膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分子標(biāo)志物的研究進(jìn)展

余明辰，吳 楠，孫冬琳，金 焰*

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究室，黑龍江 哈爾濱 150081)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤占整個(gè)腦膠質(zhì)瘤比例的60%以上。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，GBM)是最常見的、惡性程度最高的原發(fā)顱內(nèi)腫瘤，約占40%～60%。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤呈現(xiàn)的高侵襲性、高增殖性等高度惡性生物學(xué)行為嚴(yán)重限制著腫瘤患者的總生存期[1]。目前認(rèn)為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤尚無法治愈，常用的積極治療方法包括最大安全范圍手術(shù)切除、輔助放療以及同時(shí)輔助替莫唑胺治療。即便如此，在這種積極的組合治療后，患者的中位生存期仍僅為15個(gè)月[2]。本文將對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中主要臨床相關(guān)的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)異常，如IDH1/2、EGFR、PDGFRA和NF1等基因的突變、MGMT基因啟動(dòng)子甲基化改變、hTERT啟動(dòng)子突變及相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA進(jìn)行闡述。這些標(biāo)志物對(duì)進(jìn)一步完善膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的分類、提高診斷的準(zhǔn)確性、判斷患者的預(yù)后水平、未來研發(fā)有效的分子靶向治療藥物有重要的參考意義。

1 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的分子分型

腦膠質(zhì)瘤在國(guó)際上常用的病理分型為世界衛(wèi)生組織(World HealthOrganization，WHO)制定的分級(jí)系統(tǒng)，分為I級(jí)(惡性程度最低、預(yù)后最好)到IV級(jí)(惡性程度最高、預(yù)后最差)，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)應(yīng)WHOIV級(jí)膠質(zhì)瘤。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤主要分為兩大類，即“原發(fā)性”和“繼發(fā)性”。原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤通常出現(xiàn)在沒有已知的臨床癌前病變的情況下，而繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是較低級(jí)別的膠質(zhì)瘤隨著時(shí)間推移由于分子進(jìn)展和惡性程度增加而形成的。

近年來，研究人員利用高通量基因組、表觀遺傳基因組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法對(duì)膠質(zhì)瘤進(jìn)行了詳細(xì)的分子表征分析，識(shí)別出了特異性和高度重復(fù)的分子改變，并對(duì)膠質(zhì)瘤的分類引入新的概念。2010年，Verhaak等人根據(jù)美國(guó)癌癥基因組圖譜計(jì)劃(The CancerGenomeAtlas，TCGA)中腦膠質(zhì)瘤基因轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究分析，將膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分為4種亞型：前神經(jīng)元型(proneural)、神經(jīng)元型(neural)、經(jīng)典型(classical)、間質(zhì)型(mesenchymal)[3](圖1)。其中，前神經(jīng)元型、經(jīng)典型、間質(zhì)型腫瘤大量富集EGFR、PDGFRA、IDH1/2和NF1基因的突變。經(jīng)典型以EGFR基因擴(kuò)增/突變?yōu)樘卣鳌Ｇ吧窠?jīng)元型主要表現(xiàn)為PDGFRA突變或IDH1/2突變，基于與IDH1/2突變狀態(tài)直接相關(guān)的特征性DNA甲基化模式，前神經(jīng)元型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤被進(jìn)一步細(xì)分為膠質(zhì)瘤CpG(glioma-CpGislandmethylatorphenotype，G-CIMP)陽性和陰性亞組[4]。間質(zhì)型主要存在神經(jīng)纖維蛋白1(neurofibromatosis type1，NF1)突變，間質(zhì)型的特征主要受轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signaltransducersandactivatorsoftranscription 3，STAT3)，CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-β(C/EBPβ)和具有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子(transcriptionalcoactivatorwith PDZ-bindingmotif，TAZ)表達(dá)水平的調(diào)控，這些因子也與不良的臨床預(yù)后有關(guān)[5-6]。此外，最近的研究表明，CTNND2(編碼catenin-δ2)和RHPN2分別作為間質(zhì)型轉(zhuǎn)化的陰性和陽性遺傳調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用[6-7]。

