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    蛹蟲草菌絲體液體發(fā)酵條件的優(yōu)化研究

    2019-10-11 14:08:24曲亮璠王祥河許勤虎史連生
    食品工程 2019年3期
    關(guān)鍵詞:裝液菌絲體蟲草

    劉 然 曲亮璠 王祥河 許勤虎 史連生

    1(天津量信檢驗認證技術(shù)有限公司,天津 300462)2(天津市工業(yè)微生物研究所有限公司,天津 300462)3(天津?qū)嵃l(fā)中科百奧工業(yè)生物技術(shù)有限公司,天津 300462)

    蛹蟲草(Cordyceps militaris)營養(yǎng)價值豐富,高蛋白,低脂肪,維生素和礦物質(zhì)含量較高,是藥食同源性真菌,在我國分布廣泛。蛹蟲草與冬蟲夏草的功效成分和藥理作用類似,其中多糖類、蟲草酸、蟲草素、超氧化物歧化酶(SOD)等功能性物質(zhì)具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能,近年來逐漸成為國內(nèi)外的研究熱點。蛹蟲草菌絲體液體發(fā)酵方法與傳統(tǒng)的人工培養(yǎng)方法不同,具有速度快、周期短、產(chǎn)量高、條件易于控制等特點,是一種新的產(chǎn)業(yè)化途徑,具有良好的商業(yè)價值和廣闊的市場空間。液體培養(yǎng)基的組分和配比以及發(fā)酵過程中pH 值、接種量、轉(zhuǎn)速、溫度等各個條件的控制對微生物菌絲體的繁殖和代謝產(chǎn)物的累積有直接的聯(lián)系。因此,若要提高蛹蟲草菌絲體的產(chǎn)量,首先要篩選出適宜發(fā)酵的培養(yǎng)基組成,再對發(fā)酵的工藝條件進行優(yōu)化。本文通過單因素、響應(yīng)面試驗,優(yōu)化了蛹蟲草液體發(fā)酵生產(chǎn)菌絲體的工藝,旨在為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ),也為開發(fā)新的保健食品、尋找新的藥食來源提供科學(xué)依據(jù)和新的思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    供試菌株蛹蟲草(Cordyceps militaris),菌種編號:CICC 14013。

    蔗糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、維生素B1、維生素B12均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    METTLER AE200 分析天平;METTLER Seven Multi pH 計;蘇州凈化SW-CJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺;日本三洋MLS-3750 高壓滅菌鍋;上海安亭GL-20G-II 高速冷凍離心機;博迅GZX-9146 MBE 數(shù)顯鼓風干燥箱。

    1.3 方法

    1.3.1 蛹蟲草液體發(fā)酵試驗

    1.3.1.1 液體種子的制備

    斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g/L,葡萄糖20 g/L,瓊脂20 g/L。

    液體種子培養(yǎng)基:蔗糖40 g/L,蛋白胨20 g/L,磷酸二氫鉀1 g/L,硫酸鎂1 g/L。

    采用500 mL 三角瓶用于液體種子培養(yǎng),接入1 cm2的斜面菌種,搖床轉(zhuǎn)速180 r/min,裝液量為200 mL,溫度22 ℃,培養(yǎng)5 d。

    1.3.1.2 發(fā)酵單因素試驗

    發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖40 g/L、蛋白胨30 g/L、硫酸鎂1.5 g/L、磷酸二氫鉀1.5 g/L、維生素B1適量、維生素B12適量。選擇常見的蛋白胨和酵母膏作為氮源,葡萄糖、蔗糖和麥芽糖作為碳源,篩選出最佳液體培養(yǎng)基成分;分別選取不同pH 值(5、6、7、8、9),不同發(fā)酵溫度(19 ℃、22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃),不同搖床轉(zhuǎn)速(130 r/min、150 r/min、170 r/min、190 r/min、210 r/min),不同接種量(2.5%、5.0%、7.5%、10.0%),不同裝液量(60 mL、80 mL、100 mL、120 mL、140 mL),以蛹蟲草發(fā)酵產(chǎn)物中的菌絲體生物量為指標,發(fā)酵過程中保證其他條件不變,搖床振蕩培養(yǎng)6 d,進行單因素試驗。

    1.3.1.3 發(fā)酵響應(yīng)面試驗

    在上述單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,進行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗,以獲得最佳發(fā)酵條件和最大菌絲體產(chǎn)量。

    1.3.2 菌絲體產(chǎn)量測定方法

    發(fā)酵產(chǎn)物中菌絲體的產(chǎn)量采用細胞干重法測定,取發(fā)酵產(chǎn)物于6 000 r/min 冷凍離心20 min,棄去上清液,用蒸餾水將菌絲體洗凈后,重復(fù)上述試驗操作,將得到的菌絲體置于60 ℃干燥箱中烘干至恒重。菌絲體產(chǎn)量按下式計算:

    式中:X——菌絲體生物量,g/L;

    W——菌絲體干重,g;

    V——取樣體積,mL。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗結(jié)果

    2.1.1 蛹蟲草發(fā)酵最適碳、氮源種類篩選

    在液體培養(yǎng)發(fā)酵中,碳源是除水分外細胞生長需要量最多的營養(yǎng)物質(zhì),為蛹蟲草生長、合成物質(zhì)提供能量,約占細胞干重的50%。氮源的基本作用是為微生物生長過程中蛋白質(zhì)以及核酸的合成提供原料。由于微生物種類不同,生理特性有所差異,所能利用的碳源、氮源品種亦不相同。采用常見的單糖、雙糖、低聚糖分別與蛋白胨和酵母膏組合,以菌絲體產(chǎn)量為判斷標準,篩選出蛹蟲草發(fā)酵的最適碳氮源。不同碳源、氮源組合對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響見表1。由表1 可知,碳源對蛹蟲草菌絲體產(chǎn)量的影響高于氮源。當蔗糖被用作發(fā)酵碳源時,菌體的生長速度更快,產(chǎn)量更高,所得菌絲體生物量高于利用葡萄糖和麥芽糖發(fā)酵所得。這可能是因為蔗糖更適合蛹蟲草生長,更容易被菌體細胞吸收和轉(zhuǎn)化。此時以蔗糖- 蛋白胨為培養(yǎng)基的蛹蟲草發(fā)酵6 d,生物量達到最大值,為25.2 g/L。

    表1 不同碳源、氮源組合對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響

    2.1.2 溫度對菌絲體產(chǎn)量的影響

    蛹蟲草菌絲體的合成和各種功效成分的累積是在菌體內(nèi)各種酶的催化條件下進行的,而酶的活性與溫度密切相關(guān)。為了達到菌絲體生長速率快、代謝速度高的目的,在發(fā)酵過程中對于溫度的控制尤為重要。不同溫度對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響如圖1 所示。

    圖1 不同溫度對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響

    由圖1 可知,蛹蟲草菌絲體在19 ℃~31 ℃范圍內(nèi)均可生長。當溫度處于19 ℃~25 ℃,菌絲體產(chǎn)量較為理想;溫度高于28 ℃,菌體產(chǎn)量顯著下降。當溫度為22 ℃時,菌絲體產(chǎn)量達到最高,為25.0 g/L。溫度過低、過高都會使菌體內(nèi)酶的活力降低、蛋白質(zhì)合成速度減慢,因此將蛹蟲草的液體發(fā)酵溫度定為22 ℃。

    2.1.3 裝液量對菌絲體產(chǎn)量的影響

    裝液量的多少可以反應(yīng)出搖瓶中的通氣量,從而影響菌體生長所需氧氣的供給和發(fā)酵過程中廢氣的排放,發(fā)酵搖瓶內(nèi)培養(yǎng)基裝液量過高或過低,都不利于蛹蟲草菌絲體的富集培養(yǎng),影響發(fā)酵結(jié)果。不同裝液量對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響如圖2所示。

    由圖2 可知,當發(fā)酵搖瓶的裝液量為100 mL時,蛹蟲草的生長情況最好,獲得的菌絲體最多,此時菌絲體產(chǎn)量達到25.4 g/L。

    2.1.4 pH 對菌絲體產(chǎn)量的影響

    過高、過低的pH 值都會影響真菌體內(nèi)多糖和蛋白質(zhì)合成過程中相關(guān)酶的活性,不利于其菌體生長。不同pH 值對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響如圖3 所示。

    由圖3 可知,隨pH 值在5~9 范圍內(nèi)變化,菌絲體的產(chǎn)量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,當pH 值為7 時,其產(chǎn)量達到最大值24.6 g/L。

    圖2 不同裝液量對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響

    圖3 不同pH 值對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響

    2.1.5 接種量對菌絲體產(chǎn)量的影響

    通過接種,可以在蛹蟲草發(fā)酵過程中為其提供生命力強、生長旺盛的種子。不同接種量對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響如圖4 所示。

