• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    蛹蟲草菌絲體液體發(fā)酵條件的優(yōu)化研究

    2019-10-11 14:08:24曲亮璠王祥河許勤虎史連生
    食品工程 2019年3期
    關(guān)鍵詞:裝液菌絲體蟲草

    劉 然 曲亮璠 王祥河 許勤虎 史連生

    1(天津量信檢驗認證技術(shù)有限公司,天津 300462)2(天津市工業(yè)微生物研究所有限公司,天津 300462)3(天津?qū)嵃l(fā)中科百奧工業(yè)生物技術(shù)有限公司,天津 300462)

    蛹蟲草(Cordyceps militaris)營養(yǎng)價值豐富,高蛋白,低脂肪,維生素和礦物質(zhì)含量較高,是藥食同源性真菌,在我國分布廣泛。蛹蟲草與冬蟲夏草的功效成分和藥理作用類似,其中多糖類、蟲草酸、蟲草素、超氧化物歧化酶(SOD)等功能性物質(zhì)具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能,近年來逐漸成為國內(nèi)外的研究熱點。蛹蟲草菌絲體液體發(fā)酵方法與傳統(tǒng)的人工培養(yǎng)方法不同,具有速度快、周期短、產(chǎn)量高、條件易于控制等特點,是一種新的產(chǎn)業(yè)化途徑,具有良好的商業(yè)價值和廣闊的市場空間。液體培養(yǎng)基的組分和配比以及發(fā)酵過程中pH 值、接種量、轉(zhuǎn)速、溫度等各個條件的控制對微生物菌絲體的繁殖和代謝產(chǎn)物的累積有直接的聯(lián)系。因此,若要提高蛹蟲草菌絲體的產(chǎn)量,首先要篩選出適宜發(fā)酵的培養(yǎng)基組成,再對發(fā)酵的工藝條件進行優(yōu)化。本文通過單因素、響應(yīng)面試驗,優(yōu)化了蛹蟲草液體發(fā)酵生產(chǎn)菌絲體的工藝,旨在為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ),也為開發(fā)新的保健食品、尋找新的藥食來源提供科學(xué)依據(jù)和新的思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    供試菌株蛹蟲草(Cordyceps militaris),菌種編號:CICC 14013。

    蔗糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、維生素B1、維生素B12均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    METTLER AE200 分析天平;METTLER Seven Multi pH 計;蘇州凈化SW-CJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺;日本三洋MLS-3750 高壓滅菌鍋;上海安亭GL-20G-II 高速冷凍離心機;博迅GZX-9146 MBE 數(shù)顯鼓風干燥箱。

    1.3 方法

    1.3.1 蛹蟲草液體發(fā)酵試驗

    1.3.1.1 液體種子的制備

    斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g/L,葡萄糖20 g/L,瓊脂20 g/L。

    液體種子培養(yǎng)基:蔗糖40 g/L,蛋白胨20 g/L,磷酸二氫鉀1 g/L,硫酸鎂1 g/L。

    采用500 mL 三角瓶用于液體種子培養(yǎng),接入1 cm2的斜面菌種,搖床轉(zhuǎn)速180 r/min,裝液量為200 mL,溫度22 ℃,培養(yǎng)5 d。

    1.3.1.2 發(fā)酵單因素試驗

    發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖40 g/L、蛋白胨30 g/L、硫酸鎂1.5 g/L、磷酸二氫鉀1.5 g/L、維生素B1適量、維生素B12適量。選擇常見的蛋白胨和酵母膏作為氮源,葡萄糖、蔗糖和麥芽糖作為碳源,篩選出最佳液體培養(yǎng)基成分;分別選取不同pH 值(5、6、7、8、9),不同發(fā)酵溫度(19 ℃、22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃),不同搖床轉(zhuǎn)速(130 r/min、150 r/min、170 r/min、190 r/min、210 r/min),不同接種量(2.5%、5.0%、7.5%、10.0%),不同裝液量(60 mL、80 mL、100 mL、120 mL、140 mL),以蛹蟲草發(fā)酵產(chǎn)物中的菌絲體生物量為指標,發(fā)酵過程中保證其他條件不變,搖床振蕩培養(yǎng)6 d,進行單因素試驗。

    1.3.1.3 發(fā)酵響應(yīng)面試驗

    在上述單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,進行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗,以獲得最佳發(fā)酵條件和最大菌絲體產(chǎn)量。