圖1 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分子分型[3]

許多研究組正在研究前神經(jīng)元型和間質(zhì)型的特征以及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的其他轉(zhuǎn)錄亞型是否可作為患者預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。雖然前神經(jīng)元型整體上傾向與更好的預(yù)后相關(guān)，但更進(jìn)一步的研究表明，前神經(jīng)元型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤可以細(xì)分為IDH1/2突變的G-CIMP陽性和陰性亞組，并且一旦IDH1/2和G-CIMP均未突變，前神經(jīng)元型與其他IDH1/2野生型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤相比惡性程度和患者預(yù)后均無較大差別[8]。

2 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中臨床相關(guān)的遺傳和表觀遺傳學(xué)異常

2.1 異檸檬酸脫氫酶1和2(IDH1/2)基因突變

異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)是三羧酸循環(huán)中重要催化酶，包含IDH1、IDH2、IDH3三種同工酶。在三羧酸循環(huán)中，IDH將異檸檬酸氧化脫羧產(chǎn)生α-酮戊二酸(α-KG)和NADPH，為細(xì)胞的正常代謝和生物合成提供必要的原料。

在膠質(zhì)瘤中，IDH1基因突變主要發(fā)生在R132，IDH2基因突變發(fā)生在R172，突變將導(dǎo)致該位點(diǎn)密碼子被其他氨基酸殘基取代[9]，造成蛋白酶功能的改變。突變后的IDH將消耗α-酮戊二酸、NADPH并催化產(chǎn)生致癌代謝物2-羥基戊二酸(2-HG)使其大量積聚最終促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展[10-14]。

約60%～80%的Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤和高達(dá)90%繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)生IDH1/2基因突變。其中IDH1-R132H位點(diǎn)的突變頻率最高，約占95%左右，IDH2突變頻率較低。IDH基因突變較多發(fā)于青年患者。但在膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后評(píng)價(jià)方面，IDH突變的出現(xiàn)也通常意味著患者有更長(zhǎng)的總生存期和無進(jìn)展生存期[12，15]。有研究顯示，與野生型相比IDH基因突變可以增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性[16-17]。

2.2 表皮生長(zhǎng)因子受體異常激活

表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是表皮生長(zhǎng)因子細(xì)胞增殖和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的酪氨酸激酶型受體，該基因定位于7號(hào)常染色體p12，所編碼的蛋白包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域：胞外配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)激酶區(qū)。當(dāng)EGFR經(jīng)其配體活化后，可形成二聚體導(dǎo)致其胞外的構(gòu)象變化，并激活胞內(nèi)區(qū)酪氨酸激酶使其殘基磷酸化，這種自身磷酸化可以激活下游信號(hào)通路的磷酸化，如MAPK，Akt和JNK通路，最終促進(jìn)了腫瘤發(fā)生的一系列生物學(xué)行為，如腫瘤的發(fā)生發(fā)展、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等。

約40%的原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中攜帶EGFR基因的擴(kuò)增[18-20]，其中，約50%EGFR擴(kuò)增的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在該基因中存在組成型活性變體EGFRvIII突變，這種突變通常與腫瘤生長(zhǎng)和更差的臨床療效有關(guān)。EGFRvIII突變涉及基因重排，通過框內(nèi)缺失編碼該蛋白的部分胞外結(jié)構(gòu)域的外顯子2-7而產(chǎn)生[21-23]一個(gè)新的甘氨酸，這使得EGFRvIII缺失了胞外配體結(jié)合區(qū)的267個(gè)氨基酸位點(diǎn)，致使其激活不依賴傳統(tǒng)的受體配體結(jié)合。

