茶樹CsMDHAR基因的克隆與非生物脅迫響應(yīng)分析

林士佳，李輝，劉昊，滕瑞敏，劉婧愉，王爽，莊靜

茶樹基因的克隆與非生物脅迫響應(yīng)分析

林士佳，李輝，劉昊，滕瑞敏，劉婧愉，王爽，莊靜*

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，茶葉科學(xué)研究所，江蘇 南京 210095

基于茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以龍井43茶樹cDNA為模板，克隆得到開放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度為1?305?bp，編碼434個(gè)氨基酸的茶樹單脫氫抗壞血酸還原酶基因，命名為。蛋白序列特征和基因表達(dá)模式分析表明，CsMDHAR蛋白含有FAD結(jié)合功能域，屬于FAD依賴的吡啶核苷酸-硫基氧化還原酶（Pyr-redox-2）家族。該蛋白有兩個(gè)無序化區(qū)域，而且包含有32個(gè)磷酸化位點(diǎn)，理論相對(duì)分子量為47.21?kDa，為5.99，屬于親水性蛋白；CsMDHAR蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和隨機(jī)卷曲為主。通過PlantCARE和PLACE對(duì)啟動(dòng)子上游調(diào)控元件進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，基因啟動(dòng)子上游1?000?bp中含有多個(gè)與光、激素以及植物抗逆有關(guān)的順式作用元件。利用熒光定量PCR方法檢測(cè)龍井43和迎霜的、和在4種不同非生物脅迫下的表達(dá)水平，結(jié)果表明，在低溫（4℃）脅迫下，兩個(gè)茶樹品種的、和的表達(dá)均受抑制，且品種間的差異較小；在高溫（38℃）和干旱（200?g·L-1PEG）脅迫下龍井43中的表達(dá)均上調(diào)，分別在8?h和2?h時(shí)達(dá)到最大值，為對(duì)照的1.49倍和1.85倍；鹽（200?mmol·L-1NaCl）脅迫下，和在兩種茶樹品種中的表達(dá)量變化趨勢(shì)相似，但變化幅度不同，可能與品種間不同的抗逆性有關(guān)。

茶樹；；抗壞血酸；非生物脅迫；啟動(dòng)子元件分析；表達(dá)分析

茶樹[(L.) O. Kuntze]作為葉用植物，含有豐富的茶多酚、茶多糖、抗壞血酸等成分，經(jīng)常飲茶不僅可以提高機(jī)體的抗衰老、抗氧化能力，同時(shí)對(duì)解油膩、消食利尿也有較好的作用[1]。在自然生長(zhǎng)發(fā)育過程中，茶樹會(huì)受到不同環(huán)境條件（高低溫、干旱和高鹽等）的侵害，從而影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。環(huán)境脅迫會(huì)導(dǎo)致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）在細(xì)胞內(nèi)大量積累，引起氧化脅迫，危害植物個(gè)體的生長(zhǎng)和發(fā)育，甚至導(dǎo)致植株死亡[3-4]。

抗壞血酸（L-ascorbic acid，AsA），即維生素C（Vc），是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的高豐度抗氧化物質(zhì)，直接參與清除逆境脅迫下植物體內(nèi)產(chǎn)生的過量活性氧[5-6]。人為提高植株的AsA含量，可提高對(duì)氧化脅迫的抵抗力，以及對(duì)其他逆境環(huán)境的抗性[7-9]。AsA的代謝主要是通過植物抗壞血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循環(huán)途徑（圖1），AsA由抗壞血酸氧化酶（Ascorbate oxidase，AO）和抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）氧化AsA生成單脫氫抗壞血酸（Monodehydroascorbate，MDHA），而單脫氫抗壞血酸還原酶（Monodehydroascobate reductase，MDHAR）又將MDHA還原生成AsA，從而調(diào)節(jié)植物AsA含量的動(dòng)態(tài)平衡。因此，MDHAR對(duì)AsA的代謝及植物抗逆起著積極作用。百合受氧化（H2O2）脅迫誘導(dǎo)而表達(dá)[10]，表明在植物清除逆境產(chǎn)生的ROS方面起著重要作用。番茄在莖和葉片等營(yíng)養(yǎng)器官中表達(dá)較高，有利于其在環(huán)境脅迫條件下維持低水平的抗壞血酸氧化還原狀態(tài)，控制體內(nèi)的ROS含量[11]；過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因番茄植株，MDHAR活性和AsA含量增大，提高植株的抗逆性[12]。此外，還參與了小麥的超敏（Hypersensitive respond，HR）反應(yīng)，在小麥與條銹病互作中發(fā)揮重要作用[13]。

