脆皮腸盲樣中山梨酸含量的測定

陽文武 黃小蘭 周 濃 周祥德*

1（重慶市萬州食品藥品檢驗所，重慶 404000）2（重慶三峽學院生物與食品工程學院，重慶 404120）

山梨酸是化學合成的防腐劑，能夠抑制食品中微生物的生長和繁殖，從而延長食品的保存時間，保持食品原有的品質(zhì)和營養(yǎng)價值，是我國目前用量最大的食品防腐劑之一。但山梨酸具有一定的毒性，因此必須對它的使用量和殘留量加以控制。國家標準GB 2760—2014 規(guī)定，脆皮腸中允許添加一定量的山梨酸，因此對脆皮腸中山梨酸建立快捷、準確的測定方法很有必要。目前常用的方法有薄層法、氣相色譜法、液相色譜法。其中液相色譜法高效、快速、靈敏度高，適合大批量樣品的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Agilent1260 型高效液相色譜儀；KH-2000DB超聲清洗機；Sartorius 萬分之一電子分析天平（QUINTIX224-1CN）。

山梨酸對照品溶液，購買于北京曼哈格生物科技有限公司，批號：25561YW，170412；甲醇、甲酸，均為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 試劑溶液配制

亞鐵氰化鉀溶液（92 g/L）：稱取106 g 三水亞鐵氰化鉀，加入適量水溶解，用水定容至1 000 mL。

乙酸鋅溶液（183 g/L）：稱取220 g 二水乙酸鋅溶于少量水中，加入30 mL 冰乙酸，用水定容至1 000 mL。

乙酸銨溶液（20 mmol/L）：稱取1.54 g 乙酸銨，加入適量水溶解，用水定容至1 000 mL，經(jīng)孔徑0.22 μm 水相微孔濾膜過濾后備用。

甲酸- 乙酸銨溶液（2 mmol/L 甲酸+20 mmol/L乙酸銨）：稱取1.54 g 乙酸銨，加入適量水溶解，再加入75.2 μL 甲酸，用水定容至1 000 mL，經(jīng)孔徑0.22 μm 水相微孔濾膜過濾后備用。

1.3 標準溶液配制

山梨酸標準中間液：吸取標準溶液（含量為1.0 mg/mL）1.0 mL 于10 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，得質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的標準中間液，貯存于4 ℃冰箱中。

山梨酸標準系列工作液：分別準確吸取不同體積的標準中間液，用水將其稀釋成山梨酸含量分別為1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 的標準系列工作液，臨用現(xiàn)配。

1.4 供試品溶液的制備

準確稱取約2 g（精確到0.001 g）試樣于50 mL 具塞離心管中，加水約25 mL，渦旋混勻，于50℃水浴超聲（功率300W，頻率40kHz）20min，冷卻至室溫后加亞鐵氰化鉀溶液2 mL 和乙酸鋅溶液2 mL，混勻，于8 000 r/min 離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，于殘渣中加水20 mL，渦旋混勻后超聲5 min，于8 000 r/min 離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移到同一50 mL 容量瓶中，并用水定容至刻度，混勻。取適量上清液過孔徑0.22 μm 濾膜，待液相色譜測定。在此基礎上考察了另外4 種前處理方式對山梨酸提取效率的影響。

1.5 儀器條件

色譜柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙酸銨溶液∶甲醇=95 ∶5，流速：1.0 mL/min；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。對流動相進行了優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相比例對分離效果的影響

在1.5 儀器條件下，山梨酸的保留時間為9.6 min，但樣品峰有前沿，如圖1 所示。

圖1 色譜圖（乙酸銨溶液∶甲醇=95∶5）

為使樣品目標峰分離良好，在1.5 儀器條件基礎上將流動相比例調(diào)整為乙酸銨溶液∶甲醇=97∶3，流速降為0.9 mL/min 進行測定，色譜圖見圖2。由圖2 可知，結(jié)果目標峰出峰時間延遲至11.5 min，樣品峰有前沿。

圖2 色譜圖（乙酸銨溶液∶甲醇=97∶3）

水相比例已經(jīng)很大，不太可能通過延遲出峰時間來達到分離目標峰的目的，于是加大有機相比例，調(diào)整為乙酸銨溶液∶甲醇=92∶8 進行測定，色譜圖見圖3。由圖3 可知，出峰時間提前至8.7 min，樣品峰有比較好的分離。

圖3 色譜圖（乙酸銨溶液∶甲醇=92∶8）

2.2 前處理方式對山梨酸提取效率的影響

在1.5 儀器條件下，將流動相比例調(diào)整為乙酸銨溶液∶甲醇=92∶8，考查5 種前處理方式對山梨酸提取效率的影響，結(jié)果見表1。

表1 不同前處理方式對山梨酸測定值的影響

由表1 可以看出，經(jīng)過4 次提取后，樣品中的山梨酸基本被提取出來。另外比較第4 組和第5 組數(shù)據(jù)，可見沉淀劑對樣品中的山梨酸有微弱的吸附作用。

2.3 不同流動相對分離效果的影響

為使測得的數(shù)據(jù)更加科學、準確，采用流動相甲酸- 乙酸銨溶液（2 mmol/L 甲酸+20 mmol/L 乙酸銨∶甲醇=92∶8 進行驗證，結(jié)果出峰時間延遲至16.8 min，色譜圖見圖4。在此儀器條件下，重新測定了上述5 組樣品，結(jié)果見表2。

由表2 可以看出，5 組樣品的山梨酸值均有下降，可以初步推斷：當流動相為乙酸銨∶甲醇=92∶8 條件下，樣品峰還是有包裹，且與目標峰完全重疊。

圖4 色譜圖（甲酸- 乙酸銨溶液∶甲醇=92∶8）

表2 不同前處理方式對山梨酸值的影響

3 結(jié) 論

本次盲樣的真實值為0.140 g/kg，與表2 中2組、3 組的值非常接近，由此可見，在測定脆皮腸中山梨酸時，流動相應選用甲酸- 乙酸銨溶液（2 mmol/L 甲酸+20 mmol/L 乙酸銨）∶甲醇=92∶8，前處理方式應為：每次于殘渣中加少量水，提取4次。