    圖4 不同接種量對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響

    由圖4 可知,隨著接種量的增加,菌絲體產(chǎn)量呈先上升后下降的趨勢。其原因可能是菌株在有限的營養(yǎng)條件下,適宜的接種量可使菌絲體生長旺盛,各營養(yǎng)物質(zhì)的代謝與轉(zhuǎn)化主要流向菌絲體生長。隨后,培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分幾乎被利用完全,菌絲體達到最大生長限度,開始產(chǎn)生或外溢一些代謝副產(chǎn)物和中間體,其蛋白水解酶的活力逐漸升高,并伴隨著菌絲體自溶現(xiàn)象的產(chǎn)生,菌體產(chǎn)量降低。當接種量達到10.0%時,菌絲體產(chǎn)量略有下降。因此,蛹蟲草發(fā)酵的最佳接種量為7.5%,此時生物量為25.1 g/L。

    2.1.6 搖床轉(zhuǎn)速對菌絲體產(chǎn)量的影響

    使用搖瓶進行發(fā)酵培養(yǎng)時,搖床轉(zhuǎn)速的大小間接影響著發(fā)酵液中氧氣溶解量的多少。蛹蟲草是好氧型微生物,振蕩培養(yǎng)可以解決其發(fā)酵過程中的缺氧問題,氧氣的供應(yīng)影響著菌體生長的快慢及質(zhì)量。若轉(zhuǎn)速過快,則通氧量過大,在搖瓶相同的裝液量條件下,對蛹蟲草菌絲體的剪切力也相對較大,不利于菌體的快速增殖和延伸;若轉(zhuǎn)速過慢,則通氧量不足,剪切力過小,造成菌絲生長遲緩,菌絲體產(chǎn)量低。不同搖床轉(zhuǎn)速對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響如圖5 所示。

    圖5 不同搖床轉(zhuǎn)速對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響

    由圖5 可知,當轉(zhuǎn)速為170 r/min 時,蛹蟲草菌絲體生長速度最快,生物量達到24.9 g/L。

    2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

    根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選取pH 值、接種量、搖床轉(zhuǎn)速3 個因素,以發(fā)酵產(chǎn)物中菌絲體產(chǎn)量為指標,利用中心組合(Box-Benhnken)試驗設(shè)計原理,進行三因素三水平的響應(yīng)面試驗,其因素與水平見表2,試驗結(jié)果見表3,方差分析見表4。

    表2 響應(yīng)面試驗因素與水平

    表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

    表4 方差分析結(jié)果

    由表4 可知,此模型P<0.000 1,具有高度的顯著性,其決定系數(shù)R2為0.986 4,表明所建立的模型擬合性良好。失擬項P=0.697 9>0.05,沒有顯著性,說明試驗的誤差較小。在選擇試驗范圍內(nèi),由F 值大小確定3 個因素對蛹蟲草菌絲產(chǎn)量影響程度排序:pH(A)>轉(zhuǎn)速(C)>接種量(B)。在二次項中,AC、BC 對蛹蟲草菌絲產(chǎn)量有顯著的影響,說明AC、BC 之間存在交互作用;AB 對蛹蟲草的菌絲產(chǎn)量沒有顯著影響,表明2種因素之間沒有相互作用。響應(yīng)值的變異系數(shù)CV值為0.96%,表明試驗操作可信。根據(jù)所得數(shù)據(jù)進行回歸分析,擬合得到蛹蟲草發(fā)酵菌絲產(chǎn)量的預(yù)測值對各因素的回歸方程為:Y=28.78-1.39A- 0.31B+ 0.48C + 0.05AB - 0.48AC - 0.33BC - 1.31A2-0.66B2- 1.09C2。

    經(jīng)Design-Expert 分析,給出的最優(yōu)工藝參數(shù)如表5 所示。為了驗證模型的適用性,結(jié)合實際操作的便捷性,將上述條件調(diào)整為pH 值6.40,接種量6.50%,搖床轉(zhuǎn)速180.00 r/min,得到菌絲體產(chǎn)量為29.30 g/L,與預(yù)測可獲得的菌絲體產(chǎn)量29.4 g/L 較為接近,說回歸明模型與真實試驗值擬合度較高,能夠有效的提高蛹蟲草菌絲體產(chǎn)量。

    表5 Design-Expert 預(yù)測最優(yōu)工藝及驗證

    3 結(jié) 論

    采用常見的單糖、雙糖、低聚糖分別與蛋白胨和酵母膏組合,篩選出蛹蟲草發(fā)酵的最適碳氮源分別為蔗糖和蛋白胨。以蛹蟲草發(fā)酵產(chǎn)物中的菌絲體產(chǎn)量為指標,選取pH 值、接種量、搖床轉(zhuǎn)速3 個因素,通過中心組合(Box-Benhnken)試驗原理進行三因素三水平的響應(yīng)面試驗優(yōu)化發(fā)酵條件,得到最佳發(fā)酵工藝為pH 值6.39,接種量6.61%,搖床轉(zhuǎn)速178.07 r/min,此時菌絲體產(chǎn)量為29.40 g/L。

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