遺傳毒性基因突變評價方法的研究進展

王亞楠，文海若*，王 雪*

(中國食品藥品檢定研究院，國家藥物安全評價監(jiān)測中心，藥物非臨床安全性評價研究北京市重點實驗室，北京 100176)

基因突變(genemutation)指在分子水平上基因的堿基對組成或排列順序的改變，如堿基對置換(substitution)、移碼(translocation)、缺失(deletion)、插入(insertion)等?；蛲蛔儸F(xiàn)象最初于1910年由Morgan等[1]在白眼果蠅中首次發(fā)現(xiàn)，從此奠定了染色體的遺傳理論，Morgan也因此于1933年獲得諾貝爾生理學獎。此后，人們就基因突變類型及其產(chǎn)生機制進行了大量研究?；蛲蛔兪前┌Y發(fā)生與發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，已證實的具有致癌性的物質(zhì)70%有致突變性。遺傳毒性評價為食品(保健食品)、化妝品、藥品和醫(yī)療器械上市前重要的安全性評價研究內(nèi)容，其通過一系列試驗來預(yù)測受試物的致癌性，從而降低相關(guān)接觸人群的患癌風險。2018年3月由國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒布的《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導原則》[2]中提到兩種標準試驗組合，而細菌回復(fù)突變試驗(Amestest)和一項小鼠淋巴瘤細胞tk基因突變試驗(mouselymphomaassay，MLA)是其中的重要組成部分。

與2007年起實施的《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導原則》相比，新的指導原則強調(diào)了體內(nèi)遺傳毒性試驗的重要性，并明確列出轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)突變試驗是體內(nèi)試驗的備選?？梢?，基因突變?nèi)匀皇沁z傳毒性評價的重要檢測終點。近年來，體內(nèi)Pig-a基因突變試驗也在國內(nèi)安全評價領(lǐng)域得到進一步推廣。隨著分子生物學技術(shù)的飛躍，人們逐漸就基因突變檢測方法的適用性和優(yōu)化形成新認識。本文就指導原則中涉及的Ames試驗、MLA、Pig-a基因突變試驗和轉(zhuǎn)基因動物基因突變試驗等的試驗原理、優(yōu)勢與局限及最新研究進展進行闡述。

1 細菌回復(fù)突變試驗

我們所熟知的細菌回復(fù)突變試驗，是由Ames在上世紀70年代建立并經(jīng)十多年不斷發(fā)展完善形成，俗稱Ames試驗。Ames試驗利用營養(yǎng)缺陷型菌株在不發(fā)生突變的情況下，只能分裂數(shù)次形成顯微鏡下可見的菌落，而在誘變劑作用下可通過突變自行合成氨基酸，形成肉眼可見的菌落。試驗通過對菌落計數(shù)，來評價受試物的致突變潛力。后期在組氨酸營養(yǎng)缺陷的鼠傷寒沙門氏菌的基礎(chǔ)上又引入了含抗性因子質(zhì)粒及色氨酸營養(yǎng)缺陷的大腸桿菌，進一步優(yōu)化了試驗的檢測譜和檢測靈敏度。Ames試驗流程如圖1所示[3]。

當前常用的Ames菌株包括TA97/TA97a、TA98、TAl00、TAl02、TAl04、TA1535、TA1537、WP2uvrA等。不同菌株檢測的突變類型有差異，如TA98和TA1537的檢測對象為移碼型突變，而TA100、TA102、TA1535、WP2uvrA等檢測對象為堿基對置換型突變[4]。因Ames試驗方法操作較為簡便、試驗周期短，又與化學物質(zhì)的潛在致癌性評價緊密相關(guān)，故在食品、藥品、化妝品、醫(yī)療器械等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。然而，不同的研究領(lǐng)域?qū)τ诰甑倪x擇也存在一定的差異(表1)。

表1 不同研究領(lǐng)域Ames試驗中建議采用的菌株[4]