    1.3.2 菌絲體產(chǎn)量測定方法

    發(fā)酵產(chǎn)物中菌絲體的產(chǎn)量采用細胞干重法測定,取發(fā)酵產(chǎn)物于6 000 r/min 冷凍離心20 min,棄去上清液,用蒸餾水將菌絲體洗凈后,重復(fù)上述試驗操作,將得到的菌絲體置于60 ℃干燥箱中烘干至恒重。菌絲體產(chǎn)量按下式計算:

    式中:X——菌絲體生物量,g/L;

    W——菌絲體干重,g;

    V——取樣體積,mL。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗結(jié)果

    2.1.1 蛹蟲草發(fā)酵最適碳、氮源種類篩選

    在液體培養(yǎng)發(fā)酵中,碳源是除水分外細胞生長需要量最多的營養(yǎng)物質(zhì),為蛹蟲草生長、合成物質(zhì)提供能量,約占細胞干重的50%。氮源的基本作用是為微生物生長過程中蛋白質(zhì)以及核酸的合成提供原料。由于微生物種類不同,生理特性有所差異,所能利用的碳源、氮源品種亦不相同。采用常見的單糖、雙糖、低聚糖分別與蛋白胨和酵母膏組合,以菌絲體產(chǎn)量為判斷標準,篩選出蛹蟲草發(fā)酵的最適碳氮源。不同碳源、氮源組合對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響見表1。由表1 可知,碳源對蛹蟲草菌絲體產(chǎn)量的影響高于氮源。當蔗糖被用作發(fā)酵碳源時,菌體的生長速度更快,產(chǎn)量更高,所得菌絲體生物量高于利用葡萄糖和麥芽糖發(fā)酵所得。這可能是因為蔗糖更適合蛹蟲草生長,更容易被菌體細胞吸收和轉(zhuǎn)化。此時以蔗糖- 蛋白胨為培養(yǎng)基的蛹蟲草發(fā)酵6 d,生物量達到最大值,為25.2 g/L。

    表1 不同碳源、氮源組合對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響

    2.1.2 溫度對菌絲體產(chǎn)量的影響

    蛹蟲草菌絲體的合成和各種功效成分的累積是在菌體內(nèi)各種酶的催化條件下進行的,而酶的活性與溫度密切相關(guān)。為了達到菌絲體生長速率快、代謝速度高的目的,在發(fā)酵過程中對于溫度的控制尤為重要。不同溫度對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響如圖1 所示。

    圖1 不同溫度對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響

    由圖1 可知,蛹蟲草菌絲體在19 ℃~31 ℃范圍內(nèi)均可生長。當溫度處于19 ℃~25 ℃,菌絲體產(chǎn)量較為理想;溫度高于28 ℃,菌體產(chǎn)量顯著下降。當溫度為22 ℃時,菌絲體產(chǎn)量達到最高,為25.0 g/L。溫度過低、過高都會使菌體內(nèi)酶的活力降低、蛋白質(zhì)合成速度減慢,因此將蛹蟲草的液體發(fā)酵溫度定為22 ℃。

    2.1.3 裝液量對菌絲體產(chǎn)量的影響

    裝液量的多少可以反應(yīng)出搖瓶中的通氣量,從而影響菌體生長所需氧氣的供給和發(fā)酵過程中廢氣的排放,發(fā)酵搖瓶內(nèi)培養(yǎng)基裝液量過高或過低,都不利于蛹蟲草菌絲體的富集培養(yǎng),影響發(fā)酵結(jié)果。不同裝液量對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響如圖2所示。

    由圖2 可知,當發(fā)酵搖瓶的裝液量為100 mL時,蛹蟲草的生長情況最好,獲得的菌絲體最多,此時菌絲體產(chǎn)量達到25.4 g/L。

    2.1.4 pH 對菌絲體產(chǎn)量的影響

    過高、過低的pH 值都會影響真菌體內(nèi)多糖和蛋白質(zhì)合成過程中相關(guān)酶的活性,不利于其菌體生長。不同pH 值對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響如圖3 所示。

    由圖3 可知,隨pH 值在5~9 范圍內(nèi)變化,菌絲體的產(chǎn)量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,當pH 值為7 時,其產(chǎn)量達到最大值24.6 g/L。