有研究表示在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中EGFRvIII的異位過表達(dá)可誘導(dǎo)致瘤性、細(xì)胞增殖、導(dǎo)致相關(guān)下游通路的激活，如PI3K/AKT信號(hào)通路，還可通過調(diào)節(jié)Bcl-XL基因表達(dá)來抵抗細(xì)胞凋亡等惡性生物學(xué)行為[24]。目前，EGFRvIII的缺失突變可用作免疫原性腫瘤特異性靶點(diǎn)的新型肽序列，用于開發(fā)基于肽段的疫苗接種治療方法。

2.3 血小板源性生長(zhǎng)因子受體異常激活

血小板源性生長(zhǎng)因子受體(platelet-derived growth factor receptors，PDGFR)為血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)蛋白質(zhì)家族的受體，是一種位于細(xì)胞膜表面的酪氨酸激酶受體，參與細(xì)胞的趨化、分裂和增殖。血小板源性生長(zhǎng)因子及其受體的異常激活和表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤新生血管形成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移。

在30%的人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，有與PDGFR信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的基因表達(dá)。在15%的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的中發(fā)現(xiàn)α型PDGFR(PDGFRA)基因的擴(kuò)增，其為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的前神經(jīng)元亞型的特征性標(biāo)志[3，25]，并且約40%攜帶基因擴(kuò)增的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤含有該基因的內(nèi)部缺失，并將這種缺失稱為PDGFRAΔ8，9[26]。PDGFRAΔ8，9由含有243個(gè)堿基對(duì)的外顯子8和9的框內(nèi)缺失導(dǎo)致細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域截短產(chǎn)生，該缺失可能與PDGFRA的激活有關(guān)[27]。除了這種最常見缺失之外，還可檢測(cè)到PDGFRA的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和KDR/VEGFR-2的胞外結(jié)構(gòu)域可發(fā)生框內(nèi)基因融合，以及出現(xiàn)較少的PDGFRA點(diǎn)突變[28]。類似于EGFR和EGFRvIII，PDGF和PDGFR的擴(kuò)增可能促進(jìn)了侵襲性膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)。Assanah等[29-30]研究表明，用表達(dá)PDGF的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)新生大鼠側(cè)腦室視管膜下層的細(xì)胞可產(chǎn)生類似膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的大的彌散性腫瘤。他們發(fā)現(xiàn)在這些腫瘤中，PDGF表達(dá)通過自分泌和旁分泌信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤形成，從而推動(dòng)異質(zhì)性惡性膠質(zhì)瘤的進(jìn)化。

2.4 1型神經(jīng)纖維瘤病基因異常

TCGA高通量測(cè)序分析表明，在約14%～23%的膠質(zhì)瘤樣本中1型神經(jīng)纖維瘤病基因(neurofibromatosis type 1，NF1)通過遺傳缺失或突變而失活。NF1突變是間質(zhì)型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤最常見的遺傳變異，約占51%，并提示更差的患者預(yù)后[3，31]。NF1基因突變導(dǎo)致其mRNA翻譯提前終止，最終影響NF1蛋白功能。NF1是重要的負(fù)向調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中Ras和MTOR信號(hào)通路的腫瘤抑制因子，表達(dá)下降或突變會(huì)促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展。利用NF1缺陷型原代小鼠誘導(dǎo)的原位膠質(zhì)瘤模型，揭示了NF1的缺失導(dǎo)致細(xì)胞增殖和遷移增強(qiáng)，并發(fā)現(xiàn)該惡性表型依賴于RAS信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)的MTOR的過度激活。并且這種情況下MTOR不依賴于延伸因子4E結(jié)合蛋白1(4EBP-1)/S6激酶誘導(dǎo)的雷帕霉素敏感的Rac1 GTPase激活[21]。而STAT3是NF1的另一個(gè)下游靶點(diǎn)，以MTORC1和Rac1依賴性方式調(diào)節(jié)并增加細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)[32]。此外。有研究表明NF1促進(jìn)了小兒腦膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展，并且這種惡性表型受到雌性激素的調(diào)節(jié)[33]。

