間歇性大強度運動前后人體血清代謝組學特征

郭新明 吳麗君 向歡

1太原師范學院體育系（太原 030619）

2山西大學體育學院

代謝組學（metabonomics/metabolomics）是自人類基因組計劃、蛋白質(zhì)組計劃之后，迅速發(fā)展起來的以高通量檢測和數(shù)據(jù)處理為手段、以信息建模與系統(tǒng)整合為目標、以群組指標分析為基礎的一門生物學學科[1]。代謝物檢測技術(shù)包括核磁共振波譜（NMR）和質(zhì)譜（MS）等，可以不預先設定將要檢測的具體指標而“全景式”掃描所有代謝物，從而反映藥物、環(huán)境污染、運動等外界因素對機體代謝的影響，在此基礎上，進一步探索或闡明相關(guān)生命過程的代謝網(wǎng)絡調(diào)控應答機制。上述代謝組學思想與分析技術(shù)已廣泛應用于生理學、毒理學、功能基因組學、疾病診斷、藥物療效與藥物作用機理等方面，并取得了長足進步[2]。

目前，國外代謝組學在體育科學領(lǐng)域的應用主要集中在運動訓練方法手段[3-4]、運動生理狀態(tài)監(jiān)控[5-6]、運動營養(yǎng)補充[7-8]、運動與疾病治療[9-10]等方面。近些年，我國學者采用代謝組學方法進行的研究也呈蓬勃發(fā)展態(tài)勢，主要集中在不同運動項目運動員的代謝特征[11-13]、運動對疾病的治療[14-16]及營養(yǎng)補劑結(jié)合運動對機體機能的影響[17-18]等幾個方面。隨著工作壓力增大、生活節(jié)奏加快，部分無法保障健康運動方式的健身鍛煉者及某些項目的運動員往往采用間歇性大強度運動進行鍛煉、訓練和比賽，這會對機體產(chǎn)生較大擾動，使機體代謝變化更為劇烈。鑒于此，本研究采用三次大強度間歇3分鐘的運動方式，探討分析運動前后人體血清代謝物的變化狀況，以探究間歇性大強度運動機體的代謝特征。

1 對象與方法

1.1 研究對象

根據(jù)研究需要，為減少個體差異對實驗結(jié)果造成不良影響，按照身高、體重、運動等級篩選出體育學院2016級體育教育專業(yè)男生8人，年齡20.19±1.14歲，身高1.78±0.08 m，體重69.35±3.54 kg，均為二級運動員，身體健康，無抽煙、喝酒、熬夜等不良生活習慣，無慢性病史及家庭遺傳病史。

1.2 實驗儀器與試劑

選用瑞典產(chǎn)Monark874E定量負荷功率自行車完成一次間歇性大強度運動。選用 Brucker600-MHz AVACNCEⅢ NMR譜儀（600.13 MHz Proton frequency）、TGL-16高速臺式冷凍離心機、XW-80A渦旋混合器、KQ5200E型超聲波清洗器、D2O重水、PBS磷酸緩沖液完成血清核磁共振代謝物測定。

1.3 實驗設計與運動方案

實驗設定為7天。由于代謝組學研究對血樣的要求較高，為避免飲食對實驗數(shù)據(jù)的影響，本研究采用空腹運動、空腹采血的方式。實驗第1天，8名受試者于清晨8時空腹進行第一次肘靜脈采血，標記為E1；采血后立即進行蹬騎功率自行車運動，在運動后即刻、1小時分別采血，標記為E2、E3；實驗第2天，受試者清晨8時空腹再次進行肘靜脈采血，標記為E4；實驗第7天，受試者清晨8時空腹進行最后一次采血，標記為E5。運動方式為受試者全力蹬騎功率車30 s×3/間歇3 min（負荷為0.075 kg/kg體重）的間歇性大強度運動[19]。

1.4 樣本采集與處理

每次采集肘靜脈血5 mL，分別置于抗凝管內(nèi)，經(jīng)3000 r/min離心30 min后，取上清液1 mL置于EP管內(nèi)，儲存于－80℃冰箱保存待測。

