎn)品穩(wěn)定性得到了很大的改善。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃原膠：市售普通型和專用型。分別編號為US-01，US-02，F(xiàn)R-01，F(xiàn)R-02，CN-01和CN-02。其中US為美國產(chǎn)，F(xiàn)R為法國產(chǎn)，CN為國產(chǎn)。US-01和FR-01為酸性乳飲料專用型黃原膠，其他為普通黃原膠。

菌種：甘藍黑腐病黃單胞菌；KCl，NaOH，CaCO3和鹽酸均購于天津恒興化學試劑制造有限公司；食品級乙醇(體積分數(shù)為95%)、葡萄糖、脫脂奶粉、羧甲基纖維素鈉(CMC)、山梨酸鉀、檸檬酸均為市售普通食品和食品添加劑、加工助劑；蛋白胨、酵母粉、瓊脂等購自國藥集團。

1.2 儀器與設備

HPLC，美國安捷倫公司；原子吸收光譜儀，北京普析通用儀器有限公司；電子天平，梅特勒-托利多(METTLER TOLEDO)；pH計，上海雷磁科技有限公司；恒溫培養(yǎng)箱、搖床：上海一恒儀器有限公司；Brookfield黏度計，美國Brookfield公司；立式壓力蒸汽滅菌器、電熱鼓風干燥箱：上海博訊實業(yè)有限公司；其他實驗儀器購自蜀牛玻璃儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃原膠特殊基團(丙酮酸和乙?；?質(zhì)量分數(shù)測定

丙酮酸質(zhì)量分數(shù)的測定參考GB 1886.41—2015《食品安全國家標準 食品添加劑 黃原膠》中丙酮酸質(zhì)量分數(shù)的測定方法；乙?；|(zhì)量分數(shù)的測定參考文獻[4]中的方法；對黃原膠進行處理，獲得試樣進行液相分析。

1.3.2 金屬離子含量測定

鉀和鈉離子質(zhì)量分數(shù)的測定參照GB 5009.91—2017《食品安全國家標準 食品中鉀、鈉的測定》中第一法；鎂離子質(zhì)量分數(shù)的測定參照GB 5009.241—2017《食品安全國家標準 食品中鎂的測定》中第一法；鈣離子質(zhì)量分數(shù)的測定參照GB 5009.92—2016《食品安全國家標準 食品中鈣的測定》中第一法。

1.3.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

將冷凍菌種活化后接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)20 h，按5%的接種量(體積分數(shù))接入250 mL搖瓶中(瓶內(nèi)加60 mL原始發(fā)酵培養(yǎng)基[5])，搖床轉(zhuǎn)速250 r/min，30 ℃培養(yǎng)72 h。以原始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，應用單因素優(yōu)化方法，以發(fā)酵液產(chǎn)膠率(每千克發(fā)酵液獲得的黃原膠干物質(zhì)質(zhì)量)、發(fā)酵液黏度、Ca2+質(zhì)量分數(shù)為指標對CaCO3的添加量進行優(yōu)化。CaCO3的添加量分別設定為0，0.1‰，0.2‰，0.3‰，0.4‰和0.5‰(以培養(yǎng)基計)。采用NaOH調(diào)節(jié)pH。

1.3.4 提取過程優(yōu)化

采用乙醇沉淀的方式對黃原膠進行提取。因為需要在酸性環(huán)境下將丙酮酸去除，故在單因素實驗中將條件假設為pH 4.0，溫度40 ℃，時間2 h；保溫完成后，將黃原膠倒出，加入1 000 mL乙醇，用NaOH溶液將pH調(diào)整為中性；對黃原膠進行沉淀后，將沉淀撈出，加入500 mL乙醇進行洗滌；洗滌完成后，得到纖維狀黃原膠，將黃原膠烘干、粉碎、過80目篩。

1) 單因素實驗

按照表1的水平對提取發(fā)酵液進行單因素實驗，對獲得產(chǎn)品按照1.3.1進行丙酮酸質(zhì)量分數(shù)測定。

表1 單因素試驗因素水平表Table 1 Single factor test level table

2) 正交實驗

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，對提取過程進行各因素進行正交優(yōu)化，設計三因素三水平正交實驗，如表2所示。