    圖2 不同裝液量對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響

    圖3 不同pH 值對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響

    2.1.5 接種量對菌絲體產(chǎn)量的影響

    通過接種,可以在蛹蟲草發(fā)酵過程中為其提供生命力強、生長旺盛的種子。不同接種量對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響如圖4 所示。

    圖4 不同接種量對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響

    由圖4 可知,隨著接種量的增加,菌絲體產(chǎn)量呈先上升后下降的趨勢。其原因可能是菌株在有限的營養(yǎng)條件下,適宜的接種量可使菌絲體生長旺盛,各營養(yǎng)物質(zhì)的代謝與轉(zhuǎn)化主要流向菌絲體生長。隨后,培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分幾乎被利用完全,菌絲體達到最大生長限度,開始產(chǎn)生或外溢一些代謝副產(chǎn)物和中間體,其蛋白水解酶的活力逐漸升高,并伴隨著菌絲體自溶現(xiàn)象的產(chǎn)生,菌體產(chǎn)量降低。當接種量達到10.0%時,菌絲體產(chǎn)量略有下降。因此,蛹蟲草發(fā)酵的最佳接種量為7.5%,此時生物量為25.1 g/L。

    2.1.6 搖床轉(zhuǎn)速對菌絲體產(chǎn)量的影響

    使用搖瓶進行發(fā)酵培養(yǎng)時,搖床轉(zhuǎn)速的大小間接影響著發(fā)酵液中氧氣溶解量的多少。蛹蟲草是好氧型微生物,振蕩培養(yǎng)可以解決其發(fā)酵過程中的缺氧問題,氧氣的供應(yīng)影響著菌體生長的快慢及質(zhì)量。若轉(zhuǎn)速過快,則通氧量過大,在搖瓶相同的裝液量條件下,對蛹蟲草菌絲體的剪切力也相對較大,不利于菌體的快速增殖和延伸;若轉(zhuǎn)速過慢,則通氧量不足,剪切力過小,造成菌絲生長遲緩,菌絲體產(chǎn)量低。不同搖床轉(zhuǎn)速對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響如圖5 所示。

    圖5 不同搖床轉(zhuǎn)速對蛹蟲草發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的影響

    由圖5 可知,當轉(zhuǎn)速為170 r/min 時,蛹蟲草菌絲體生長速度最快,生物量達到24.9 g/L。

    2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

    根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選取pH 值、接種量、搖床轉(zhuǎn)速3 個因素,以發(fā)酵產(chǎn)物中菌絲體產(chǎn)量為指標,利用中心組合(Box-Benhnken)試驗設(shè)計原理,進行三因素三水平的響應(yīng)面試驗,其因素與水平見表2,試驗結(jié)果見表3,方差分析見表4。

    表2 響應(yīng)面試驗因素與水平

    表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

    表4 方差分析結(jié)果

    由表4 可知,此模型P<0.000 1,具有高度的顯著性,其決定系數(shù)R2為0.986 4,表明所建立的模型擬合性良好。失擬項P=0.697 9>0.05,沒有顯著性,說明試驗的誤差較小。在選擇試驗范圍內(nèi),由F 值大小確定3 個因素對蛹蟲草菌絲產(chǎn)量影響程度排序:pH(A)>轉(zhuǎn)速(C)>接種量(B)。在二次項中,AC、BC 對蛹蟲草菌絲產(chǎn)量有顯著的影響,說明AC、BC 之間存在交互作用;AB 對蛹蟲草的菌絲產(chǎn)量沒有顯著影響,表明2種因素之間沒有相互作用。響應(yīng)值的變異系數(shù)CV值為0.96%,表明試驗操作可信。根據(jù)所得數(shù)據(jù)進行回歸分析,擬合得到蛹蟲草發(fā)酵菌絲產(chǎn)量的預(yù)測值對各因素的回歸方程為:Y=28.78-1.39A- 0.31B+ 0.48C + 0.05AB - 0.48AC - 0.33BC - 1.31A2-0.66B2- 1.09C2。

    經(jīng)Design-Expert 分析,給出的最優(yōu)工藝參數(shù)如表5 所示。為了驗證模型的適用性,結(jié)合實際操作的便捷性,將上述條件調(diào)整為pH 值6.40,接種量6.50%,搖床轉(zhuǎn)速180.00 r/min,得到菌絲體產(chǎn)量為29.30 g/L,與預(yù)測可獲得的菌絲體產(chǎn)量29.4 g/L 較為接近,說回歸明模型與真實試驗值擬合度較高,能夠有效的提高蛹蟲草菌絲體產(chǎn)量。