圖1 Ames試驗流程示意圖

盡管Ames試驗是基于細菌試驗體系的致突變性評價方法，但它對嚙齒類動物致癌性預(yù)測效果優(yōu)于其他基于哺乳動物細胞試驗體系的遺傳毒性評價方法，可檢出87.5%的恒河猴體內(nèi)致癌物[5]。此外，Ames試驗也是化合物構(gòu)效關(guān)系(quantitative structure-activity relationship，QSAR)遺傳毒性篩選數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的重要基礎(chǔ)，是環(huán)境誘變劑和新藥研發(fā)初篩的首選遺傳毒性試驗方法[6]。盡管Ames試驗具有不可替代的優(yōu)勢，但也存在一定短板。例如，大部分中藥受試物為混合物，檢測樣本中可能含有色氨酸或組氨酸，對Ames試驗結(jié)果產(chǎn)生影響。而一些具有抗菌功能的醫(yī)療器械產(chǎn)品也不適宜使用Ames試驗來評價[7]。又如，有的中藥或納米材料本身顏色較深，可對瓊脂及菌落染色，從而對計數(shù)結(jié)果的準確性產(chǎn)生一定影響。此外，使用Ames試驗來檢測納米材料的適用性也受到了一定質(zhì)疑[8]：堿性的固態(tài)培養(yǎng)條件，菌壁較厚且攜帶負電荷的革蘭氏陰性菌均可導致納米材料無法與細菌充分接觸。馬茂才等[9]研究發(fā)現(xiàn)在有或無添加S9體外代謝活化條件的情況下，2種不同濃度的光催化納米材料對菌株TA97、TA98、TA100和TA102的誘發(fā)回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，即均未呈現(xiàn)致突變作用；而受試物在彗星、微核等試驗中結(jié)果均為陽性。針對上述困境，有人提出可開展液態(tài)培養(yǎng)條件下酸化處理過的“波動Ames試驗”，通過增加細菌對納米材料的吞噬來提高檢出率[10]。

作為最可靠的遺傳毒性評價方法，科研人員長期以來對Ames試驗方法進行了各種優(yōu)化和改進，從而更好地發(fā)揮其長處?；?孔板(mini-Ames)和24孔板(micro-Ames)的Ames試驗可有效減少受試物的用量，僅為標準平皿(10 cm2)的1/5和1/20。研究提示mini-Ames與標準平皿Ames試驗結(jié)果的一致性可達95%～98%，可很好地應(yīng)用于藥物遺傳毒性早期的快速篩選[11]?！案咄俊笔乾F(xiàn)代毒理學研究的關(guān)鍵詞，除96板和384孔板液態(tài)培養(yǎng)及顯色的“波動Ames試驗”和Ames II以外，Ames試驗也通過構(gòu)建含熒光報告基因質(zhì)粒來實現(xiàn)高通量化[12]。經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)的藥物遺傳毒性試驗Ames試驗指導原則于1997年首次發(fā)布，當前OECD正在收集基于微孔板(含6孔、24孔、96孔及384孔)Ames試驗的背景數(shù)據(jù)及試驗操作細節(jié)，用于進行指導原則更新，從而使這項經(jīng)典試驗更好地服務(wù)于監(jiān)管和安全評價領(lǐng)域。

2 小鼠淋巴瘤細胞基因突變實驗

以哺乳動物為試驗體系的MLA是以tk基因突變?yōu)闄z測終點的試驗方法。tk基因編碼的胸苷激酶(thymidine kinase，TK)在無突變時可通過將胸苷或其類似物如三氟胸苷(trifluorothymidine，TFT)整合入DNA序列導致DNA的失活和細胞死亡，而突變后的tk基因則無法將TFT整合進入DNA。因此，可通過檢測細胞在給予TFT后的存活率，來檢測是否存在致突變劑[13]。常用的試驗方法包括軟瓊脂法和微孔法，兩者對比見表2，微孔法在醫(yī)療器械及藥物安全評價研究中較為常用。

表2 軟瓊脂法和微孔法優(yōu)缺點比較[14]