注：APX：抗壞血酸過氧化物酶；AO：抗壞血酸氧化酶；MDHAR：?jiǎn)蚊摎淇箟难徇€原酶；DHAR：脫氫抗壞血酸還原酶；GR：谷胱甘肽還原酶

目前，李佼[14]已克隆出了5個(gè)茶樹AsA合成相關(guān)酶基因。龐磊[15]研究發(fā)現(xiàn)，茶樹基因家族參與了茶樹抗寒和抗旱調(diào)控機(jī)制。其中細(xì)胞質(zhì)型（）能夠受低溫誘導(dǎo)顯著上調(diào)，但被干旱所抑制。相對(duì)茶樹其他抗壞血酸代謝相關(guān)酶基因的研究，的表達(dá)及其對(duì)逆境的響應(yīng)研究尚未見報(bào)道。本文以龍井43為材料，克隆獲得茶樹基因，并對(duì)其序列、理化性質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行了分析，同時(shí)通過熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)了在龍井43和迎霜兩個(gè)茶樹品種中對(duì)4種非生物逆境（4℃、38℃、200?g·L-1PEG、200?mmol·L-1NaCl）脅迫的響應(yīng)，并且檢測(cè)了AsA循環(huán)再生途徑中另外兩個(gè)關(guān)鍵酶和對(duì)4種非生物逆境脅迫的響應(yīng)，為進(jìn)一步研究在茶樹中的生物學(xué)功能以及茶樹抗壞血酸代謝循環(huán)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所的兩年生扦插盆栽幼苗龍井43。取龍井43幼嫩葉片，提取總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為克隆模板。

另取生理狀態(tài)相似且健康的龍井43和迎霜茶樹植株分別進(jìn)行低溫（4℃）、高溫（38℃）、干旱（200?g·L-1PEG）、高鹽（200?mmol·L-1NaCl）處理，在0、2、8?h和24?h取樣。對(duì)上述所得的處理樣品，提取RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為實(shí)時(shí)熒光定量模板，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成

參照Quick RNA Isolation Kit（北京華越洋公司）試劑盒說明書提取茶樹材料的總RNA，使用Nanodrop ND 1000（上海譜元儀器有限公司）微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品濃度，RNA質(zhì)量通過1.2%凝膠電泳檢測(cè)?？俁NA反轉(zhuǎn)錄為cDNA按照Prime Script RT reagent Kit（大連TaKaRa公司）試劑盒說明書操作。

1.2.2 茶樹基因克隆

基于本課題組茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[16]，設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物CsMDHAR-F（5'-ATGGCGGAGA AGACTTTCAAG-3'）和CsMDHAR-R（5'-TCA AATCTTGCAGGCAAAGGTGA-3'）。PCR擴(kuò)增體系為20?μL，包括2×Plus Master Mix酶10?μL，ddH2O 7?μL，模板cDNA 1?μL和CsMDHAR-F/R引物各1?μL。反應(yīng)條件為95℃ 5?min；95℃ 30?s，55℃ 30?s，72℃ 60?s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10?min。采用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物后連接至pMD19-T載體上，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，最后經(jīng)篩選抽提質(zhì)粒后送至南京金瑞斯生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 茶樹序列及啟動(dòng)子序列分析

在NCBI網(wǎng)站（http://blast.ncbi.nlm.nih. gov /Blast.cgi）上，對(duì)獲得的核苷酸和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行BLAST和保守域預(yù)測(cè)。多重氨基酸序列比對(duì)選擇DNAMAN 6.0軟件（Lynnon公司）。利用MEGA 7.0[17]完成系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。氨基酸的組成及其理化性質(zhì)分析采用在線工具包SMS（http://www.bio-soft.net/sms）和ExPASy-ProtParam（http://web.expasy.org/protparam）。氨基酸序列磷酸化位點(diǎn)和折疊無序化分析使用在線軟件NetPhos和FoldIndex完成。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分別在SOPMA和Swiss-Model上進(jìn)行。通過茶樹基因組數(shù)據(jù)庫TPIA（http://tpia.teaplant.org）和TBtools軟件獲取起始密碼子上游1?000?bp序列，再利用在線分析網(wǎng)站RegSite Plant DB對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）和PLACE（https://sogo.dna.affrc. go.jp）對(duì)該基因起始密碼子前1?000?bp的序列進(jìn)行順式作用元件分析。