    表5 Design-Expert 預(yù)測最優(yōu)工藝及驗證

    3 結(jié) 論

    采用常見的單糖、雙糖、低聚糖分別與蛋白胨和酵母膏組合,篩選出蛹蟲草發(fā)酵的最適碳氮源分別為蔗糖和蛋白胨。以蛹蟲草發(fā)酵產(chǎn)物中的菌絲體產(chǎn)量為指標,選取pH 值、接種量、搖床轉(zhuǎn)速3 個因素,通過中心組合(Box-Benhnken)試驗原理進行三因素三水平的響應(yīng)面試驗優(yōu)化發(fā)酵條件,得到最佳發(fā)酵工藝為pH 值6.39,接種量6.61%,搖床轉(zhuǎn)速178.07 r/min,此時菌絲體產(chǎn)量為29.40 g/L。

    猜你喜歡
    裝液菌絲體蟲草
    飼用枯草芽孢桿菌分離純化及培養(yǎng)條件優(yōu)化*
    廣州化工(2023年17期)2024-01-25 05:15:24
    蟲草素提取物在抗癌治療中顯示出巨大希望
    中老年保健(2022年2期)2022-08-24 03:20:44
    蟲草素提取物在抗癌治療中顯示出巨大希望
    Technology optimization of Medicago sativa leaf protein separation with foam fractionation
    蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選
    葡萄糖酸鈉發(fā)酵廢棄菌絲體提取殼聚糖的研究
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:25
    新型環(huán)保吸聲材料——菌絲體膠合秸稈
    安全(2015年7期)2016-01-19 06:19:39
    冬蟲夏草發(fā)酵液和菌絲體中主要核苷類成分分析
    纖維堆囊菌產(chǎn)埃博霉素B的發(fā)酵條件優(yōu)化
    擬黃薄孔菌菌絲體的固體培養(yǎng)條件及CAT和SOD活力動態(tài)研究
    少妇丰满av| 啪啪无遮挡十八禁网站| 色视频www国产| 啦啦啦韩国在线观看视频| 可以在线观看毛片的网站| 成人精品一区二区免费| 欧美高清成人免费视频www| 日本成人三级电影网站| 精品国产三级普通话版| 久久亚洲真实| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产真人三级小视频在线观看| a级毛片a级免费在线| 后天国语完整版免费观看| 国产精品永久免费网站| 一级黄色大片毛片| 欧美黄色片欧美黄色片| 欧美乱妇无乱码| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 精品人妻1区二区| 久久香蕉国产精品| 亚洲人与动物交配视频| 真人做人爱边吃奶动态| 一区二区三区高清视频在线| 九九热线精品视视频播放| 久久久国产成人免费| 欧美大码av| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲国产精品999在线| 听说在线观看完整版免费高清| 99久久国产精品久久久| 亚洲av片天天在线观看| 此物有八面人人有两片| 欧美性猛交黑人性爽| 成人午夜高清在线视频| 国产伦人伦偷精品视频| 淫秽高清视频在线观看| 久久中文字幕人妻熟女| 99久久无色码亚洲精品果冻| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产亚洲欧美98| 国产精品 欧美亚洲| 国内精品久久久久精免费| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产精品99久久99久久久不卡| 成人av一区二区三区在线看| 色在线成人网| 亚洲精品色激情综合| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 两性夫妻黄色片| 婷婷丁香在线五月| 毛片女人毛片| 99国产精品一区二区三区| 国产爱豆传媒在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 可以在线观看的亚洲视频| 欧美国产日韩亚洲一区| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 91av网一区二区| 欧美性猛交黑人性爽| 国产亚洲精品久久久com| 黄色丝袜av网址大全| 日韩国内少妇激情av| 精品人妻1区二区| 天堂√8在线中文| 日韩欧美免费精品| 日日干狠狠操夜夜爽| 禁无遮挡网站| 欧美黄色淫秽网站| 国产aⅴ精品一区二区三区波| netflix在线观看网站| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 成人国产一区最新在线观看| 精品国产三级普通话版| 淫秽高清视频在线观看| a在线观看视频网站| 在线看三级毛片| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 色老头精品视频在线观看| 好男人电影高清在线观看| www日本黄色视频网| 久久久久久大精品| 美女扒开内裤让男人捅视频| 动漫黄色视频在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧美日韩综合久久久久久 | 精品欧美国产一区二区三| 中文字幕久久专区| 日韩精品青青久久久久久| 国产三级在线视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 日本一二三区视频观看| 国产欧美日韩精品一区二区| 色在线成人网| 午夜免费激情av| 99热这里只有是精品50| 久久久久久九九精品二区国产| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲人成电影免费在线| 99国产精品一区二区三区| 热99在线观看视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 午夜久久久久精精品| 国产极品精品免费视频能看的| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲人成网站高清观看| 国产精品影院久久| 69av精品久久久久久| 黄色丝袜av网址大全| 特级一级黄色大片| 日韩人妻高清精品专区| 黄色视频,在线免费观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 日韩欧美国产在线观看| 1000部很黄的大片| 偷拍熟女少妇极品色| 