表2 三因素三水平正交實驗表Table 2 Three-factor and three-level orthogonal test table

1.3.5 最終產(chǎn)品的驗證

將獲得的最終產(chǎn)品加入到酸性乳飲料的配方中。在做實際測試時，可以將黃原膠單獨去除以測定CMC對酸性乳飲料穩(wěn)定性的影響。酸性乳飲料樣品制備好后，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)穩(wěn)定1 d后，對產(chǎn)品進行離心沉淀測試。

離心沉淀測試：在產(chǎn)品貯藏1 d后，對產(chǎn)品進行離心沉淀測試。稱取40 g樣品到離心管中，常溫下以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)10 min，倒出上層液體，再將離心管倒置5 min后稱重。每個樣品進行3次平行測定，離心沉淀率取平行測定的平均值。

離心沉淀率的計算公式為

式中：m1為樣品質(zhì)量；m2為離心后沉淀的質(zhì)量。

離心沉淀率越大時，產(chǎn)品越不穩(wěn)定。一般認為產(chǎn)品離心沉降率在1%以內(nèi)比較穩(wěn)定，大于1%則不夠穩(wěn)定，該值越大產(chǎn)品越不穩(wěn)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃原膠特殊基團(丙酮酸和乙?；?質(zhì)量分數(shù)分析

在酸性乳飲料調(diào)酸過程中，當酪蛋白帶負電荷較少時，酪蛋白就會和黃原膠發(fā)生絡合作用，絡合的強度受黃原膠的電荷密度及分子構(gòu)象影響[3]。因此，不同來源黃原膠在產(chǎn)品中具有不同的電荷密度和分子構(gòu)象，和酪蛋白絡合的強度不同，從而使酸性乳飲料產(chǎn)品具有不同的穩(wěn)定性。丙酮酸基團和乙?；屈S原膠分子中的特殊基團，其質(zhì)量分數(shù)顯著影響黃原膠的溶液特性。其中，丙酮酸基團質(zhì)量分數(shù)決定了黃原膠的電荷密度，且黃原膠中丙酮酸基團和乙?；|(zhì)量分數(shù)對黃原膠溶液的構(gòu)象轉(zhuǎn)變溫度有一定的影響。實驗中6種不同來源黃原膠的丙酮酸和乙?；|(zhì)量分數(shù)測試結(jié)果如表3所示。

表3 6種不同來源黃原膠丙酮酸和乙?；|(zhì)量分數(shù)

由表3可知：專用型黃原膠(US-01和FR-01)的丙酮酸質(zhì)量分數(shù)在3.2%左右，而普通型黃原膠的丙酮酸均在4.9%以上。專用型黃原膠丙酮酸質(zhì)量分數(shù)相較普通黃原膠低35%以上，兩者的乙?；|(zhì)量分數(shù)相差不大，僅CN樣品的乙?；|(zhì)量分數(shù)明顯低于其他產(chǎn)品，可能是發(fā)酵條件和菌種不同造成的。因此可以認為丙酮酸質(zhì)量分數(shù)是黃原膠影響酸性乳飲料穩(wěn)定性的因素之一。

2.2 金屬離子質(zhì)量分數(shù)分析

在黃原膠的生物合成中，碳源和無機鹽是影響黃原膠分子量最顯著的因素[6]。主要通過在培養(yǎng)基中通過添加無機鹽的方式來引入Ca2+，Mg2+，K+和Na+等離子，這些離子的引入會對產(chǎn)品的生物合成速率和終產(chǎn)品的性能(分子量、黏度和耐熱性等)有較大的影響。其中，Ca2+可以作為聚合酶的促進因子，提高聚合酶的活性，從而提高黃原膠分子的聚合度和分子量[7-8]；Mg2+是多種激酶和合成酶的激活劑；K+和Na+則是黃單胞菌細胞膜上鈉鉀泵的組成成分，該泵對膜上離子的通透性有顯著的影響，它有助于細胞中大分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運，既有助于將黃原膠生物合成的能量和前體物質(zhì)葡萄糖轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，也有助于將黃原膠的生物合成的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)出胞外，從而對黃原膠的生物合成產(chǎn)生顯著影響。6種不同來源黃原膠中Ca2+，Mg2+，K+和Na+質(zhì)量分數(shù)測試結(jié)果如表4所示。

