甲狀腺乳頭狀癌組織常染色體和性染色體STR基因座變異分析

劉 奇，張海霞，董婷婷，黨 珍，侯秀迪，趙 帥，韓亞文，王業(yè)全，*，崔 文，*

(1．濟寧醫(yī)學院法醫(yī)學與醫(yī)學檢驗學院，山東濟寧 272067；2．濟寧醫(yī)學院司法鑒定中心，山東 濟寧 272013；3.青島大學醫(yī)學部，山東 青島 266071)

自20世紀90年代早期，短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats，STRs)被應(yīng)用于法醫(yī)遺傳學領(lǐng)域，經(jīng)過20多年的發(fā)展，基于復(fù)合PCR擴增和毛細管電泳(capillary electrophoresis，CE)的STR分析方法已經(jīng)成為法醫(yī)遺傳學的金標準，所得到的STR分型圖譜在犯罪案件中的個體識別、親權(quán)鑒定等司法實踐中發(fā)揮著重要作用。但是，同一個體不同組織細胞中的基因組DNA序列是一致的，這是根據(jù)DNA序列認定同一性的前提條件，并且對各STR基因座穩(wěn)定性、突變率的認識及評價都是建立在對正常人體組織驗證基礎(chǔ)之上的[1]。

當代社會中腫瘤的發(fā)病率逐年上升，在司法鑒定實踐中不可避免地會遇到要求對非正常人體組織(惡性腫瘤組織)檢材涉及的案件進行鑒定，如患者懷疑醫(yī)院調(diào)錯術(shù)后組織導致誤診，要求對醫(yī)院提供的腫瘤組織與患者自身進行鑒定。研究表明，腫瘤組織中STR基因座更容易發(fā)生高于正常組織的變異[2-3]，表現(xiàn)為：①等位基因增加(additional alleles)；②出現(xiàn)新等位基因(new alleles)；③雜合性完全丟失(loss of heterozygous)；④雜合性部分丟失(partial loss of heterozygous)[4]，因此不能照搬正常組織的評價體系作出肯定或否定評判標準。目前一些解決方法嘗試從腫瘤組織篩選更穩(wěn)定的遺傳標記，或者在STR變異的基礎(chǔ)上進行身源鑒定算法的研究或者采用顯微切割獲取腫瘤組織中腫瘤細胞鄰近正常組織等方面進行了研究。

甲狀腺癌是臨床常見的頭頸部腫瘤，屬于內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年升高。按組織病理形態(tài)可分為乳頭狀癌、濾泡癌、髓樣癌和未分化癌4種亞型，其中甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma，PTC)最常見。孫麗娟等人對9例婦科腫瘤組織進行顯微切割研究，其間質(zhì)細胞與癌旁組織的DNA分型結(jié)果完全一致，有7例腫瘤細胞與腫瘤組織的STR分型結(jié)果不一致，表明顯微切割準確分離間質(zhì)細胞可獲得腫瘤組織正確的STR分型而不受腫瘤組織的干擾，能夠代表腫瘤來源個體的正常DNA分型，是解決此類案件腫瘤組織身源鑒定的有效手段[5]。本文擬通過顯微切割技術(shù)分離腫瘤細胞和間質(zhì)細胞，選擇多態(tài)性較高的21個常染色體、27個Y染色體和16個X染色體STR基因座對腫瘤細胞、間質(zhì)細胞和癌旁正常組織進行了基因型檢測，探討甲狀腺乳頭狀癌組織STR突變情況以及顯微切割技術(shù)在PTC組織鑒定中的應(yīng)用并結(jié)合患者臨床資料進行變異相關(guān)性分析。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

收集43例病理明確診斷的甲狀腺乳頭狀癌患者手術(shù)切除的癌組織和癌旁正常組織，所用樣本均來自濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科，-80℃冷凍保存。其中男性13例，女性30例；青年組21例(20～44歲)，中老年組(≥45歲)22例；甲狀腺乳頭狀癌Ⅰ期24例，Ⅱ期11例，Ⅲ期8例[參照《AJCC腫瘤分期手冊》(第7版)]。