老司机福利观看| 一二三四在线观看免费中文在| 国产91精品成人一区二区三区| tocl精华| 一本综合久久免费| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲成av人片免费观看| 香蕉久久夜色| 婷婷六月久久综合丁香| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 中文资源天堂在线| 热99在线观看视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 91av网一区二区| 亚洲精华国产精华精| 亚洲在线自拍视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产成人精品无人区| 最近最新中文字幕大全电影3| 成人av一区二区三区在线看| 最近视频中文字幕2019在线8| 精品久久久久久久末码| 女警被强在线播放| av黄色大香蕉| 亚洲一区二区三区色噜噜| 色综合站精品国产| 午夜福利成人在线免费观看| 老汉色∧v一级毛片| 听说在线观看完整版免费高清| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 全区人妻精品视频| 国产精品av久久久久免费| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美三级亚洲精品| 综合色av麻豆| 国产高清videossex| 午夜福利高清视频| 日韩av在线大香蕉| 波多野结衣巨乳人妻| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 麻豆av在线久日| 99热精品在线国产| 色噜噜av男人的天堂激情| 嫁个100分男人电影在线观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 黄色女人牲交| e午夜精品久久久久久久| 国产精品1区2区在线观看.| 五月玫瑰六月丁香| 少妇的丰满在线观看| 九九在线视频观看精品| 偷拍熟女少妇极品色| 伦理电影免费视频| 日本五十路高清| 免费搜索国产男女视频| 一区二区三区国产精品乱码| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产成人aa在线观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 欧美一级毛片孕妇| 久久久久久人人人人人| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美日本视频| 岛国视频午夜一区免费看| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 听说在线观看完整版免费高清| 国产精品永久免费网站| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲中文日韩欧美视频| 婷婷六月久久综合丁香| 美女高潮的动态| 女同久久另类99精品国产91| 偷拍熟女少妇极品色| 国产 一区 欧美 日韩| 日本五十路高清| 又大又爽又粗| 一本综合久久免费| 国产黄a三级三级三级人| 91麻豆av在线| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 精品久久久久久久末码| 国产免费男女视频| 成年女人永久免费观看视频| 国产高清videossex| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 又大又爽又粗| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久精品国产清高在天天线| 精品一区二区三区四区五区乱码| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 日本免费a在线| 亚洲在线自拍视频| 久久久成人免费电影| 美女 人体艺术 gogo| 国语自产精品视频在线第100页| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 成人亚洲精品av一区二区| ponron亚洲| 天天躁日日操中文字幕| 成人永久免费在线观看视频| 十八禁网站免费在线| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲精品在线观看二区| 久9热在线精品视频| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲无线在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲国产色片| 国产亚洲av高清不卡| 成在线人永久免费视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 99视频精品全部免费 在线 | 成年女人看的毛片在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产精品一及| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲美女黄片视频| 午夜激情欧美在线| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲成av人片免费观看| 午夜福利高清视频| cao死你这个sao货| 一个人看视频在线观看www免费 | 国产亚洲欧美98| 国产一区二区三区视频了| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美高清成人免费视频www| 日韩欧美三级三区| 高清在线国产一区| 日本 av在线| 久久这里只有精品19| 久久香蕉精品热| 亚洲性夜色夜夜综合| 最新美女视频免费是黄的| 啦啦啦免费观看视频1| 午夜激情福利司机影院| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 97碰自拍视频| 亚洲国产色片| 老汉色∧v一级毛片| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲专区字幕在线| 亚洲无线在线观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 美女黄网站色视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产一区二区在线观看日韩 | 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲美女黄片视频| 