TFF1基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建及活性鑒定

李俊龍 劉小康 王祎△

(1.第三軍醫(yī)大第一附屬醫(yī)院西南醫(yī)院研究中心，重慶 404100；2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041)

三葉因子1(Trefoil factor 1，TFF1)是三葉因子家族蛋白之一，又稱為雌激素誘導(dǎo)蛋白，首先在雌激素受體表達(dá)陽性的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中發(fā)現(xiàn)，是典型的雌激素應(yīng)答基因[1]。TFF1在胃腸道粘膜屏障和修復(fù)中發(fā)揮重要作用，包括細(xì)胞的遷移、分化、血管生成等[2, 3]。在胃癌細(xì)胞中，TFF1通過上調(diào)細(xì)胞周期依賴性激酶的水平，延遲細(xì)胞的周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞凋亡[4, 5]。并且也有研究表明在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中，TFF1通過下調(diào)miR504的水平激活p53基因的表達(dá)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[6]?？傊?，目前對于TFF1在不同腫瘤中發(fā)揮的作用及其作用機(jī)制存在爭議的。而另一方面，近年來有學(xué)者膽囊癌患者的原發(fā)性腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了雌激素受體ER以及孕激素受體PR的大量表達(dá)，并且通過免疫組化檢測到了TFF1的陽性表達(dá)，提示TFF1在膽囊癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用[7]。因此本研究構(gòu)建了含有人TFF1基因野生型啟動(dòng)子質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒的熒光素酶報(bào)告基因載體，并研究了雌激素對TFF1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響，為尋找TFF1基因的核心啟動(dòng)子序列，進(jìn)一步研究TFF1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與細(xì)胞

膽囊癌細(xì)胞GBC-SD細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α購自日本Takara公司；定向誘變試劑盒購自美國Stratagene公司；載體質(zhì)粒pGL3-Basic質(zhì)粒以及內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40質(zhì)粒和雙熒光素酶檢測試劑盒均購自美國Promega公司；轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Omega公司。

1.2 方法

1.2.1構(gòu)建人野生型及突變型TFF1基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中人TFF1基因序列(登錄號(hào)：AB038162.1)，選取TFF1基因CDS區(qū)前-568位至-2位核苷酸作為啟動(dòng)子序列，其中包含經(jīng)典的雌激素應(yīng)答元件(Estrogen response elements，ERE)序列和非經(jīng)典雌激素受體結(jié)合部位——激活蛋白1(Activating protein-1，AP-1)結(jié)合位點(diǎn)序列。并在5′端加入KpnI酶切位點(diǎn)，在3′端加入Hind III酶切位點(diǎn)，基因合成序列如下：GGTACC(KnpI)GATTACAGGCGTGAGCCACTGCGCCAGGCCTACAATTTCATTATTAAAACAATTCCACTGTAAAAGAATTAGCTTAGGCCTAGACGGAATGGGCTTCATGAGCTCCTTCCCTTCCCCCTGCAAGGTCACGGTAGGCC(ERE)ACCCCGTGAGCCACTGTTGTCACGGCCAAGCCTTTTTCCGGCCATCTCTCACTATGAATCA(AP-1)CTTCTGCAGTGAGTACAGTATTTACCCTGGCGGGAGGGCCTCTCAGATATGAGTAGGACCTGGATTAAGGTCAGGTTGGAGGAGACTCCCATGGGAAAGAGGGACTTTCTGAATCTCAGATCCCTCAGCCAAGATGACCTCACCACATGTCGTCTCTGTCTATCAGCAAATCCTTCCATGTAGCTTGACCATGTCTAGGAAACACCTTTGATAAAAATCAGTGGAGATTATTGTCTCAGAGGATCCCCGGGCCTCCTTAGGCAAATGTTATCTAACGCTCTTTAAGCAAACAGAGCCTGCCCTATAAAATCCGGGGCTCGGGCGGCCTCTCATCCCTGACTCGGGGTCGCCTTTGGAGCAGAGAGGAGGCAAGCTT(HindⅢ)。另外使用DNASTART軟件，分別設(shè)計(jì)ERE位點(diǎn)突變和AP-1位點(diǎn)突變的TFF1基因序列，啟動(dòng)子基因序列由蘇州金唯智公司合成。將目的片段克隆至pGL3-Basic載體上，于16℃連接過夜，次日將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，接種于含Amp的LB固體培養(yǎng)皿，37℃倒置培養(yǎng)過夜。分別挑取單克隆，接種于LB液體培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并送蘇州金唯智公司進(jìn)行測序鑒定。

1.2.2啟動(dòng)子熒光素酶活性鑒定

膽囊癌細(xì)胞GBC-SD細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。將2×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。細(xì)胞處理分為空白對照組(轉(zhuǎn)染pGL3-Basic質(zhì)粒)，實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染野生型或突變型重組質(zhì)粒)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70-80%融合度時(shí)，參照Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑說明，每孔中的比例為DNA：Lipo=0.5 μg：2 μL，將構(gòu)建基因與相應(yīng)的內(nèi)參基因pRL-SV40按照9：1的比例共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。24 h后裂解細(xì)胞，按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明測定各組的相對熒光素酶活性。

1.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 TFF1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體雙酶切鑒定結(jié)果

提取構(gòu)建好的pGL3-TFF1質(zhì)粒，pGL3-TFF1-△ERE突變質(zhì)粒，pGL3-TFF1-△AP-1突變質(zhì)粒以及pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1雙突變質(zhì)粒，并采用Kpn I和HindIII進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物電泳可得到約1.2kb小片段和4.1kb包含目的片段的大片段，與插入的TFF1啟動(dòng)子目的片段和線性pGL3-Basic大小結(jié)果相符合，見圖1。