MLA可以克服Ames試驗的某些缺陷，當Ames試驗不適用時，是備選的基因突變評價方法。如國內(nèi)醫(yī)療器械遺傳毒性評價標準(GB/T 16886.3-2008)中將哺乳動物細胞基因突變試驗(多為MLA)明確列入遺傳毒性評價必選項目中。對于具有殺菌或者抑菌作用的醫(yī)療器械產(chǎn)品，哺乳動物細胞基因突變試驗的結(jié)果更有價值。然而也有文獻指出[15]，Ames試驗和體外微核試驗兩項已足夠用于預(yù)測嚙齒類動物致癌性和體內(nèi)遺傳毒性，在兩者的基礎(chǔ)上增加MLA后，檢出率僅從78%(316/405)提高至79.5%(322/405)。此外，tk基因自身存在tk+/+，tk+/-及tk-/-等多個基因型，在進行致突變研究之前，應(yīng)對所需的基因型進行篩選，確保試驗中所用的細胞表達目的基因型(即tk+/-)。

檢測tk基因突變使用的細胞株包括小鼠淋巴瘤L5178Y以及人類淋巴母細胞TK6以及TK-E6等，MLA是以小鼠淋巴瘤L5178Y細胞為試驗體系。與tk基因突變有相似之處的hprt基因突變是以hprt作為突變檢測位點進行的哺乳動物細胞體外遺傳毒性檢測試驗方法。hprt基因編碼的次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase，HPRT)參與細胞內(nèi)嘌呤補救代謝途徑，自身的缺乏或活性降低會引起核酸代謝異常，在無突變時可將嘌呤或其類似物如6-硫鳥嘌呤(6-Thioguanine，6-TG)整合入DNA序列，而導致DNA的失活及細胞死亡，而當hprt基因突變后則無法將6-TG整合進入DNA，根據(jù)此原理來檢測hprt基因是否存在突變。張勇等[16]對TK6和TK-E6細胞tk和hprt基因突變進行了比較，其中將TK6和TK-E6兩種細胞相比較：TK6-E6細胞的tk突變試驗敏感性高，兩種細胞在hprt位點敏感性一致。然而，不同細胞或者同一種細胞tk位點的突變敏感性均較hprt位點突變敏感性高，這主要與tk基因和hprt基因自身特點不同有關(guān)(表3)。有研究分別就L5178Y細胞與CHO細胞的tk基因突變試驗和hprt基因突變試驗結(jié)果進行對比，也得到一致結(jié)論[17]。OECD于2015年新增了TG490體外哺乳動物細胞tk基因突變試驗，并新修訂頒布了TG476體外哺乳動物細胞hprt和xprt基因突變試驗。hprt基因的自發(fā)突變頻率較低但特異性高，可與tk基因突變形成互補。

表3 tk基因突變與hprt基因突變的比較[17-18]

3 Pig-a基因突變試驗

使用正常動物開展的體內(nèi)Pig-a基因突變試驗，是近年來逐漸走入安全評價領(lǐng)域并受到廣泛重視的一項致突變性評價方法。位于人X染色體上的Pig-a基因發(fā)生突變時，可導致糖化磷脂酰肌醇(glycosylphos-phatidyl inositol，GPI)合成障礙，并進一步使細胞GPI錨蛋白缺失(圖2[19])。Araten等[20]于1999年提出可以Pig-a基因作為報告基因建立體內(nèi)基因突變試驗方法，并逐漸將此方法推向臨床前遺傳毒性評價。由于GPI錨在不同物種間的生物合成高度保守，而且其合成起源于骨髓干細胞，在各類組織細胞及各類成熟紅細胞中均有表達，因此，理論上Pig-a基因突變試驗可在不同動物種屬和不同類型組織中開展。但由于具體實體組織在進行單細胞懸液的制備過程中，會引起細胞表面重要靶蛋白的缺失或結(jié)構(gòu)的異常，故試驗中采用外周血為主要檢測對象。體內(nèi)Pig-a基因突變試驗常用的檢測方法主要包括流式細胞術(shù)檢測法和有限稀釋克隆法。流式細胞術(shù)方法利用Pig-a基因發(fā)生突變后細胞表面GPI錨合成異常，導致細胞表面錨鏈蛋白(如CD48、CD55、CD59等)缺失，從而可利用熒光標記GPI錨鏈蛋白以區(qū)分突變細胞與正常細胞，并使用另外一種熒光標記抗體和(或)流式設(shè)門策略將不同細胞群區(qū)分，來檢測目標細胞群中突變細胞的數(shù)量。而有限稀釋克隆法利用細菌原毒素氣單胞菌溶素前體(proaerolysin，ProAER)可通過直接與正常細胞的GPI錨(而不是錨鏈蛋白)特異性結(jié)合誘導細胞膜完整性受損以致細胞死亡。存在Pig-a基因突變的細胞表面無法正常合成GPI錨時，氣單胞菌溶素無法與GPI錨特異性結(jié)合，細胞得以存活；反之，Pig-a基因突變可致細胞死亡。Pig-a基因突變試驗運用了上述試驗原理對受試物誘導基因突變的潛力進行檢測[21]。Dertinger等[22]在國際聯(lián)合驗證過程中進一步將高通量免疫磁性篩選技術(shù)高通量方法引入Pig-a基因突變試驗，從而有效提高了細胞分析的數(shù)量與統(tǒng)計功效。