久久久久性生活片| 男人舔奶头视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 一级黄色大片毛片| 久久精品91无色码中文字幕| 婷婷亚洲欧美| 亚洲九九香蕉| 日韩欧美在线乱码| a级毛片a级免费在线| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 窝窝影院91人妻| 久久精品国产清高在天天线| 国产av一区在线观看免费| 亚洲国产精品sss在线观看| 三级毛片av免费| 全区人妻精品视频| a在线观看视频网站| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 在线国产一区二区在线| 久久久久久国产a免费观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产精品一及| 国产综合懂色| 久久中文看片网| 校园春色视频在线观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| www国产在线视频色| 久久久久亚洲av毛片大全| 麻豆成人午夜福利视频| 1000部很黄的大片| 麻豆成人午夜福利视频| 午夜视频精品福利| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 丝袜人妻中文字幕| 女同久久另类99精品国产91| 丝袜人妻中文字幕| 久久香蕉精品热| 国产精品 国内视频| 日本熟妇午夜| 亚洲七黄色美女视频| 91九色精品人成在线观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产在线精品亚洲第一网站| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产美女午夜福利| 99国产精品99久久久久| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 欧美日本亚洲视频在线播放| 天天躁日日操中文字幕| 91在线观看av| 国产一区二区在线观看日韩 | 国产欧美日韩一区二区三| 男人和女人高潮做爰伦理| 成年版毛片免费区| 综合色av麻豆| 亚洲人成网站高清观看| 大型黄色视频在线免费观看| 久久久国产精品麻豆| 国产精品久久电影中文字幕| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 叶爱在线成人免费视频播放| 制服人妻中文乱码| 国产三级在线视频| 麻豆国产av国片精品| 日日夜夜操网爽| 少妇丰满av| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲最大成人中文| 97超视频在线观看视频| 黄色片一级片一级黄色片| 一本综合久久免费| 色吧在线观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久久久久大精品| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 日本黄大片高清| 亚洲av第一区精品v没综合| 欧美最黄视频在线播放免费| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 欧美乱妇无乱码| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 视频区欧美日本亚洲| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产av在哪里看| 成年免费大片在线观看| 午夜福利18| 狂野欧美激情性xxxx| 无遮挡黄片免费观看| 少妇的丰满在线观看| 丁香欧美五月| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲avbb在线观看| 香蕉av资源在线| 午夜久久久久精精品| 精品乱码久久久久久99久播| 免费在线观看日本一区| 成人特级av手机在线观看| 成人精品一区二区免费| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产伦一二天堂av在线观看| а√天堂www在线а√下载| 亚洲最大成人中文| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 欧美日韩综合久久久久久 | 亚洲av五月六月丁香网| 99riav亚洲国产免费| 国产精品久久久久久久电影 | 日韩大尺度精品在线看网址| 国产午夜精品久久久久久| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产亚洲欧美在线一区二区| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 欧美极品一区二区三区四区| 在线永久观看黄色视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 综合色av麻豆| 亚洲最大成人中文| 这个男人来自地球电影免费观看| 老汉色∧v一级毛片| 一进一出抽搐动态| 日韩欧美精品v在线| 欧美一级毛片孕妇| 欧美午夜高清在线| 国产综合懂色| 男女下面进入的视频免费午夜| 精品无人区乱码1区二区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 香蕉丝袜av| 国产探花在线观看一区二区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 两人在一起打扑克的视频| 午夜视频精品福利| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲国产欧美网| 亚洲精品色激情综合| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 日本五十路高清| 在线观看日韩欧美| 一二三四在线观看免费中文在| 制服丝袜大香蕉在线| 可以在线观看毛片的网站| 一进一出好大好爽视频| 久久草成人影院| 亚洲精品一区av在线观看| tocl精华| 国产精品亚洲一级av第二区| 男女之事视频高清在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 日韩欧美三级三区| 窝窝影院91人妻| 亚洲性夜色夜夜综合| 757午夜福利合集在线观看| 日本 欧美在线| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 性色av乱码一区二区三区2| 国产黄片美女视频| 欧美色视频一区免费| 男人舔奶头视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 黄色女人牲交| 丁香六月欧美| 欧美日韩乱码在线| 女同久久另类99精品国产91| 国产成人aa在线观看| 精品久久久久久,| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲,欧美精品.