1.2.4 茶樹基因的表達(dá)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 CsMDHAR基因的克隆

提取二年生龍井43扦插苗嫩葉的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以CsMDHAR-F和CsMDHAR-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序。本文克隆得到的基因序列已登錄GenBank，登錄號(hào)為MN402504，該基因共編碼434個(gè)氨基酸，ORF長(zhǎng)度為1?305?bp。

2.2 CsMDHAR進(jìn)化樹分析和氨基酸序列比對(duì)

為探究茶樹CsMDHAR的進(jìn)化關(guān)系，選取擬南芥（）、葡萄（）、蘋果（）等15個(gè)物種的MDHAR氨基酸序列，與茶樹CsMDHAR氨基酸序列構(gòu)建同源進(jìn)化樹。結(jié)果表明，茶樹CsMDHAR氨基酸序列與獼猴桃（）、小果咖啡（）等物種的進(jìn)化關(guān)系較近，與大豆（）、豌豆（）等物種的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)（圖2）。對(duì)茶樹CsMDHAR氨基酸序列保守域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，CsMDHAR蛋白在6~322個(gè)氨基酸位點(diǎn)之間含有FAD結(jié)合功能域，屬于FAD依賴的吡啶核苷酸-硫基氧化還原酶（Pyr-redox-2）家族（圖3-A）。將茶樹CsMDHAR同擬南芥、葡萄等7個(gè)物種的MDHAR氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果顯示一致性達(dá)89.91%（圖3-B）。上述物種MDHAR蛋白序列均存在兩個(gè)保守的指紋序列，這兩個(gè)指紋序列涉及到與FAD或NAD（P）H的ADP結(jié)合；另外，還存在1個(gè)與FAD的黃素部分結(jié)合相關(guān)的結(jié)構(gòu)域。

圖2 茶樹CsMDHAR蛋白的進(jìn)化樹分析

2.3 CsMDHAR蛋白氨基酸的理化性質(zhì)及無序化結(jié)構(gòu)分析

運(yùn)用ExPASy-ProtParam[21]在線工具包對(duì)茶樹、擬南芥、葡萄等16個(gè)物種MDHAR蛋白的組成成分和理化性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果如表1所示，上述物種的MDHAR蛋白氨基酸殘基數(shù)為433或434，相對(duì)分子量在46.49~47.31?kDa。理論等電點(diǎn)為5.5~6.9。脂肪族氨基酸（23%）明顯高于芳香族氨基酸（10%），酸性氨基酸占比為13%，堿性氨基酸占比為12%?？偲骄杷裕℅rand average of hydropathicity）均為負(fù)值，表明MDHAR蛋白屬于親水性蛋白。利用NetPhos在線軟件對(duì)CsMDHAR蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，CsMDHAR含有12個(gè)蘇氨酸（T）磷酸化位點(diǎn)，11個(gè)絲氨酸（S）磷酸化位點(diǎn)，9個(gè)酪氨酸（Y）磷酸化位點(diǎn)。運(yùn)用FoldIndex對(duì)茶樹CsMDHAR蛋白氨基酸序列進(jìn)行折疊的無序化分析，結(jié)果表明CsMDHAR中共有2個(gè)無序化區(qū)域，無序化比例為4.38%；總體而言CsMDHAR無序化不明顯（圖4）。

注：‘—’代表與FAD的ADP結(jié)合的指紋序列；‘··’代表與NAD（P）H的ADP結(jié)合的指紋序列；‘—·’代表與FAD的黃素基團(tuán)相結(jié)合的氨基酸基序

2.4 茶樹CsMDHAR蛋白推導(dǎo)的二級(jí)結(jié)構(gòu)及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