圖2 Pig-a基因突變原理示意圖

體內(nèi)Pig-a基因突變試驗的靈敏性和特異性已得到驗證。一項41種化合物的大鼠Pig-a基因突變試驗驗證數(shù)據(jù)顯示，大部分預(yù)期在試驗中呈現(xiàn)陽性反應(yīng)的受試物均可導致Pig-a基因突變[23]。除直接與DNA反應(yīng)的烷化劑外，需經(jīng)體內(nèi)代謝活化后的遺傳毒性陽性化合物，如2-乙酰氨基芴(2-acetylaminofluorene，2-AAF)、馬兜鈴酸(aristolochic acids，AAs)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CY)、二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)、苯并[a]芘(benzo[a]pyrene，B[a]P)和7,12-二甲基苯并[a]蒽(7,12-dimethylbenz[a]anthracene，DMBA)等也可在Pig-a基因突變試驗中獲得陽性結(jié)果[24-25]。此外，Pig-a基因突變試驗對于鹽酸哌醋甲酯(methylphenidate hydrochloride，MPH)和芘(pyrene，Pyr)等非遺傳毒性化合物也呈現(xiàn)較好的特異性。該方法有望成為體內(nèi)試驗中第二個遺傳學終點檢測的候選。流式法檢測Pig-a基因突變較為簡便，該方法以外周血為監(jiān)測窗，除在臨床前研究中更適合與重復(fù)給藥毒性試驗結(jié)合外，在職業(yè)暴露人群的環(huán)境誘變劑監(jiān)測和臨床抗腫瘤治療療效動態(tài)監(jiān)測方面也有重要的應(yīng)用價值[26]。然而，因體內(nèi)Pig-a試驗通常使用外周血開展，當受試物(如某些納米材料)具有特殊的體內(nèi)代謝動力學特征時，外周血的濃度不能代表其組織分布濃度，此時Pig-a基因突變試驗的選擇應(yīng)謹慎。當前體內(nèi)Pig-a基因突變試驗指導原則的確立也列入了OECD的工作日程，計劃于2020年正式發(fā)布。

近年來，以人類B淋巴細胞樣細胞系TK6、MCL-5以及L5178Y等哺乳動物細胞系開展的Pig-a基因突變試驗也取得了一些進展。當Ames試驗結(jié)果不明確時，可選擇體外Pig-a基因突變試驗作為后續(xù)選擇。研究[27]提示，使用不同細胞系開展體外Pig-a基因突變試驗的結(jié)果可存在一定差異(不同細胞系自發(fā)突變率不同)。Krüger等[28]指出TK6細胞系在未處理的對照細胞中顯示GPI(-)自發(fā)突變率較高，檢測前需對GPI(-)進行清除以降低背景值。常規(guī)用于開展MLA的小鼠淋巴瘤細胞系L5178Y也可用于Pig-a基因突變試驗，該細胞的自發(fā)突變率低于TK6細胞，這與TK6細胞中Pig-l基因的缺失有關(guān)。另外，也可收集經(jīng)受試物處理的細胞克隆的Pig-a mRNA進行測序，來分析GPI(-)受試物作用后產(chǎn)生的基因突變特點。文獻報道，L5178Y細胞經(jīng)EMS處理后對其Pig-a mRNA進行測序，其突變特點主要表現(xiàn)為C-T轉(zhuǎn)換，與文獻報道相符[27，29]。體外Pig-a基因突變試驗具有周期長(一般采用受試物處理后表達8 d進行檢測)、不使用動物和適于進行機制研究的優(yōu)勢，但在正式走進安全評價領(lǐng)域之前，在細胞選擇和標準化試驗方法的驗證等方面還需要開展大量工作。