1.2 主要試劑和儀器

Goldeneye?DNA 22NC試劑盒(含21個常染色體STR 基 因 座 ： D4S2366、 D6S477、 GATA198B05、D15S659、D8S1132、D3S1358、D3S3045、D14S608、D17S1290、D3S1744、D2S441、D18S535、D13S325、D7S1517、D10S1435、D11S2368、D19S253、D1S1656、D7S3048、D10S1248 和 D5S2500)， Goldeneye?DNA 27YB試劑盒(含27個Y染色體STR基因座：DYS456、YGATAH4、DYS439、DYS19、DYS392、DYS576、DYS518、DYS438、DYS389II、DYS390、DYS389I、DYS393、DYS627、DYS391、DYS437、DYS570、DYS635、DYS448、DYS533、DYF387S1a/b、DYS460、DYS458、DYS481、DYS385a/b和DYS449)和Goldeneye?DNA 17X試劑盒(含16個X染色體STR基因座和1個性別鑒定基因座：DXS6795、DXS9902、DXS8378、HPRTB、GATA165B12、DXS7132、DXS7424、DXS6807、DXS6803、GATA172D05、DXS6800、DXS10134、GATA31E08、DXS10159、DXS6789、DXS6810和Amelegin)，均購自北京基點認知技術(shù)有限公司。

CM1850型冰凍切片機型冰凍切片機，Leica LMD6500激光顯微切割系統(tǒng)購自德國MICROM公司；9700型PCR擴增儀和ABI 3500遺傳分析儀均購自美國AB公司。

1.3 方法

制作甲狀腺癌樣本冰凍切片，置于聚萘二甲酸乙二醇酯(polyethylene naphthalate，PEN)膜片上，經(jīng)蘇木素染色后，用Leica LMD6500激光顯微切割系統(tǒng)分別切取一定量的腫瘤細胞和腫瘤間質(zhì)。取適量腫瘤細胞組織、腫瘤間質(zhì)和癌旁正常組織，分別置于1.5 mL離心管中，純水清洗1次，加入200μL Chelex-100，4μL蛋白酶K(20 mg/mL)和2μL DTT溶液，在振蕩器上震蕩混勻，置于恒溫振蕩器56℃過夜，然后金屬浴100℃、8 min，最后130 000 r/min離心3 min，留取上清液備用。

采 用 Goldeneye?DNA 22NC、Goldeneye?DNA 27YB(和Goldeneye?DNA 17X試劑盒，按照操作說明書，在9700擴增儀上進行擴增。采用ABI 3500遺傳分析儀分離擴增產(chǎn)物，Data Collection 3.1軟件收集數(shù)據(jù)，GeneMapper ID-X軟件分析數(shù)據(jù)得到每個樣本的STR分型。對于出現(xiàn)的STR分型變異樣本，重復(fù)檢驗1次進行確認。

1.3 統(tǒng)計分析

根據(jù)檢測結(jié)果，統(tǒng)計STR變異類型，采用計數(shù)法統(tǒng)計STR突變情況，結(jié)合患者臨床資料，應(yīng)用R3.5軟件進行卡方檢驗，探討其相關(guān)性，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 激光顯微切割

1例PTC患者癌組織樣本激光顯微切割前視野下可以清晰區(qū)分腫瘤細胞和間質(zhì)細胞(圖1A)，選取腫瘤細胞區(qū)域進行顯微切割分離腫瘤細胞(圖1B)。

圖1 甲狀腺乳頭狀癌組織腫瘤細胞顯微切割(×200)

2.2 同一個體腫瘤間質(zhì)細胞與癌旁組織STR分型結(jié)果比對

經(jīng)Goldeneye?DNA 22NC、Goldeneye?DNA 27YB和Goldeneye?DNA 17X試劑盒進行常染色體和性染色體STR基因座檢測，43例PTC患者腫瘤間質(zhì)細胞與對應(yīng)癌旁組織的STR分型一致。