為了進(jìn)一步研究CsMDHAR蛋白，利用SOPMA網(wǎng)站進(jìn)行茶樹CsMDHAR蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)與分析。如圖5所示，不規(guī)則卷曲是CsMDHAR的主要組成部分，占比為38.25%；而α-螺旋為27.19%，β-折疊為25.81%，β-轉(zhuǎn)角為8.76%。對(duì)CsMDHAR三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖6，其三維結(jié)構(gòu)推測(cè)與二級(jí)結(jié)構(gòu)吻合，不規(guī)則卷曲占了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的大部分區(qū)域，α-螺旋和β-折疊分散其中。

表1 不同植物中MDHAR氨基酸組成成分及理化性質(zhì)分析

Table 1 Comparison of composition and chemical characterization of amino acid sequencesof MDHAR among different plants

圖4 茶樹CsMDHAR折疊狀態(tài)分析

注：藍(lán)色：α-螺旋；紅色：β-折疊；綠色：β-轉(zhuǎn)角；粉色：不規(guī)則卷曲

圖6 茶樹CsMDHAR三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.5 CsMDHAR基因啟動(dòng)子預(yù)測(cè)與分析

利用在線網(wǎng)站TPIA和TBtools軟件檢索到起始密碼子上游1?000?bp序列，再通過RegSite Plant DB對(duì)其啟動(dòng)子進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于ATG上游–108?bp，Enhancer位于ATG上游–83?bp，該基因上游–129?bp處有一個(gè)TATA-box。為了進(jìn)一步了解的表達(dá)模式，本研究通過PlantCARE數(shù)據(jù)庫和PLACE數(shù)據(jù)庫對(duì)啟動(dòng)子上游調(diào)控元件進(jìn)行比較分析。如表2所示，除順式元件CAAT-box和TATA-box外，還預(yù)測(cè)到了光響應(yīng)元件CACTFTPPCA1、G-Box，熱激響應(yīng)元件CCAAT-box，ABA響應(yīng)元件EBOXBNNAPA，干旱響應(yīng)元件MYBCORE、MYB2CONSENSUSAT以及低溫響應(yīng)元件MYCCONSENSUSAT。

2.6 茶樹CsMDHAR對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)在茶樹品種龍井43和迎霜中在經(jīng)過低溫（4℃）、高溫（38℃）、干旱（200?g·L-1PEG）、高鹽（200?mmol·L-1NaCl）4種非生物脅迫下的表達(dá)水平（圖7）。結(jié)果表明，在上述4種非生物脅迫條件下均被誘導(dǎo)表達(dá)，但其相對(duì)表達(dá)量在不同脅迫處理和脅迫時(shí)間下存在差異。低溫脅迫下，在龍井43和迎霜中的表達(dá)趨勢(shì)均為先下降后升高，分別在2?h和8?h時(shí)達(dá)到最小值，與對(duì)照相比減少了75%和45%，基因的表達(dá)在低溫處理下品種差異不顯著（圖7-A）。高溫脅迫下，在龍井43中的表達(dá)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，在迎霜中的表達(dá)則相反；該基因的表達(dá)在38℃處理2?h和8?h時(shí)，品種差異顯著（圖7-B）。干旱脅迫下，在兩個(gè)茶樹品種中的表達(dá)差異顯著，其表達(dá)量在龍井43中先增后減，在各個(gè)處理時(shí)間下的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，且在2?h時(shí)最高，為對(duì)照組的1.85倍；而基因在迎霜中一直處于相對(duì)較低水平，在2?h時(shí)達(dá)到最低值，表達(dá)量比對(duì)照降低了75%（圖7-C）。200?mmol·L-1NaCl處理時(shí)，龍井43的基因在2?h和8?h時(shí)的表達(dá)量顯著低于對(duì)照，而在24?h時(shí)的表達(dá)量急劇升高，為對(duì)照的2.42倍，迎霜中表達(dá)顯著下降，在8?h時(shí)達(dá)到最小值（圖7-D）。

表2 CsMDHAR啟動(dòng)子區(qū)域的順式元件及其功能

注：A、B、C和D分別代表4℃、38℃、PEG和NaCl脅迫處理。不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著

2.7 茶樹CsAO和CsAPX對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)