2.5 O-6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子區(qū)甲基化

O-6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)基因是膠質(zhì)瘤中重要的耐藥基因，位于10號(hào)染色體q26位點(diǎn)，所編碼的蛋白是一種DNA修復(fù)酶，該酶從O-6-甲基鳥嘌呤還原鳥嘌呤的能力可調(diào)節(jié)對(duì)烷化劑敏感性。替莫唑胺是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤臨床上的一線化療藥物，為咪唑并四嗪類具有抗腫瘤活性的烷化劑。O-6-甲基鳥嘌呤是一種由化療藥物如替莫唑胺的烷化劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的基因組損傷產(chǎn)物。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，特定基因座上幾個(gè)基因的啟動(dòng)子被高甲基化，并且經(jīng)常導(dǎo)致腫瘤抑制基因的表達(dá)改變，例如細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A(cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A)，RB1，PTEN和TP53等[34-37]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在臨床上最重要的DNA甲基化標(biāo)志物之一是MGMT的啟動(dòng)子，其在大約40%的原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中發(fā)現(xiàn)并且與MGMT基因的轉(zhuǎn)錄沉默相關(guān)，證明MGMT啟動(dòng)子的高甲基化可作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤烷基化化療的預(yù)測(cè)指標(biāo)[38-39]。許多臨床試驗(yàn)和隊(duì)列研究顯示MGMT基因的啟動(dòng)子甲基化與用烷化劑治療患者的無進(jìn)展生存期和總生存期延長(zhǎng)相關(guān)[38，40-42]。

2.6 人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子突變

人類端粒酶是一種核糖核蛋白，可調(diào)控染色體末端的端粒DNA長(zhǎng)度，在細(xì)胞永生化和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。癌癥的標(biāo)志之一是端粒維持機(jī)制的異常調(diào)控，該過程受端粒酶的調(diào)節(jié)，在90%的晚期癌癥中端粒酶都有活性。人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)是端粒酶復(fù)合物的催化亞基，其表達(dá)與大多數(shù)腫瘤如乳腺癌，肉瘤和腦腫瘤的預(yù)后不良有關(guān)[43-46]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，TERT啟動(dòng)子突變?cè)诙喾N癌癥類型中頻繁出現(xiàn)，包括黑色素瘤、脂肪肉瘤、膀胱癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤[47-49]。有趣的是，膠質(zhì)瘤的基因組分析顯示，TERT啟動(dòng)子突變發(fā)生在70%～80%的原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和70%以上的少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤中，但在IDH1/2突變彌漫性和間變性星形細(xì)胞瘤以及IDH1/2突變發(fā)生較少而攜帶高頻的ATRX突變的(繼發(fā)性)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中較少發(fā)生[50-51]。TERT啟動(dòng)子突變?cè)趦和z質(zhì)母細(xì)胞瘤中也很少見，其特征在于組蛋白H3.3(H3F3A)突變，其通常與TP53和ATRX/DAXX突變相關(guān)[52]。一般來說，TERT啟動(dòng)子突變并攜帶IDH1/2野生型的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的總生存期較差。TERT啟動(dòng)子突變分析可作為原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的一種新型預(yù)后指標(biāo)，TERT啟動(dòng)子突變，EGFR擴(kuò)增和IDH1/2突變等的聯(lián)合分析為鑒定膠質(zhì)瘤分子分型和預(yù)后作出重要判斷[49]。