4 轉(zhuǎn)基因動物試驗

體內(nèi)遺傳毒性試驗的優(yōu)點在于它的檢測內(nèi)容涵蓋受試物進入體內(nèi)并發(fā)揮作用的全程，可較好地模擬藥物在機體內(nèi)吸收、分布、排泄、代謝并產(chǎn)生毒性的過程。轉(zhuǎn)基因嚙齒動物基因突變模型作為經(jīng)典的體內(nèi)遺傳毒性評價方法至今已有二十多年的歷史。該方法突破了體內(nèi)遺傳毒性評價方法僅使用造血組織為檢測終點的局限，可就肝、腎等不同組織的基因突變進行檢測，對受試物的體內(nèi)基因突變靶組織進行有效預(yù)測。可商業(yè)購買到的模型包括轉(zhuǎn)基因小鼠MutaTMMouse和BigBlue等，這兩種轉(zhuǎn)基因嚙齒動物模型均基于λ噬菌體體外包裝原理。兩者分別以lacZ和lacI為靶基因并使用轉(zhuǎn)基因小鼠作為轉(zhuǎn)基因受體，動物給予受試物后，通過分離不同組織來檢測相應(yīng)基因的突變率(圖3[30])。OECD已于2011年頒布了TG488轉(zhuǎn)基因動物突變試驗的指導原則，然而因轉(zhuǎn)基因動物成本較高，較大程度上限制了其應(yīng)用范圍。

圖3 轉(zhuǎn)基因動物示意圖

國內(nèi)已使用轉(zhuǎn)基因動物對馬兜鈴酸的遺傳毒性及其致突變特性進行評價。欒洋等[31]使用LC-ESI-MS-MS和gpt delta轉(zhuǎn)基因小鼠來確定腎臟中馬兜鈴酸I(aristolochic acid I，AAI)和馬兜鈴酸II(AAII)誘導的gpt基因DNA加合物的突變頻率以及它們各自的突變譜特征，結(jié)果顯示，溶劑對照組腎臟中g(shù)pt基因的自發(fā)突變率為2.37×10-6；AAI 1 mg/kg組(6.67×10-6)和AAI 5 mg/kg組的gpt基因突變率(16.72×10-6)分別比溶劑對照組高2.8和7.0倍；AAII 1 mg/kg組gpt基因的突變率(9.54×10-6)和AAII 5 mg/kg組(32.00×10-6)分別比溶劑對照組高4.0和13.5倍；5 mg/kg時AAII誘導的突變率幾乎是AAI誘導的兩倍。

此外，轉(zhuǎn)基因嚙齒動物培養(yǎng)細胞突變試驗也成為相應(yīng)體內(nèi)致突變性試驗可行的替代方法。如使用從C57BL/6或B6C3F1遺傳背景的BigBlue小鼠胚胎中分離的原代小鼠胚胎成纖維細胞或從轉(zhuǎn)基因BigBlue動物各種組織/器官制備的原代細胞進行細胞突變試驗。因該方法使用原代組織細胞開展，非常適用于可疑誘變劑的初始測試[32]。

5 小結(jié)

隨著新型藥物的涌現(xiàn)以及對藥物評價試驗要求的不斷提高，傳統(tǒng)的試驗體系也歷經(jīng)了一系列優(yōu)化。然而，不同的致突變新檢測方法對不同檢測品種的適用性及其優(yōu)勢和局限不盡相同(表4)。本文就臨床前安全性評價領(lǐng)域常用的，尤其是新版《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導原則》涉及的基因突變評價方法及研究進展進行總結(jié)，以期為相關(guān)科研及安全評價工作者提供借鑒。

表4 不同遺傳毒性致突變檢測方法的比較