XRCC3基因多態(tài)性與西北地區(qū)婦女乳腺癌的關(guān)聯(lián)性研究

王 蘭，張永東，郭紅云，王 濤，王海濤，郭 歡，楊碎勝，李曉琴，蘇海翔，*

(1．甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅 蘭州 730050；2．甘肅省腫瘤醫(yī)院乳腺腫瘤外科，甘肅 蘭州 730050；3．甘肅省腫瘤醫(yī)院病理診斷中心，甘肅 蘭州 730050)

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的癌癥，也是女性癌癥的主要死亡原因[1]。研究表明環(huán)境因素和生活方式可能導(dǎo)致乳腺癌或增加罹患乳腺癌的風(fēng)險[2]，但也有研究發(fā)現(xiàn)，某些基因的多態(tài)性與乳腺癌的發(fā)病相關(guān)[3]。文獻報告，XRCC3基因多態(tài)性在歐洲、中亞等婦女中與乳腺癌發(fā)病有相關(guān)性[4-5]。因此，我們選擇XRCC3基因研究其與中國西北地區(qū)婦女乳腺癌發(fā)病的相關(guān)性，近年來的研究顯示，非編碼區(qū)的內(nèi)含子在基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯過程中也扮演著重要的角色[6]，但這些區(qū)域內(nèi)的基因多態(tài)性位點與乳腺癌的相關(guān)性報道較少。

本研究選取XRCC3基因位于啟動子區(qū)域的4個多態(tài)性位點rs861534、rs861537、rs3212092、rs861530進行研究，擬通過檢測XRCC3多態(tài)性位點的基因型與乳腺癌風(fēng)險之間的關(guān)系，探討XRCC3基因位點與中國西北地區(qū)婦女乳腺癌發(fā)生的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究人群

選取517例診斷為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌和其他分型的乳腺癌的患者，均為西北地區(qū)的漢族婦女，于2010年12月—2012年6月期間在甘肅省腫瘤醫(yī)院就診，所有的病例具有完整的臨床資料和病理診斷資料，無其他癌癥及乳腺癌家族史；另選取1 008例來自相同地區(qū)、年齡匹配的癌癥篩查項目中健康體檢人員作為空白對照組，空白對照組人員均被臨床證實無乳腺癌和乳腺良性腫瘤疾病及腫瘤家族史；所有參與者已閱讀并簽署了知情同意書；研究內(nèi)容通過了甘肅省腫瘤醫(yī)院倫理委員會審查。

1.2 儀器及試劑

采用QuantStudioTM12k Flex Real-Time PCR System購于美國ABI公司，恒溫水浴箱購于長風(fēng)醫(yī)療器械廠，HZQ-C空氣浴振蕩器及NANODROP 2000均購于美國Thermo公司，小量全血基因DNA提取試劑盒購于北京百泰生物技術(shù)有限公司。熒光標(biāo)記引物，DNA芯片和相應(yīng)軟件系統(tǒng)，質(zhì)控探針和PCR實驗試劑均由ABI生物技術(shù)中國有限公司提供。EnVision兩步法免疫組化試劑盒，購自福州邁新公司。

1.3 DNA提取

對全部病例及正常體檢人群各采集5 mL全血。按照全血DNA試劑盒提取步驟，抽提得到DNA，測定DNA濃度及D(260)/D(280)值，選用DNA濃度為50～100 ng/μL，D(260)/D(280)值為1.7～2.10的樣本，-80 ℃保存、備用。

