藏藥賽北紫堇的質(zhì)量標準研究

陳惟思 汪晶 楊忠輝 項欠本 索果佳 曹鵬 黃一平 彭毛才讓

[摘要] 目的 建立藏藥賽北紫堇的質(zhì)量標準。 方法 采用薄層色譜法，以原阿片堿為對照品，測定10批賽北紫堇樣品，并對其水分、灰分和浸出物進行測定;采用高效液相色譜法，以X-Bridge C18（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈-三乙胺醋酸溶液（20∶80）為流動相，對賽北紫堇中原阿片堿進行含量測定;同時建立指紋圖譜，計算相似度。 結(jié)果 10批賽北紫堇藥材的薄層色譜圖有一個特征斑點。原阿片堿在質(zhì)量濃度11.71～585.80 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關系，平均加樣回收率為99.84%，RSD為2.75%。經(jīng)高效液相色譜法指紋圖譜分析，確立14個共有特征峰，相似度達到0.9以上。 結(jié)論 該方法簡便、重復性好，可用于賽北紫堇質(zhì)量控制。

[關鍵詞] 藏藥;賽北紫堇;原阿片堿;薄層色譜法;高效液相色譜法;指紋圖譜;質(zhì)量標準

[中圖分類號] R917? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）07（c）-0116-04

Study on the quality standard of Tibetan medicine Corydalis impartiens

CHEN Weisi1? ?WANG Jing1，2? ?YANG Zhonghui3? ?XIANG Qianben3? ?SUO Guojia3? ?CAO Peng2? HUANG Yiping1，2? ?PENGMAO Cairang3

1.Department of Chinese Medicine Preparation， Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine Affiliated to Nanjing University of Traditional Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing? ?210023， China; 2.Key Laboratory of New Drug Delivery System of Chinese Meteria Medica， National Adninistration of Traditional Chinese Medicine， Jiangsu Provincial Academy of Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing? ?210028， China; 3.Hainan Tibetan Autonomous Prefecture Tibetan Hospital， Qinghai Province， Hainanzhou? ?813000， China

[Abstract] Objective To establish a quality standard for Tibetan medicine Corydalis impartiens. Methods Ten batches of Corydalis impatiens samples were determined by thin-layer chromatography with protoopioids as reference substance; the moisture content， ash content and extract were determined. The content of protopine in Corydalis impatiens was determined by high performance liquid chromatography with X-Bridge C18 column （250.0 mm×4.6 mm， 5 μm） and acetonitrile-triethylamine acetic acid solution （20∶80） as the mobile phase， meanwhile high performance liquid chromatography fingerprint was established and the similarity was calculated. Results The thin-layer chromatographyresults of 10 batches of Corydalis impartiens had one accurate characteristic spot. The original opioid has a good linear relationship in the mass concentration range of 11.71-585.80 μg/mL， the average recovery rate was 99.84% and the RSD was 2.75%. By high performance liquid chromatography fingerprint analysis， 14 common characteristic peaks were identified， and the similarity was above 0.9. Conclusion The method is simple， repeatable， which can be used for the quality control of Corydalis impatiens.

[Key words] Tibetan medicine; Corydalis impatiens （Pall.） Fisch.; Protopine; Thin-layer chromatography; High performance liquid chromatography; Fingerprint; Quality standard

賽北紫堇為罌粟科紫堇屬植物北紫堇Corydalis impatiens（Pall.）Fisch.的干燥全草，具有活血散瘀、行氣止痛、清熱解毒功效，用于胃脘痛、肝炎、膽囊炎、疥癬、毒蛇咬傷等[1-2]。賽北紫堇的主要化學成分為生物堿類物質(zhì)[3-5]，是其鎮(zhèn)痛、抗炎、抗缺氧、抗氧化及抗腫瘤的有效成分[6-9]。目前賽北紫堇的藥材標準研究缺乏高效液相指紋圖譜的整體定性鑒別及含量測定等。本研究建立了賽北紫堇的薄層鑒別、高效液相指紋圖譜及該藥材中主要有效成分原阿片堿含量的分析方法，并對該藥材水分、灰分和浸出物進行測定，為民族藥的開發(fā)與利用提供基礎。

1 儀器與材料

Agilent 1100型高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器（美國Agilent）;AT 201型1/10萬以及XP6型1/100萬電子天平（瑞士梅特勒公司）;硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）等。原阿片堿對照品（批號：110853201404，中國食品藥品檢定研究院）;比枯枯靈對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-1720202）;甲醇、乙腈（色譜純，美國TEDIA），其余試劑均為分析純，水為超純水。賽北紫堇由青海省海南州藏醫(yī)院提供，經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院黃一平研究員鑒定為罌粟科紫堇屬植物賽北紫堇Corydalis impatiens（Pall.）Fisch.的干燥全草。藥材來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

稱取賽北紫堇藥材粉末4 g，加二氯甲烷-甲醇-濃氨試液（5∶1∶0.1）混合溶液40 mL，超聲處理30 min，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液[10-13];取原阿片堿對照品，加甲醇制成每1 mL含有1 mg的溶液，作為對照品溶液;吸取供試品及對照品溶液各5 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水（10∶8∶2∶0.3）為展開劑，預飽和15 min，展開，取出，晾干，噴以改良碘化鉍鉀試液，在日光下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。見圖1。