表4 6種不同來源黃原膠中Ca2+，Mg2+，K+和Na+質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果

由表4可知：不同來源黃原膠中金屬離子質(zhì)量分數(shù)之間最大的差異是專用型黃原膠(US-01和FR-01)含有比較低的Ca2+和較高的Na+，其中Ca2+平均比其他產(chǎn)品低96.36%，Na+平均比其他產(chǎn)品高8.15倍，其它離子的質(zhì)量分數(shù)很小。由此推測Ca2+殘留可能會導致酸性乳飲料產(chǎn)品中酪蛋白的沉淀。因而不同來源黃原膠樣品中Ca2+質(zhì)量分數(shù)差異也許會導致酸性乳飲料產(chǎn)品具有不同的穩(wěn)定性。而Na+和Ca2+質(zhì)量分數(shù)成反比趨勢，可能是采用含鈉物質(zhì)代替含鈣物質(zhì)作為解決發(fā)酵過程控制pH的方案造成的。

因此，筆者認為專用型黃原膠和普通型黃原膠的主要差異為專用型的Ca2+和丙酮酸質(zhì)量分數(shù)與普通型的黃原有所區(qū)別。根據(jù)這些區(qū)別，可以在發(fā)酵提取過程中對Ca2+的添加量和丙酮酸脫除條件進行優(yōu)化處理。

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

在實際生產(chǎn)過程中，Ca2+的來源主要是在發(fā)酵過程中CaCO3的添加。在黃原膠發(fā)酵過程中，CaCO3不僅可以作為緩沖劑調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中產(chǎn)品pH，防止pH下降過快，從而控制細胞的生長。因此生產(chǎn)過程中，可以在保證產(chǎn)量的前提下，通過發(fā)酵過程中減少CaCO3的添加量，達到減少Ca2+的目的。

其他因素不變，僅優(yōu)化CaCO3的添加量(以發(fā)酵液質(zhì)量計)，以產(chǎn)膠率、發(fā)酵液黏度、Ca2+含量為指標進行優(yōu)化，結(jié)果如圖1～3所示。

圖1 不同CaCO3添加量與產(chǎn)膠率的關(guān)系Fig.1 Relationship between the amount of CaCO3 added and the amount of xanthan gum produced

圖2 不同CaCO3添加量與發(fā)酵液黏度的關(guān)系Fig.2 The relationship between different CaCO3addition and fermentation broth viscosity

圖3 不同CaCO3添加量與終產(chǎn)品中鈣離子質(zhì)量分數(shù)的關(guān)系Fig.3 Relationship between the amount of different CaCO3 added and the calciumion weight content of the final product

由圖1～3可知：隨著CaCO3添加量的增加，產(chǎn)膠率、發(fā)酵液黏度和Ca2+質(zhì)量分數(shù)均有所提高，其中產(chǎn)膠率先增長，在CaCO3添加量為0.2‰時達到最大后平衡；而發(fā)酵液黏度在CaCO3添加量為0.2‰時達到最大增幅，然后緩慢爬升，可能的原因是隨著Ca2+的添加，黃原膠分子之間締合，使發(fā)酵液黏度增大。從Ca2+質(zhì)量分數(shù)來看，在0.2‰添加量時，Ca2+質(zhì)量分數(shù)為0.08%，符合前面提到的酸性乳飲料專用型黃原膠的0.09%左右的鈣離子質(zhì)量分數(shù)的要求。

2.4 提取過程優(yōu)化

2.4.1 單因素實驗

pH單因素實驗：如圖4所示，隨著pH的下降，丙酮酸質(zhì)量分數(shù)呈先下降后平穩(wěn)的趨勢，在pH 4.0時達到最低點，此時黃原膠中丙酮酸質(zhì)量分數(shù)為3.92%。