植物體內(nèi)抗壞血酸循環(huán)代謝途徑涉及多個(gè)酶，基因編碼的單脫氫抗壞血酸還原酶是關(guān)鍵酶之一，AO和APX在該循環(huán)途徑中也發(fā)揮重要作用[12]。為了進(jìn)一步研究茶樹中抗壞血酸的代謝循環(huán)，通過熒光定量PCR檢測(cè)了和在4種非生物逆境脅迫的表達(dá)水平。低溫脅迫下（圖8-A），龍井43和迎霜的和表達(dá)量變化規(guī)律一致，的表達(dá)先下調(diào)后上調(diào)，且均在2?h達(dá)到最小值，而的表達(dá)量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。高溫處理下（圖8-B），龍井43中的和一直處于較低水平，在8?h時(shí)達(dá)最低，與對(duì)照相比分別降低了82%和90%。迎霜中表達(dá)水平顯著上調(diào)，在24?h時(shí)最高，為對(duì)照的6.49倍，迎霜中在2?h和24?h時(shí)表達(dá)相對(duì)較低，而在8?h表達(dá)水平顯著提高，為對(duì)照的2.92倍。在干旱脅迫下（圖8-C），迎霜品種的表達(dá)模式與高溫脅迫的相似，先下調(diào)后上調(diào)然后再下調(diào)，在8?h時(shí)最高，為對(duì)照的1.21倍，而龍井43的表達(dá)較低；龍井43的在8?h時(shí)表達(dá)顯著增加，為對(duì)照的6.35倍，迎霜的表達(dá)水平則隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。高溫和干旱均能誘導(dǎo)表達(dá)，且該基因在兩個(gè)品種中的表達(dá)差異顯著。高鹽脅迫下（圖8-D），兩個(gè)品種的表達(dá)量變化規(guī)律一致，先升后降，均在2?h達(dá)到最高峰。而對(duì)于，在龍井43中其表達(dá)水平下降，在迎霜中，其表達(dá)趨勢(shì)為先下調(diào)后上調(diào)，在2?h時(shí)達(dá)最低，表達(dá)量比對(duì)照減少了76%。

3 討論

AsA能直接清除植物體內(nèi)逆境脅迫下產(chǎn)生的過量活性氧，減少其對(duì)機(jī)體的傷害，是一種高豐度抗氧化物質(zhì)。而MDHAR作為AsA再生的關(guān)鍵酶，能以NADPH為電子供體，將由AsA氧化生成的MDHA催化還原為AsA，從而對(duì)AsA的代謝及植物抗逆均有重要作用[22]。本文從茶樹龍井43中克隆獲得茶樹基因，該基因共編碼了434個(gè)氨基酸，其ORF長(zhǎng)度為1?305?bp。保守域預(yù)測(cè)分析顯示CsMDHAR蛋白含有FAD結(jié)合功能域，屬于依賴FAD的吡啶核苷酸-硫基氧化還原酶（Pyr-redox-2）家族[23]。CsMDHAR存在兩個(gè)與FAD或NAD（P）H的ADP結(jié)合相關(guān)的指紋序列，以及與FAD的黃素部分結(jié)合有關(guān)的結(jié)構(gòu)域。水稻OsMDHAR的結(jié)構(gòu)與催化機(jī)制研究表明，Arg320和Tyr349殘基對(duì)其活性至關(guān)重要，其中Arg320殘基的作用是與主要的底物結(jié)合，而Tyr349殘基通過FAD介導(dǎo)電子從NAD（P）H到結(jié)合底物的轉(zhuǎn)移[24]。

注：A、B、C和D分別代表4℃、38℃、PEG和NaCl脅迫處理。不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著

基因表達(dá)活性受到其啟動(dòng)子區(qū)域的順式元件與相應(yīng)的反式作用因子的調(diào)控，因此，處于基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA順式元件在基因的表達(dá)中發(fā)揮著重要作用。為了初步了解茶樹的基因功能，本文對(duì)啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因啟動(dòng)子上除了含有典型的順式作用元件CAAT-box、TATA-box外，還含有CACTFTPPCA1、CCAAT-box、EBOXBNNAPA和MYBCORE等與信號(hào)傳遞途徑相關(guān)以及植物抗逆相關(guān)的順式作用元件，推測(cè)該基因可能參與茶樹的激素調(diào)控和環(huán)境脅迫應(yīng)答[25-26]。