圖1 雙酶切鑒定啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因注：1: undigested; 2: digested with Kpn I、HindIII; 3: DNA Marker；A：pGL3-TFF1， B：pGL3-TFF1-△ERE， C：pGL3-TFF1-△AP-1， D：pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1質(zhì)粒雙酶切定。

2.2 野生型及突變型TFF1基因啟動(dòng)子質(zhì)粒測序鑒定結(jié)果

pGL3-TFF1質(zhì)粒，pGL3-TFF1-△ERE突變質(zhì)粒，pGL3-TFF1-△AP-1突變質(zhì)粒以及pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1雙突變質(zhì)粒DNA測序由蘇州金唯智公司完成，測序結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)序列相比較，結(jié)果完全一致，證明質(zhì)粒構(gòu)建成功，示意圖見圖2。

2.3 野生型及突變型TFF1基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性

將構(gòu)建的4種啟動(dòng)子質(zhì)粒分別與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40共轉(zhuǎn)染人膽囊癌細(xì)胞GBC-SD細(xì)胞后，檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶報(bào)告基因活性，并將兩者的比值作為該啟動(dòng)子的相對活性。結(jié)果如圖3A所示，與pGL3-Basic組相比較，pGL3-TFF1的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性升高了約2.20倍，pGL3-TFF1-△ERE突變質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性升高約了1.5倍，pGL3-TFF1-△AP-1突變質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性升高了0.076倍，pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1雙突變質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性升高了0.056倍。表明AP-1結(jié)合位點(diǎn)的基因序列對TFF1基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性具有關(guān)鍵作用。

圖2 野生型及突變型TFF1基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告載體示意圖

為了進(jìn)一步檢驗(yàn)雌激素與TFF1蛋白表達(dá)的關(guān)系，我們將各啟動(dòng)子質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進(jìn)人膽囊癌細(xì)胞GBC-SD細(xì)胞后，給與10-9mol·L-1外源性雌激素刺激24 h，后測定各組熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3B所示，與無雌激素處理組比較，雌激素能顯著升高野生型pGL3-TFF1質(zhì)粒和突變型pGL3-TFF1-△ERE質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性(P<0.001。但對pGL3-TFF1-△AP-1突變質(zhì)粒和pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1雙突變質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性影響不大。

圖3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性注：A：啟動(dòng)子突變對TFF1轉(zhuǎn)錄活性的影響。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測構(gòu)建的啟動(dòng)子質(zhì)粒的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性，與空白對照組比較，***P<0.001。B:雌激素對膽囊癌TFF1表達(dá)的影響。E2代表該組經(jīng)雌激素處理，pGL3-basic-luc為空載質(zhì)粒。雌激素刺激組與無雌激素刺激組相比較，TFF1轉(zhuǎn)錄活性顯著升高，***P<0.001；與雌激素刺激的野生型TFF1啟動(dòng)子組相比較，AP-1位點(diǎn)突變以及雙位點(diǎn)突變組TFF1轉(zhuǎn)錄活性極顯著性降低，###P<0.001。

3 討論

三葉因子家族是一類小分子調(diào)節(jié)肽，包括3個(gè)成員TFF1、TFF2、TFF3。其中TFF1又稱為雌激素誘發(fā)蛋白，是經(jīng)典的雌激素應(yīng)答基因。正常情況下主要在胃體和胃竇粘膜上皮表達(dá)[8]。目前研究認(rèn)為TFF1的異常表達(dá)是多種疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理學(xué)基礎(chǔ)，如TFF1表達(dá)缺失引起胃腸粘膜慢性損傷[9]。在正常的膽囊組織中無TFF1的表達(dá)，但在膽囊炎、不典型增生以及膽囊癌出現(xiàn)時(shí)大量表達(dá)。Kornprat在研究中也證實(shí)了這一點(diǎn)，其研究指出TFF1在正常粘膜中不表達(dá)，上皮細(xì)胞出現(xiàn)炎癥改變時(shí)開始表達(dá)，并且在35%的原位癌以及24%的轉(zhuǎn)移癌患者癌組織中檢測到TFF1的免疫反應(yīng)性，且隨著腫瘤分期與分級(jí)的增加，TFF1的免疫反應(yīng)性是顯著降低的，這說明TFF1可能是膽囊結(jié)石、膽囊炎和膽囊癌之間某種缺失的聯(lián)系[10]。但目前膽囊癌中TFF1蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制仍未有報(bào)道，雌激素以及雌激素受體在膽囊癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制也未闡明。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了野生型和突變型TFF1基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，并通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染將其成功轉(zhuǎn)染進(jìn)了膽囊癌細(xì)胞GBC-SD。根據(jù)上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們得知ERE位點(diǎn)和AP-1位點(diǎn)同樣參與到了膽囊癌中TFF1的調(diào)控，但ERE作為雌激素的應(yīng)答元件，其在膽囊癌中發(fā)揮的作用是有限的，TFF1的表達(dá)調(diào)控更多依賴的是AP-1結(jié)合位點(diǎn)。膽囊組織作為一個(gè)非性激素靶器官，其ER的表達(dá)存在一定限制，這可能是限制ERE位點(diǎn)發(fā)揮調(diào)控作用的一個(gè)原因。本研究為將來深入了解膽囊癌發(fā)病機(jī)理，及其發(fā)生發(fā)展過程提供一定的理論依據(jù)。