圖4 提取液pH對黃原膠中丙酮酸質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.4 Effect of extract pH on pyruvic acid weight content in xanthan gum

溫度單因素實驗：如圖5所示，隨著溫度的升高，丙酮酸質(zhì)量分數(shù)呈先下降后平穩(wěn)的趨勢，但下降幅度沒有pH影響大。在60 ℃時達到最小值，此時黃原膠的丙酮酸質(zhì)量分數(shù)為3.62%。

圖5 提取液保溫溫度對黃原膠中丙酮酸質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.5 Effect of incubation temperature of extract on pyruvic acid weight content in xanthan gum

時間單因素實驗：如圖6所示，隨著時間的延長，丙酮酸質(zhì)量分數(shù)呈先下降后平穩(wěn)的趨勢，但下降幅度沒有pH和溫度影響大。在4 h時達到最小值，此時黃原膠的丙酮酸質(zhì)量分數(shù)為3.49%。

圖6 提取液保溫時間對黃原膠中丙酮酸質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.6 Effect of incubation time of extract on pyruvateweight content in xanthan gum

通過以上單因素實驗可以看出：pH，溫度和時間三者與丙酮酸質(zhì)量分數(shù)的下降均存在關(guān)聯(lián)，但下降的程度不一，并且均沒有達到檢測要求的3.2%，因此對三者進行正交實驗，繼續(xù)優(yōu)化實驗條件。

2.4.2 正交實驗

以丙酮酸質(zhì)量分數(shù)為指標，對三因素三水平正交實驗表進行數(shù)據(jù)處理，如表5所示。由表5可知：R(pH)>R(溫度)>R(時間)，因此在變化的水平范圍內(nèi)，pH對結(jié)果的影響最大，其次是溫度，而時間的影響最小。對于實驗指標，丙酮酸的質(zhì)量分數(shù)越小越好，因此由K值可知：K3(pH)

表5 以丙酮酸含量指標因素水平數(shù)據(jù)處理表

根據(jù)最優(yōu)化實驗方案，對該實驗進行重復，結(jié)果基本一致。重復優(yōu)化后，最終丙酮酸質(zhì)量分數(shù)為3.12%，符合檢測結(jié)果3.2%左右的要求。

2.5 終產(chǎn)品驗證結(jié)果

通過離心沉淀率指標，可以看出酸性乳飲料中蛋白質(zhì)的沉降情況。優(yōu)化后的黃原膠樣品加入酸性乳飲料的離心沉降率如表6所示。

表6 優(yōu)化后黃原膠加入酸性乳飲料中離心沉淀率

由表6可知：優(yōu)化后的產(chǎn)品離心沉淀率和僅加入CMC的樣品相比明顯降低，產(chǎn)品穩(wěn)定性明顯增強，同時優(yōu)化后的產(chǎn)品離心沉淀率明顯比專用型的樣品要低。

3 結(jié) 論

酸性乳飲料是近年來發(fā)展比較迅速的飲料產(chǎn)品，但其含有的酪蛋白在酸性條件下極易絮凝沉淀，因此需要添加穩(wěn)定劑。而黃原膠能給其帶來良好的口感，由于黃原膠無法單獨穩(wěn)定體系，需要和CMC進行復配使用，不同的黃原膠產(chǎn)品復配后體系穩(wěn)定性不同。通過對不同黃原膠的各項指標進行測定，找到了酸性乳飲料專用型黃原膠和普通型黃原膠的主要差異為專用型Ca2+質(zhì)量分數(shù)和丙酮酸質(zhì)量分數(shù)都低于普通型的黃原膠。通過發(fā)酵體系的單因素優(yōu)化，尋找到了最佳的CaCO3添加量為0.2‰。通過在提取過程采用正交實驗優(yōu)化，在pH 3.5，溫度70 ℃，時間4 h獲得黃原膠丙酮酸質(zhì)量分數(shù)為3.12%。最終加入改性黃原膠的酸性乳飲料，穩(wěn)定性較好，使風味和穩(wěn)定性均得到了保障。