2.7 BRAF突變

B-Raf原癌基因，絲氨酸/蘇氨酸激酶(B-Raf protooncogene，serine/threonine kinase，BRAF)基因位于人染色體7q34，是MAPK信號(hào)通路重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，主要借助有絲蛋白激酶通路中的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶來行使其功能，參與細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)事件。在BRAF密碼子600處激活錯(cuò)義突變?cè)趲追N神經(jīng)上皮腫瘤中很常見，其中最常見的是V600E突變。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，大約5%的病例檢測(cè)到BRAF V600E突變[53-54]。具有上皮分化組織學(xué)特征的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中報(bào)道了BRAF突變的頻率增高，即“上皮性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤”，其優(yōu)先在兒童和年輕成人中表現(xiàn)出，并且在超過50%的病例中攜帶BRAF V600E突變[55]。然而用索拉非尼——一種靶向BRAF，VEGFR，PDGFR和c-KIT的多激酶抑制劑治療兒童低級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者，卻導(dǎo)致了腫瘤生長(zhǎng)的意外加速，甚至在BRAF突變腫瘤患者中也出現(xiàn)了這種情況[56]。但在一個(gè)2014年的病例顯示用BRAF抑制劑維莫非尼治療后，BRAF V600E突變的兒童膠質(zhì)母細(xì)胞瘤完全消退[57]。因此，通過DNA測(cè)序或使用BRAF V600E特異性抗體免疫組織化學(xué)進(jìn)行BRAF突變的分子檢測(cè)，可能會(huì)在小部分膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中發(fā)現(xiàn)潛在的新型靶向治療選擇。

2.8 長(zhǎng)鏈非編碼RNA

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸無蛋白編碼功能的RNA分子。LncRNA通過轉(zhuǎn)錄或者轉(zhuǎn)錄后修飾調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)生物學(xué)功能[58]。在腦膠質(zhì)瘤中，LncRNA參與多種惡性生物學(xué)行為。通過作為miRNA海綿或調(diào)節(jié)表觀遺傳等生物學(xué)機(jī)制，影響腦膠質(zhì)瘤的DNA損傷，細(xì)胞周期調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[59]。

在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，LncRNA MALAT1已經(jīng)被報(bào)道促進(jìn)GBM的替莫唑胺耐藥，并且靶向MALAT1的納米化合物可使GBM對(duì)替莫唑胺化療敏感[60]。有研究表明，LINC01446的高表達(dá)作為靶向TPT1的miR-489-3p的分子海綿，促進(jìn)GBM惡性生物學(xué)行為并伴隨較差的患者預(yù)后[61]。LncRNA HOTAIR受溴結(jié)構(gòu)域蛋白BRD4調(diào)控，進(jìn)而調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期[62]。近年來，隨著lncRNA研究日趨火熱，針對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的個(gè)體化治療和診斷有指導(dǎo)意義的靶向lncRNA分子還在不斷地發(fā)現(xiàn)和探索中。

3 結(jié)語

目前，臨床治療中已有各種特異類型的分子標(biāo)記物應(yīng)用于臨床診斷和判斷患者預(yù)后水平，如IDH1/2基因突變檢測(cè)，MGMT甲基化檢測(cè)等特異性突變檢測(cè)和基因組學(xué)方法的實(shí)際應(yīng)用。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中基因和分子的畸變?yōu)榻⑦m當(dāng)?shù)呐R床相關(guān)生物標(biāo)志物提供了基礎(chǔ)，并有待開發(fā)新的治療方法。我們正處于從膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分子分類研究進(jìn)展為更有效的靶向治療研究的階段。同時(shí)，遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)錄譜的多平臺(tái)分析證明這些分子標(biāo)志物可用于改進(jìn)腦腫瘤的分類并預(yù)測(cè)患者預(yù)后水平。希望這種精確診斷療法可以使得患者的預(yù)后水平逐步改善，將有效的治療方法與患者的分子亞型進(jìn)行匹配。雖然隨著分子分型的研究日趨火熱，但我們?nèi)匀慌c膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的實(shí)質(zhì)性改善和最終治愈有很大的距離。精準(zhǔn)的分型和生物學(xué)理解雖然是個(gè)性化治療的一個(gè)關(guān)鍵特征，但它只是其中的一個(gè)組成部分，還需與藥物的研發(fā)和改善患者預(yù)后水平總體目標(biāo)的模式相輔相成。