1.4 基因分型研究

采用高通量基因芯片技術(shù)，將PCR引物和探針預(yù)先嵌入在基因芯片中，每個芯片含有1 074位點，使用TaqMan OpenArray QuantStudio TM 12 k Flex測定基因芯片。①上樣芯片制備：將2.0μL樣本DNA和2.0μL反應(yīng)液充分混合后，加入到384孔板中，再由配套的上樣儀，將混合液添加到基因芯片的中，封蓋，并加入專用油滴封閉加樣口。②基因芯片模塊創(chuàng)建：按照TaqMan軟件操作程序，創(chuàng)建運行文庫和芯片文件庫。③運行芯片模塊：將制備好的基因芯片放入TaqMan OpenArray QuantStudio TM 12 k Flex中，打開芯片文庫中對應(yīng)的文件，運行程序，對芯片上每個微孔中的反應(yīng)液進行RT-PCR反應(yīng)，然后測定反應(yīng)結(jié)果。④結(jié)果分析：芯片運行結(jié)束，根據(jù)TaqMan芯片分析軟件，將該張芯片基因分型結(jié)果輸出為散點圖及相應(yīng)數(shù)據(jù)，再由ABI軟件系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析。實驗結(jié)束，按照1%比率隨機選擇樣本DNA測序技術(shù)分析，驗證基因芯片結(jié)果。

1.5 乳腺癌相關(guān)臨床病理學(xué)指標(biāo)檢測

E R、P R、P53、KI67受體采用免疫組織Envision法進行化學(xué)法檢測；免疫組化染色評定依據(jù)2010年美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)/美國病理學(xué)家協(xié)會(CAP)評分系統(tǒng)。＞50%的細(xì)胞染色為強陽性(+++)，＞25%～50%的細(xì)胞染色為中等陽性(++)，＞1%～25%的細(xì)胞染色為弱陽性(+)，≤1%細(xì)胞染色為陰性(-)。Her-2受體采用免疫熒光原位雜交(FISH)與免疫組化相結(jié)合的方法進行檢測；參照中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南中標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞重度的全細(xì)胞膜染色＞10%為陽性(+++)，＞10%的細(xì)胞輕至中度的全細(xì)胞膜染色為陽性(++)，＞10%的細(xì)胞輕度的全細(xì)胞膜染色或＜10%細(xì)胞膜染色為陰性(-)；若免疫熒光原位雜交檢測為陰性，則確定Her-2為陰性，若FISH檢測顯示陽性，則定義Her-2為陽性。

1.6 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)；使用多因素Logistic回歸法分析SNP等位基因和基因型，病例組和對照組分別進行評估。多因素Logistic回歸計算比值比(odds ratios，OR)及其95%可信區(qū)間(confidence intervals，CI)，分析各基因型與乳腺癌發(fā)生的易感性及相關(guān)性；計數(shù)資料采用卡方檢驗。

2 結(jié)果

2.1 XRCC3單個基因多態(tài)性與乳腺癌風(fēng)險分析

對所有樣本進行基因型分型(見圖1、2)，經(jīng)卡方檢驗，XRCC3各基因型頻率的偏差符合Hardy-Weinberg equilibrium(HWE)定律(見表 1)。對 XRCC3 的4個多態(tài)性位點的基因型和等位基因進行比較研究，結(jié)果顯示XRCC3 rs861534位點的AG/AA基因型，乳腺癌組與對照組比較分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05)。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組中AG/AA基因型與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義[OR=0.36，95%CI(0.27， 0.50)； OR=0.08， 95%CI(0.01， 0.58)]，同時，GG+AG基因型與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義[P＜0.01，OR=2.91，95%CI(2.17，3.89)]，AG+AA基因型與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義[P=0.02，OR=10.66、95%CI(1.42，79.99)]；rs861534位點單基因比較可知，乳腺癌A基因攜帶者與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義[P＜0.01，OR=0.37，95%CI(0.28，0.49)]。研究發(fā)現(xiàn)XRCC3 rs861530位點的Logistic回歸分析顯示AG+AA基因型與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義[P=0.044，OR=0.78，95%CI(0.62，0.99)](見表2)。研究中沒有發(fā)現(xiàn)XRCC3 rs861537和XRCC3 rs3212092兩個位點各基因型與對照組有明顯差異。