1.5 NMRNMR數(shù)據(jù)采集與處理

樣品處理：將血液樣品放置于冰水混合物中解凍后，取450 μL置于容量為2 mL的EP管中，加入900 μL甲醇。渦旋2 min使之充分反應，再放入TGL-16高速臺式冷凍離心機中4℃、13000 r/min離心30 min。離心后取900 μL上清液置于容量5 mL的EP管中，經(jīng)氮吹儀空氣源吹干后加入600 μL PBS緩沖液在超聲清洗器作用下復溶，待充分溶解后取550 μL加入內(nèi)徑為5 mm的核磁管，標記好，4℃保存、待測。

NMR序列設置：將放有樣品的核磁管進行1HNMR檢測，采用CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脈沖序列，CPMG脈沖序列的優(yōu)點是可以壓制水峰及大分子物質(zhì)信號，從而增加樣品中小分子物質(zhì)敏感性。自旋弛豫延遲320 ms，自由感應衰減64 K數(shù)據(jù)點，譜寬8 KHz，64次掃描。

NMR數(shù)據(jù)處理：得到樣本的核磁信號后，使用MestReNova軟 件（Mesterlab Research，Santiagode compostella，Spain）對圖譜進行傅立葉轉(zhuǎn)換，再調(diào)整基線、校正相位。以TSP（total suspended particulate）的化學位移為基準校正1H-NMR譜圖的位移。對0.5～9 ppm的圖譜進行等寬度分割，切除4.5到6.2的水峰信號，再分段積分后將積分值保存于Excel中，將數(shù)據(jù)歸一化處理后進行多元統(tǒng)計分析。用SIMCA-P13.0（Umetric，Sweden）對積分值進行中心化與規(guī)格化后，對其進行偏最小二乘判別分析（PLS-DA）、正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），最終分別結(jié)合各組間配對樣本T檢驗的P值與VIP值找出差異代謝物。

2 結(jié)果

使用Chenomx NMR Suite軟件及相關(guān)文獻對核磁共振代謝圖譜加以指認，得到實驗對象不同時期0.5～8.5 ppm的1H-NMR血清代謝圖譜[20]。

2.1 受試者血清小分子代謝物的1 1H-NMRH-NMR代謝圖譜指認

本實驗所采集的1H-NMR圖譜如圖1，時間分別為：運動前（E1）、運動后即刻（E2）、運動后1小時（E3）、運動后1天（E4）、運動后1周（E5）。通過查閱人類代謝組數(shù)據(jù)庫（Human Metabolome Database，HMDB）及相關(guān)文獻[21-22]，共指認出22種代謝標志物：脂質(zhì)、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、乳酸、丙氨酸、醋酸、N-乙酰基-糖蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、檸檬酸、肌酸、肉毒堿、磷酸膽堿、氧化三甲胺、甜菜堿、乙酰乙酸、甘氨酸、甘油、葡萄糖、酪氨酸、組氨酸。

圖1 受試者不同時期血清1H-NMR圖譜（ppm）

2.2 受試者運動前與運動后不同時刻相比較的血清代謝標志物

將MestRenova軟件處理后的數(shù)據(jù)導入到SIMCAP 13.0軟件采用OPLS-DA方法進行分析，得到得分圖與S-Plots圖。得分圖中每一個點代表一個樣本，所含物質(zhì)含量越相同的樣本在位置上越接近，因此在圖中我們可以看到同一組的樣本距離較近，甚至發(fā)生重疊，而不同組的樣本距離較遠，因此可以在圖上看到不同組的樣本分布在不同區(qū)域。S-Plots中每個點代表一種小分子物質(zhì)，VIP值越大的點（即離原點越遠的點）對受試者不同時期的血清樣本分離貢獻越大。在運動不同階段的幾個R2和Q2分別代表在相應階段的解釋能力和預測能力。經(jīng)過模型交叉驗證，只有模型成立才能證明PLS-DA和OPLS-DA分析結(jié)果有意義。

由圖2A可知，血清樣本可以完全分開，說明人在間歇性大強度運動前和運動后即刻機體小分子物質(zhì)的含量發(fā)生了明顯變化。圖2B載荷圖中每一個點代表一個變量，變量的 VIP值越大，即距離原點越遠，說明其對血清樣本的分離貢獻率越高。圖2C表明檢驗PLS-DA模型驗證成立。本研究對載荷圖的數(shù)據(jù)進行篩選，確定找出的代謝標志物其VIP＞1且滿足與運動前E1之間配對樣本t檢驗雙尾檢測結(jié)果P＜0.05兩個條件。