在逆境脅迫下，植物通過啟動(dòng)自身的抗氧化系統(tǒng)包括增加抗氧化酶活性和非酶抗氧化劑含量（如AsA）來清除體內(nèi)多余的ROS，從而保護(hù)自身不受逆境損傷[10-11]。本研究選用龍井43和迎霜兩個(gè)茶樹材料，驗(yàn)證了抗壞血酸循環(huán)代謝途徑中關(guān)鍵酶基因、和對(duì)低溫、高溫、干旱和鹽脅迫下的響應(yīng)。結(jié)果顯示，4℃處理抑制了的表達(dá)，各個(gè)處理時(shí)間的表達(dá)量顯著低于對(duì)照，且在兩個(gè)茶樹品種間的表達(dá)不存在差異。草莓在低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平增加[27]，表明低溫對(duì)的誘導(dǎo)表達(dá)在不同物種間存在差異。在高溫和干旱脅迫下的表達(dá)模式相近，其轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，這與馬玉華的研究結(jié)果類似[28]。NaCl處理下，兩種茶樹和表達(dá)量變化趨勢(shì)相似，但變化幅度不同，可能與品種間不同的抗逆性有關(guān)。大量研究表明，不論是抑制番茄或基因的表達(dá)，還是過量表達(dá)，均能促進(jìn)番茄果實(shí)抗壞血酸的積累，提高植株的抗逆性[22,29-30]。在鹽脅迫下，植物可能通過改變AsA的氧化還原狀態(tài)來增強(qiáng)自身的抗逆能力，在茶樹龍井43中，和的表達(dá)量變化趨勢(shì)完全相反，而的表達(dá)量變化處于較穩(wěn)定的被抑制狀態(tài)，說明和在鹽脅迫下對(duì)于維持茶樹體內(nèi)AsA的含量可能發(fā)揮相對(duì)較大的作用。

本文克隆了基因并分析了其在不同逆境處理下的表達(dá)情況，同時(shí)還分析了和對(duì)逆境的響應(yīng)，初步推測(cè)基因在保護(hù)植物自身不受脅迫傷害方面發(fā)揮了一定的功能，但其在茶樹中可能存在的作用機(jī)制仍待進(jìn)一步深入研究。

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Cloning and Response Analysis of theGene Under the Abiotic Stress in

LIN Shijia, LI Hui, LIU Hao, TENG Ruimin, LIU Jingyu, WANG Shuang, ZHUANG Jing*

Tea Science Research Institute, College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

In this study, agene () was cloned fromcv. ‘Longjing 43’ based on the transcriptome data of tea plant. Sequence analysis shows that the open reading frame length ofwas 1?305?bp, encoding 434 amino acids with a molecular weight of approximately 47.21?kDa and the theoretical isoelectric point of 5.99. CsMDHAR was a hydrophilic protein, including two unordered regions and 32 phosphorylation sites. CsMDHAR belonged to Pyr-redox-2 super-family containing a highly conserved region called FAD domain, and mainly composed of α-helix and random coil. PlantCARE and PLACE database prediction analysis suggest that there were many-elements related to light, hormones and stress resistance in the 1?000?bp upstream region ofgene. The expression profiles of,andin tea cv ‘Longjing 43’ and ‘Yingshuang’ under high temperature, low temperature, drought, and salt treatments were detected by qRT-PCR. The results indicate that the expression profiles of,andwere suppressed under 4℃, and there were no significantly differences in ‘Longjing 43’ and ‘Yingshuang’. However, the expression profiles ofgene were upregulated under 38℃ or 200?g·L-1PEG treatments in ‘Longjing 43’, with the highest 2.5 and 5 times of the control at 8?h and 2?h, respectively. In addition, the expression trends ofandin both cultivars were similar under NaCl (200?mmol·L-1) treatment, but the variation ranges were different, which might be related to the different stress response in tea plant.

,, ascorbic acid, abiotic stress, promoter analysis, expression analysis

S571.1；Q52

A

1000-369X(2019)05-495-11

2019-05-08

2019-07-12

國(guó)家自然科學(xué)基金（31570691、31870681）

林士佳，女，碩士研究生，主要從事茶樹遺傳育種研究，E-mail: 2018104088@njau.edu.cn。*通信作者：zhuangjing@njau.edu.cn