2.2 檢查與浸出物

參照2015版《中國藥典》（四部）通則水分測定法、灰分測定法、浸出物測定法對樣品進行測定，結(jié)果見表2。

由表2結(jié)果結(jié)合實際應用，初步擬定本品水分不得過14.0%，總灰分不得過13.0%，酸不溶性灰分不得過1.0%，醇浸出物含量不少于16.0%。

2.3 HPLC測定原阿片堿的含量

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗? 色譜柱：X-Bridge TM C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈-三乙胺醋酸溶液（取三乙胺5 mL，冰醋酸2 mL，加水稀釋至1000 mL）（20∶80）等度洗脫[14-18]，流速1.0 mL/min，檢測波長289 nm，柱溫25℃，進樣量5 μL。分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液進樣測定，理論板數(shù)按原阿片堿峰計算不低于3000（圖2）。

2.3.2 對照品溶液制備? 精密稱取原阿片堿對照品適量，加甲醇制成濃度為0.585 mg/mL的原阿片堿對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備? 取賽北紫堇藥材粉末1.0 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，用甲醇補足失重，濾過，取濾液，過膜，即得。

2.3.4 方法學考察? 以原阿片堿質(zhì)量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得到回歸方程：Y = 6.211X - 38.628（r = 0.9999）。表明原阿片堿在質(zhì)量濃度范圍11.71～585.80 μg/mL內(nèi)呈良好的線性關系。精密度試驗中，連續(xù)進樣6次，測得原阿片堿峰面積RSD為1.16%，表明儀器精密度良好。重復性實驗中，樣品中原阿片堿平均含量為0.12%，RSD為2.75%，表明方法重復性良好。穩(wěn)定性試驗中，24 h內(nèi)原阿片堿的RSD為1.80%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。加樣回收率試驗中，根據(jù)峰面積計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.3.5 樣品的含量測定? 取賽北紫堇藥材10批，按“2.3.3”項下供試品方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，測定樣品中原阿片堿含量，結(jié)果見表2。由表2可知，10批賽北紫堇藥材中原阿片堿含量在0.110%～0.138%之間。

2.4 HPLC-DAD指紋圖譜研究

2.4.1 色譜條件? X-Bridge TM C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈（A）-三乙胺醋酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，10%A;20～30 min，15%～18%A;60 min，22%A）[19-22];流速1.0 mL/min;檢測波長289 nm;柱溫25℃;進樣量10 μL。

2.4.2 對照品溶液制備? 精密稱取原阿片堿對照品適量，加甲醇制成濃度為0.1 mg/mL的原阿片堿對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液制備? 取本品粉末約1.0 g，精密加入甲醇40 mL，稱重，加熱回流1 h，放冷，用甲醇補足失重，過膜，即得。

2.4.4 方法學考察? 供試品溶液按“2.4.1”色譜條件連續(xù)進樣6次，各色譜峰相對保留時間和相對峰面積RSD均<1%，表明儀器精密度良好。6份樣品中各色譜峰相對保留時間和相對峰面積RSD均<3%，表明重復性良好。供試品溶液24 h內(nèi)相對保留時間和相對峰面積RSD均<2%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 賽北紫堇共有模式的建立及相似度評價? 將10批賽北紫堇藥材制備成供試品溶液，進樣測定，記錄色譜圖。采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”軟件處理，進行色譜峰匹配，確定14個共有色譜峰，建立對照圖譜（圖3）和藥材指紋圖譜（圖4），其中10號峰為原阿片堿，13號峰為比枯枯靈。根據(jù)指紋圖譜相似度評價結(jié)果，10批賽北紫堇樣品與生成的對照圖譜的相似度分別為0.946、0.990、0.957、0.986、0.933、0.952、0.953、0.995、0.986、0.960。10批樣品相似度均>0.90，且與對照指紋圖譜具有較好的一致性，表明大部分藥材樣品間差異較小，質(zhì)量穩(wěn)定性良好。

3 討論

3.1 TLC鑒別

TLC鑒別實驗前期比較了提取溶劑和提取方式，確定了最佳提取條件，并對展開體系、顯色劑種類進行考察，確定了以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水（10∶8∶2∶0.3）具有較好的分離性能，Rf值適中。

3.2 HPLC測定原阿片堿含量及指紋圖譜建立

考察了不同溶劑對原阿片堿提取效果，發(fā)現(xiàn)甲醇提取出的原阿片堿含量最高，峰形較好;同時比較了超聲、回流提取方式以及不同提取時間，確定采用甲醇加熱回流1 h的提取方式?？疾於喾N流動相體系，最終發(fā)現(xiàn)乙腈-三乙胺醋酸水溶液系統(tǒng)，峰形最佳，分離情況良好。多次調(diào)整乙腈-三乙胺醋酸水溶液比例，最終得到最優(yōu)的流動相洗脫條件。

藏藥是中華民族醫(yī)藥的瑰寶，由于地域特點和獨特的地理資源，形成了具有民族特色的醫(yī)藥理論體系，在臨床應用中效果顯著。民族藥來源廣泛，因此對藥材質(zhì)量控制和評價進行研究是十分重要的。藥效是多種成分協(xié)同作用的結(jié)果，單一的成分測定不足以評價其質(zhì)量，本研究通過建立薄層色譜和指紋圖譜及其含量測定方法，較全面地反應賽北紫堇的質(zhì)量。通過對10批賽北紫堇甲醇提取物進行HPLC指紋圖譜測定，確定了14個共有峰，并確認10號峰為原阿片堿，13號峰為比枯枯靈，并對其水分、灰分和浸出物進行測定，進一步完善藏藥賽北紫堇質(zhì)量標準，為藏藥進一步開發(fā)和利用提供依據(jù)。

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