圖2 E1與E2受試者血清代謝標志物分析圖

由表1可見，將運動前E1與運動后即刻E2檢測出的物質(zhì)進行配對樣本t檢驗，共檢測出13種差異代謝物（P＜0.01），分別是：亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、乳酸、谷氨酸、谷氨酰胺、肌酸、肉毒堿、甜菜堿、乙酰乙酸、甘氨酸、甘油、葡萄糖，除乳酸呈上升趨勢外，其余物質(zhì)均呈下降趨勢。E1與E3間共檢測出8種差異代謝標志物，分別是：亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、乳酸、甜菜堿、乙酰乙酸、甘油（P＜0.01）、肌酸（P＜0.05），除乳酸值仍明顯高于運動前外，乙酰乙酸也呈現(xiàn)出明顯上升趨勢；E1與E4間的差異代謝標志物只有甜菜堿（P＜0.05）和甘油（P＜0.01）；E1與E5間已無差異代謝物。

2.3 受試者運動后不同時刻相比較的血清代謝標志物

由表1可見，運動后即刻與運動后1 h，即E2與E3之間共檢測出7種差異代謝物，分別是：谷氨酰胺、甜菜堿、乙酰乙酸、甘油、葡萄糖（P＜0.01），谷氨酸、甘氨酸（P＜0.05），均明顯上升；E3與E4之間共檢測出5種差異代謝物，分別是：亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、乳酸、肌酸（P＜0.01），除乳酸明顯降低外，均明顯上升；E4與E5間已無差異代謝物。

3 討論

本研究采用核磁共振代謝組學方法研究間歇性大強度運動前后人體血清的代謝組學特征，在運動前與運動后不同時刻共發(fā)現(xiàn)13種差異代謝物。通過對這些差異代謝物變化狀況的分析可發(fā)現(xiàn)間歇性大強度運動的供能特點。

肌酸（Cr）可快速合成ATP，是磷酸原供能系統(tǒng)的主要能源物質(zhì)。有研究表明補充肌酸可抑制游泳運動員因短時間大強度運動引起的氧化應激標記物的增多，即補充肌酸可起到對抗機體氧化應激的作用[8]。還可以抑制急性大強度運動后炎癥標志物血漿腫瘤壞死因子α（TNF-α）和C反應蛋白（CRP）的升高[23]。本研究中，運動后即刻血清中肌酸含量降低（P＜0.01），運動后1小時仍較低，至運動后1天才明顯高于運動后1小時（P＜0.01），并已恢復至運動前水平且略高于運動前，說明本實驗大量消耗肌酸供能，體現(xiàn)出大強度運動磷酸原系統(tǒng)供能的特點，但運動后1天可出現(xiàn)超量恢復。

表1 受試者運動前后不同時期血清代謝標志物尋找結(jié)果（±s，n=8）

表1 受試者運動前后不同時期血清代謝標志物尋找結(jié)果（±s，n=8）

序號1 2 3 4 5 6 7 8 9 ppm 0.96 1.01 1.05 1.33 2.08 2.14 3.05 3.21 3.27代謝標志物亮氨酸異亮氨基酸纈氨酸乳酸谷氨酸谷氨酰胺肌酸肉毒堿甜菜堿E1 3.82±0.53 5.75±0.91 3.04±0.57 46.79±0.84 1.46±0.34 5.12±0.71 3.86±0.26 5.34±0.81 8.35±1.36 E2 1.95±0.36**3.02±0.57**1.76±0.36**183.58±15.33**0.99±0.37**2.95±0.39**2.08±0.20**2.73±0.48**4.63±0.83**E3 2.38±0.48**4.02±0.58**2.16±0.48**72.15±15.50**1.47±0.26△5.27±0.41△△3.52±0.29*4.82±0.67 7.04±0.92**△△E4 3.50±0.42##5.60±0.38##3.11±0.26##39.71±0.33##1.45±0.30 5.86±0.70 4.08±0.31##4.66±0.78 7.37±0.83*E5 3.64±0.26 5.83±0.49 3.39±0.39 39.05±0.64 1.34±0.24 5.56±0.46 4.05±0.22 5.28±0.97 7.72±0.86