2.3 同一個體腫瘤細胞與間質(zhì)細胞STR分型結(jié)果比對

43例PTC患者腫瘤細胞和間質(zhì)細胞，經(jīng)Goldeneye?DNA 22NC試劑盒進行常染色體STR基因座檢測，36例分型結(jié)果一致，有7例腫瘤細胞的STR基因座分型結(jié)果發(fā)生7次變異(圖2)。第1例腫瘤細胞在D3S1358基因座出現(xiàn)新等位基因，分型結(jié)果由15、17變異為15、16。第2例腫瘤細胞在D1S1656基因座等位基因增加，分型結(jié)果由11、15變異為11、13、15。第3例腫瘤細胞在D10S1435基因座等位基因增加，分型結(jié)果由11、13變異為11、12、13。其余4例腫瘤細胞分別在D17S1290、D5S2500、D15S659和D8S1132基因座出現(xiàn)等位基因部分雜合性丟失，分型結(jié)果分別為15、18，11、12，12、16和18、19。

43例PTC患者腫瘤細胞和間質(zhì)細胞，經(jīng)Goldeneye?DNA 17X試劑盒進行STR基因座檢測，39例分型結(jié)果一致，有4例腫瘤細胞的STR基因座分型結(jié)果發(fā)生4次變異(圖3)。第1例腫瘤細胞在DXS7424基因座等位基因增加，分型結(jié)果由15，17變異為15、16、17。第2例腫瘤細胞在DXS9902基因座出現(xiàn)新等位基因，分型結(jié)果由純合子12變異為雜合子10、12。其余2例腫瘤細胞分別在HPRTB和DXS7424基因座發(fā)生等位基因部分雜合性丟失，分型結(jié)果分別為13、14和14、15。13例PTC男性患者腫瘤細胞和間質(zhì)細胞，經(jīng)Goldeneye?DNA 27YB試劑盒進行Y染色體STR基因座檢測，分型結(jié)果一致。

43例PTC患者腫瘤細胞聯(lián)合進行常染色體和X染色體STR基因座檢測，9例腫瘤細胞的STR基因座共發(fā)生11次變異，其中等位基因增加3次，部分雜合性丟失6次，出現(xiàn)新等位基因2次。其中1例腫瘤細胞同時發(fā)生2次變異(常染色體和X染色體STR基因座各1次)，即出現(xiàn)新等位基因1次、等位基因增加1次；另1例腫瘤細胞也同時發(fā)生2次變異(常染色體和X染色體基因座各1次)，均為部分雜合性丟失。剩余7例各發(fā)生1次變異。Y染色體STR基因座沒有檢出變異。

圖2 甲狀腺乳頭狀癌細胞常染色體STR基因座變異

2.4 STR變異結(jié)合相關(guān)臨床資料分析

2.4.1 STR變異與甲狀腺乳頭狀癌分期 實驗結(jié)果結(jié)合患者臨床分期，經(jīng)Fisher's Exact Test，在21個常染色體與16個X染色體STR基因座的變異與PTC患者的臨床分期無明顯相關(guān)關(guān)系(P＞0.05)；常染色體和X染色體聯(lián)合檢測的37個STR基因座的變異與PTC患者的臨床分期無明顯相關(guān)關(guān)系(表1)。

表1 STR基因座突變與臨床分期相關(guān)性

2.4.2 STR變異與患者性別 實驗結(jié)果結(jié)合患者性別，經(jīng)Fisher's Exact Test，在21個常染色體與16個X染色體STR基因座的變異與PTC患者的性別無明顯相關(guān)關(guān)系(P＞0.05)；常染色體和X染色體聯(lián)合檢測的37個STR基因座的變異與甲狀腺乳頭狀癌患者的性別無明顯相關(guān)關(guān)系(表2)。

圖3 甲狀腺乳頭狀癌細胞X染色體STR基因座變異

表2 STR基因座突變與患者性別相關(guān)性

2.4.3 STR變異與患者年齡 實驗結(jié)果結(jié)合患者年齡，經(jīng)Fisher's Exact Test，在21個常染色體，STR基因座的變異在中老年組中變異率較高(P=0.008 9)；16個X染色體STR基因座的變異與PTC患者的年齡無明顯相關(guān)關(guān)系(P＞0.05)；常染色體和X染色體聯(lián)合檢測的37個STR基因座，變異在中老年組中變異率較高(P=0.021 3，表3)。