| 成人欧美大片| 我要搜黄色片| 熟女电影av网| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲成人中文字幕在线播放| 99在线人妻在线中文字幕| 久久久国产成人精品二区| 日本免费一区二区三区高清不卡| 日韩高清综合在线| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 久久香蕉国产精品| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲精品一区av在线观看| 操出白浆在线播放| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 国产真实乱freesex| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| cao死你这个sao货| 免费一级毛片在线播放高清视频| 亚洲激情在线av| 91麻豆av在线| 日韩人妻高清精品专区| 黄片大片在线免费观看| 日韩人妻高清精品专区| 色av中文字幕| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产免费男女视频| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲真实伦在线观看| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 韩国av一区二区三区四区| 欧美黑人巨大hd| 亚洲成人久久性| 又爽又黄无遮挡网站| 久久精品国产清高在天天线| 在线国产一区二区在线| 中亚洲国语对白在线视频| 国产高清视频在线播放一区| 久久草成人影院| 美女黄网站色视频| 亚洲无线观看免费| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲第一电影网av| a级毛片a级免费在线| 亚洲色图av天堂| 一级作爱视频免费观看| 精华霜和精华液先用哪个| 国产 一区 欧美 日韩| a级毛片a级免费在线| h日本视频在线播放| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲国产精品999在线| 久久热在线av| 久久中文字幕一级| 午夜两性在线视频| 久久久久性生活片| 91麻豆精品激情在线观看国产| 色综合婷婷激情| 夜夜爽天天搞| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国内精品一区二区在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲国产精品999在线| 亚洲在线自拍视频| 制服丝袜大香蕉在线| 动漫黄色视频在线观看| 欧美中文日本在线观看视频| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲最大成人中文| 国产真实乱freesex| 国产一区在线观看成人免费| 高潮久久久久久久久久久不卡| 黄频高清免费视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 欧美成人免费av一区二区三区| 一二三四社区在线视频社区8| 日本熟妇午夜| 成人av在线播放网站| 啦啦啦免费观看视频1| 脱女人内裤的视频| 91久久精品国产一区二区成人 | 99re在线观看精品视频| 成人一区二区视频在线观看| 国产成人精品无人区| 久久久久久九九精品二区国产| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 精品熟女少妇八av免费久了| 热99在线观看视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产成人影院久久av| 亚洲真实伦在线观看| 真实男女啪啪啪动态图| 日本免费a在线| 麻豆久久精品国产亚洲av| 成人三级做爰电影| 欧美一区二区国产精品久久精品| 欧美日韩精品网址| 国产成人av教育| 国产精品av视频在线免费观看| 午夜日韩欧美国产| 嫁个100分男人电影在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国内精品久久久久精免费| 欧美zozozo另类| 一进一出抽搐gif免费好疼| 欧美另类亚洲清纯唯美| 久久久久久大精品| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 精品久久蜜臀av无| АⅤ资源中文在线天堂| 国产精品99久久99久久久不卡| 免费在线观看成人毛片| 亚洲精品色激情综合| www日本在线高清视频| 国产成人aa在线观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 91九色精品人成在线观看| 欧美乱妇无乱码| 在线观看一区二区三区| 亚洲av成人一区二区三| 给我免费播放毛片高清在线观看| 美女午夜性视频免费| 一级毛片精品| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| av视频在线观看入口| 97碰自拍视频| 日本一本二区三区精品| 日韩av在线大香蕉| 国产av在哪里看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 夜夜爽天天搞| 村上凉子中文字幕在线| 国产探花在线观看一区二区| 精品久久久久久久末码| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 啦啦啦韩国在线观看视频| 免费看十八禁软件| 丁香欧美五月| 中文字幕av在线有码专区| 免费观看的影片在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 成人精品一区二区免费| 青草久久国产| 在线观看一区二区三区| 91九色精品人成在线观看| av女优亚洲男人天堂 | 亚洲中文日韩欧美视频| 青草久久国产| 亚洲美女视频黄频| 成人永久免费在线观看视频| 熟女人妻精品中文字幕| 国产精品,欧美在线|