（續(xù)表1）

葡萄糖（Glu）與乳酸（La）是人體在缺氧狀態(tài)下糖酵解供能系統(tǒng)主要的能量供應物質(zhì)和酵解產(chǎn)物。在嚙齒動物及人類骨骼肌中，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（GLUT4）對葡萄糖的攝取起主要作用[24]。運動時GLUT4從細胞內(nèi)部移位到肌膜和橫向小管處以增加骨骼肌中葡萄糖的轉(zhuǎn)運[25]。本研究中在運動后即刻血清中葡萄糖急劇下降（P＜0.01），說明葡萄糖被快速轉(zhuǎn)變成運動所需的能量，但在運動后1小時即明顯恢復（P＜0.01）并接近于安靜時水平。

乳酸不僅可導致運動疲勞，還可激活缺氧誘導因子-1（HIF-1）以誘導腫瘤細胞侵潤[26]。有研究表明，在缺氧狀態(tài)下進行高強度運動可導致全身乳酸轉(zhuǎn)化率提高18倍[27]。本研究中乳酸含量在運動后即刻顯著升高，運動后1小時下降了約二分之一（P＜0.01），運動后1天已明顯低于運動后1小時（P＜0.01），并基本恢復到安靜狀態(tài)。說明糖酵解是本實驗的能量來源之一，并且產(chǎn)生的乳酸在運動后1天基本消除。

甘油（TG）是脂肪分解的產(chǎn)物。關(guān)于運動時甘油濃度的變化，Ueda等研究表明在中等強度運動過程中血清甘油含量持續(xù)增多，運動后即刻達到峰值，運動后30分鐘可恢復至安靜水平[28]。Ueda等的另一項研究表明遞增負荷至最大攝氧量運動后即刻血清甘油含量達到最高值，運動后1小時基本恢復至安靜狀態(tài)[29]。本研究中在運動后即刻甘油大幅度下降（P＜0.01），運動后1小時明顯升高（P＜0.01），但仍低于運動前（P＜0.01），運動后1天的含量與運動后1小時基本持平，1周后恢復至運動前水平。說明本實驗中脂肪也被氧化為機體供能，尤其在運動間歇時脂肪作為能量消耗，但其恢復速度較慢。

酮體（KB）包括乙酰乙酸、β-羥丁酸和丙酮，在人體內(nèi)含量極少，約為0.3～5 mg/dL。Laffel研究表明機體在饑餓狀態(tài)下KB產(chǎn)生增多以替代葡萄糖作為外周組織（大腦，心臟和骨骼?。┑闹饕茉次镔|(zhì)[30]。Mark Evans等發(fā)現(xiàn)運動員在長距離自行車運動期間體內(nèi)酮體被氧化而減少，運動后恢復期又顯著增加，且訓練有素者骨骼肌利用酮體的能力明顯提高[31]。本研究中血清內(nèi)的乙酰乙酸在運動后即刻急劇下降（P＜0.01），運動后1小時明顯上升且顯著高于運動前和運動后即刻（P＜0.01），與Mark的研究結(jié)果有相似之處，我們認為是由于受試者是在空腹狀態(tài)下進行間歇性大強度運動，糖原耗竭、酮體供能加強，運動后又超量恢復所致。

肉毒堿（CAR）：左旋肉毒堿是線粒體膜上活化的脂肪酸載體，可攜帶脂肪酸進入線粒體進行β-氧化[32]。Jamal等研究表明，繼發(fā)性肉毒堿的缺乏可導致大鼠骨骼肌線粒體功能受損[33]。Wall等研究表明足球運動員口服左旋肉毒堿一個月脂肪供能明顯增強[34]。本研究中肉毒堿在運動后即刻急劇下降（P＜0.01），運動后1h和1天已基本恢復到運動前水平。再次說明本研究中脂肪也作為能源物質(zhì)分解供能從而消耗肉毒堿。如果是在非空腹狀態(tài)下運動，甘油、乙酰乙酸、肉毒堿等物質(zhì)的代謝狀況可能會不同，脂肪代謝的動用程度可能不會如此明顯。

谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Gln）的變化。Smith研究表明，運動員過度訓練時，血液中谷氨酰胺濃度明顯減少、谷氨酸濃度明顯增加，他認為谷氨酰胺持續(xù)下降是過度訓練的標志之一[35]。在進行高強度力量訓練時機體內(nèi)谷氨酰胺水平可能下降達50%，訓練強度越大流失的越快[13]。Koo等的研究表明預先一周每天補充6 g谷氨酰胺，可促進人體急性大強度運動后恢復期血液中氨、磷和肌酸激酶濃度的降低，增加白細胞介素1（IL-1）等細胞因子的產(chǎn)生，進而增強人體免疫功能[7]。本研究運動后即刻，血清中谷氨酸、谷氨酰胺均急劇下降（P＜0.01），推測谷氨酸和谷氨酰胺分解供能增加，但運動后1小時即基本恢復至運動前水平，尤其谷氨酰胺在運動后1小時顯著高于運動后即刻（P＜0.01），表明本實驗采用的運動方式未導致機體過度訓練。

甘氨酸（Gly）是一種非必需氨基酸，是合成谷胱甘肽、肌酸等的原料，也是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。左群[36]、馬海峰[13]等發(fā)現(xiàn)大負荷訓練后代謝物中甘氨酸含量呈上升趨勢，提示甘氨酸濃度上升可能是機體脂肪代謝供能比例上升的標志。但是在短時間、大強度急性運動后血漿甘氨酸含量普遍呈降低或不變的趨勢[4，37-39]。本研究血清中的甘氨酸在運動后即刻急劇下降（P＜0.01），與Makhro等[38]的研究結(jié)果一致，可能是由于甘氨酸用于合成肌酸所致。但運動后1小時甘氨酸濃度即恢復至運動前水平，同時機體甘油和乙酰乙酸含量較高，也證實了甘氨酸濃度上升是機體脂肪代謝比例上升的標志。

支鏈氨基酸（BCAA）是亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的統(tǒng)稱，屬于必需氨基酸。BCAA攝入可降低血液內(nèi)五羥色胺濃度，以緩解中樞疲勞 ；還可減少肌肉損傷物質(zhì)肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）的濃度；并使血漿游離脂肪酸增多，加速脂肪供能[40]。有研究提出BCAA在機體無氧供能狀態(tài)下還可取代葡萄糖供能以減少乳酸產(chǎn)生[41]。本實驗中，受試者在運動后即刻血清中三種支鏈氨基酸均下降（P＜0.01），恢復1小時后仍低于運動前水平（P＜0.01），推測作為能量進行了消耗，運動1天后基本恢復到運動前水平并高于運動后1小時水平（P＜0.01），表明支鏈氨基酸的消耗可在一天內(nèi)得到恢復。

甜菜堿（Bet）主要成分是三甲基甘氨酸、強心甙和其他甾類成分，可為合成脂酰膽堿、肉堿等提供甲基。甜菜堿已被證明具有促進脂肪代謝、保護肝臟、抗腫瘤、降低心血管疾病、增強運動能力等功能[42，43]。Cholera等的研究表明運動員補充甜菜堿可防止檸檬酸合成酶熱變性、維持滲透壓，增強高溫環(huán)境中高強度運動機體的抗疲勞性[44]。本實驗中血清甜菜堿在運動后即刻急劇下降（P＜0.01），運動后1小時大幅上升（P＜0.01），至運動后1天仍呈上升趨勢（P＜0.05），運動后一周恢復至安靜水平。可能是由于運動期間受試者肌酸、肉堿等大量消耗并合成，甜菜堿作為甲基供體被大量消耗，運動后隨著代謝水平的下降逐漸恢復，這種變化狀態(tài)進一步體現(xiàn)了機體磷酸原系統(tǒng)和脂肪供能的特征，它可能是脂肪供能的潛在代謝標志物。

本研究分析的代謝物也可以作為底物對信號通路產(chǎn)生影響，下一步的研究可通過探討相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路中酶活性、蛋白或基因表達等變化，從分子和代謝兩個水平深入探究運動對特征代謝物和信號轉(zhuǎn)導通路的整體調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié)論

磷酸原系統(tǒng)、糖酵解系統(tǒng)及有氧氧化系統(tǒng)均參與間歇性大強度運動供能，糖、脂肪、蛋白代謝均發(fā)生變化，差異代謝物在運動后即刻與運動前差異最顯著，但運動后1小時至1天恢復明顯，1周內(nèi)基本恢復。