表3 STR基因座突變與患者年齡相關(guān)性

3 討論

STR又稱微衛(wèi)星DNA或簡單重復(fù)序列，以相對恒定的短序列作為重復(fù)單位，首尾相接，串聯(lián)連接形成。STR基因座多態(tài)性程度高、突變率低以及良好的擴增穩(wěn)定性，結(jié)合毛細管電泳可以實現(xiàn)DNA分型的標準化，因而廣泛應(yīng)用于個體識別以及親緣關(guān)系鑒定。

相較于正常組織，同一個體的惡性腫瘤組織STR基因座存在顯著的突變從而導致基因型改變，這種改變遠高于其在減數(shù)分裂過程中的自發(fā)突變?；蛐偷母淖冞`背了根據(jù)DNA序列認定同一性的前提條件，會導致錯誤的排除結(jié)論或者得不到明確的結(jié)論。STR基因座變異表現(xiàn)為DNA結(jié)構(gòu)性等位基因的大小發(fā)生改變，即等位基因增加、出現(xiàn)新等位基因；一個基因座兩個雜合子等位基因中的一個全部或部分缺失，即等位基因雜合性完全丟失、等位基因雜合性部分丟失。在這4種變異類型中，等位基因增加、出現(xiàn)新等位基因和等位基因雜合性完全丟失均可以引起基因型的改變，依據(jù)電泳圖譜可以方便的進行判斷。正常組織STR基因座經(jīng)PCR擴增和毛細管電泳后會出現(xiàn)等位基因峰信號不均衡現(xiàn)象，國際法醫(yī)遺傳協(xié)會推薦雜合性均衡比應(yīng)大于等于0.6[6]。國外曾有學者提出以腫瘤組織雜合子基因座兩等位基因峰高或峰面積比值與相應(yīng)正常組織對應(yīng)基因座兩等位基因峰高或峰面積比值的比值比(＜0.5或＞2.0)作為判斷腫瘤組織雜合性部分丟失的判定標準?？紤]到PCR擴增和毛細管電泳等因素的影響，李成濤等對腫瘤組織等位基因部分雜合性丟失的判定標準進行了適用性評估，表明以峰高比值比＜0.5或＞2.0作為部分雜合性丟失判定方法和標準適用于腫瘤組織的分型研究，即比值比=正常組織等位基因峰高比值/腫瘤組織等位基因峰高比值[7]，在本研究中以此作為雜合性部分丟失的判斷標準。

實體腫瘤組織中除含有腫瘤細胞外還含有間質(zhì)細胞、結(jié)締組織、浸潤的炎細胞等雜細胞。不同種細胞含量的差異加之個體間的差異從而導致實體腫瘤組織具有高度的不均一性，致使在分子水平不能真實反應(yīng)腫瘤細胞本身的變化[8]。激光捕獲顯微切割技術(shù)(laser capture microdissection，LCM)能夠快速、準確、無損傷的進行單細胞分離，顯著解決組織細胞異質(zhì)性的影響，是進行分子病理學及腫瘤學研究的一項重要技術(shù)。目前，LCM技術(shù)已被廣泛用于多種組織的分子生物學研究。Liu等[9]報道了1例在被檢父尸體火化后對僅保留的胃腸道腫瘤組織進行親子鑒定的案例。在腫瘤組織分型異常的情況下，采用顯微切割技術(shù)分離鄰近非腫瘤組織進行分型檢測，結(jié)果顯示非腫瘤區(qū)域DNA不存在等位基因改變，可以將其作為假設(shè)父的基因分型。劉彬等[10]通過顯微切割更精確地了解和評價不同病理類型宮頸腺癌中的HPV感染及分布狀況。因此，本文采用LCM技術(shù)分離43例PTC組織中的腫瘤細胞和間質(zhì)細胞，與癌旁正常組織進行對比，對常染色體和性染色體STR基因座的基因突變進行了分析研究。

方建新等人對13個STR位點在55例人消化系統(tǒng)腫瘤組織中的變異分析表明，有2例腫瘤組織的STR位點發(fā)生了變異，變異類型包括基因型改變、雜合型丟失和雜合雙峰不平衡，并且可以在多位點同時發(fā)生變異[1]。馬若翔等[11]對75例肺癌組織的20個常染色體STR基因座及Amelegin基因座變異規(guī)律研究顯示，癌組織變異率達32%，4種變異類型共檢出55次變異。孫麗娟等人對62例婦科惡性腫瘤組織的20個常染色體和12個X染色體STR基因座突變分析顯示，46.77%的婦科惡性腫瘤組織中觀察到4種STR突變類型[5]。本實驗選取內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一的PTC作為研究對象，旨在為特殊檢材的個體識別及親緣鑒定提供參考，并結(jié)合相關(guān)臨床資料，研究PTC組織中STR基因座的變異規(guī)律。本研究發(fā)現(xiàn)從PTC組織中分離的腫瘤鄰近間質(zhì)細胞與癌旁正常組織的DNA分型結(jié)果均一致，提示我們在無法獲取PTC患者正常組織的情形下可分離腫瘤間質(zhì)組織進行DNA分型，可代表腫瘤患者正常的基因分型。在后續(xù)實驗中中，我們將加大樣本量進一步驗證腫瘤間質(zhì)的穩(wěn)定性。聯(lián)合檢測PTC患者腫瘤細胞的常染色體和X染色體共計37個STR基因座，在9例腫瘤細胞共檢出11次變異(常染色體變異7次，X染色體變異4次)，其中等位基因增加3次，部分雜合性丟失6次，出現(xiàn)新等位基因2次，并且同一PTC腫瘤細胞可同時發(fā)生多種變異。相比于常染色體和X染色體，Y染色體STR基因座沒有觀察到變異。因此相較于正常組織或腫瘤間質(zhì)，腫瘤組織或腫瘤細胞容易發(fā)生突變，進行DNA分型時應(yīng)多加慎重。

PTC是在多基因、多因素聯(lián)合作用下，細胞生長、分化的刺激因素和基因突變因素共同作用導致甲狀腺正常細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細胞[12]。腫瘤分子生物學研究證實有兩種方式的基因變異最終導致細胞分裂和增殖活動調(diào)控失常而發(fā)生腫瘤。一種是腫瘤抑制基因(TSG)2個位點相繼點突變和雜合性缺失(LOH)變異，從而引起TSG持續(xù)功能喪失，即Knudsen“二次打擊”理論；另一種是錯配修復(fù)基因的突變導致核苷酸水平遺傳不穩(wěn)定性，稱為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability，MSI)，可導致點突變或小片段插入/缺失[13-14]。MSI改變可作為腫瘤細胞克隆的分子標志，在近年的研究中提出可將人體組織STR變異作為癌癥的易感指標之一[15]。結(jié)合目前實驗結(jié)果和患者臨床資料，我們發(fā)現(xiàn)PTC組織的STR變異與與患者臨床分期、性別關(guān)系不顯著，與患者年齡差異有統(tǒng)計學意義，說明年齡大的PTC腫瘤組織較易發(fā)生變異，故今后在此類檢材的鑒定工作中，對于年齡大的案例應(yīng)更加慎重。馬若翔等人發(fā)現(xiàn)肺癌腫瘤組織的STR變異與肺癌的病理分型、患者性別關(guān)系不大，與肺癌的分期及患者年齡差異有統(tǒng)計學意義[11]。本研究沒有發(fā)現(xiàn)PTC組織的STR變異與患者臨床分期的相關(guān)性，推測與顯微切割的樣本數(shù)目較少有關(guān)。本研究擬以存在突變的STR基因座作為PTC可能的候選基因，在下一步研究中將加大樣本量進行變異相關(guān)研究以評價其在PTC的篩查、診斷以及預(yù)后療效評價應(yīng)用的可能性。

綜上所述，在司法實踐中，基因型改變和雜合性丟失的DNA變異會嚴重影響STR分型結(jié)果。PTC腫瘤細胞中常染色體和X染色體STR基因座存在變異，而且變異更可能在年齡大的PTC組織中發(fā)生，進行STR分型時應(yīng)謹慎判型。顯微切割技術(shù)可準確區(qū)分腫瘤細胞和間質(zhì)細胞，是解決此類惡性腫瘤組織檢材涉及的案件進行身源鑒定的有效手段。鑒于本實驗樣本的有限性，在后續(xù)實驗中，我們將加大顯微切割樣本量，進一步驗證PTC腫瘤間質(zhì)的穩(wěn)定性。