圖1 基因芯片結(jié)果分析圖

圖2 芯片位點圖

表1 XRCC3各位點基因型Hardy-Weinberg平衡檢測

表2 XRCC3基因多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險性研究

2.2 XRCC3基因多態(tài)性與癌組織中乳腺癌相關(guān)臨床病理學(xué)指標(biāo)表達(dá)的分析

乳腺癌相關(guān)臨床病理學(xué)指標(biāo)雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人類表皮生長因子受體(Her-2)、P53、KI67，在乳腺癌治療和復(fù)發(fā)用藥選擇時具有重要的參考價值。本研究通過對乳腺癌患者各基因型與相關(guān)臨床病理學(xué)指標(biāo)分析顯示，在乳腺癌患者中rs861537多態(tài)性位點AA、AG、GG三種基因型攜帶者在ER陽性與陰性蛋白中分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；但Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)rs861537位點的GG+AG基因型ER蛋白陽性與陰性分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義[P=0.048，OR=1.50，95%CI(1.00，2.23)]；對于其他rs861534、rs861530、rs3212092三個位點的ER+與ER-蛋白表達(dá)與各基因型比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見表3)。在rs3212092多態(tài)性位點，Logistic回歸分析顯示CT基因型癌組織中，Her-2-與Her-2+蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.049)，CC+CT基因型癌組織中亦有統(tǒng)計學(xué)意義[P=0.027，OR=2.06，95%CI(1.08，3.90)]。對于其他3個位點：rs861534、rs861530、rs861537各基因型癌組織的Her-2+與Her-2-蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見表4)。研究顯示XRCC3 rs861534、rs861537、rs3212092及rs861530四個位點各基因型與PR、P53、KI67等乳腺癌相關(guān)臨床病理學(xué)指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 XRCC3基因多態(tài)性與ER相關(guān)性研究

3 討論

大量存在的SNP位點，使人們有機會發(fā)現(xiàn)與各種疾病相關(guān)聯(lián)，包括腫瘤相關(guān)的基因突變[7]；對基因SNP位點的研究可用于高危群體的發(fā)現(xiàn)、疾病相關(guān)基因的鑒定、藥物的設(shè)計和測試以及生物學(xué)的基礎(chǔ)研究等[8]。

暴露于同樣的危險因素的個體患乳腺癌的風(fēng)險卻不相同，說明個體遺傳背景不同導(dǎo)致了易感性的差異性[9]；流行病學(xué)研究也表明，基因多態(tài)性與乳腺癌的患病風(fēng)險相關(guān)[10]。研究報道顯示XRCC3基因多態(tài)性與乳腺癌的發(fā)病密切相關(guān)[11]；在2002和2004年，英美的學(xué)者研究報道XRCC3 rs861539位點純合子AA基因型與歐美地區(qū)婦女的乳腺癌發(fā)病具有高度風(fēng)險性[12-13]；隨后的研究證實與大多數(shù)亞洲婦女乳腺癌發(fā)病也具有相關(guān)性[14]。最近的數(shù)據(jù)表明XRCC3 rs1799794可略微增加女性的純合子等位基因的乳腺癌患病風(fēng)險[11]。研究證實XRCC3 rs1799794、rs1799796多態(tài)性位點與沙特婦女乳腺癌發(fā)病風(fēng)險明顯相關(guān)，但與其他地區(qū)婦女乳腺癌發(fā)病無相關(guān)性[15]。

表4 XRCC3基因多態(tài)性與Her-2相關(guān)性研究

DNA修復(fù)機制可防止癌基因激活，糾正在DNA復(fù)制過程中的基因缺失、插入等，通過DNA損傷修復(fù)機制可維護基因的穩(wěn)定性，在預(yù)防DNA復(fù)制過程中引起的基因癌變發(fā)揮了重要作用[16]。研究表明，大多數(shù)家族集聚類乳腺癌是遺傳因素的結(jié)果；同卵雙胞胎與異卵雙胞胎比較，同卵雙胞胎姐妹乳腺癌發(fā)病率明顯較高；這一現(xiàn)象可以解釋為一些特定的基因突變，引起帶來疾病的罹患風(fēng)險增加[17]。由此可知，乳腺癌的發(fā)病最主要是由于基因型的不同，而不是生活方式或環(huán)境因素引起。

雌激素受體(ER)是乳腺中正常的激素受體，當(dāng)乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生癌變時，ER將會部分或全部缺失，如檢測到腫瘤組織中有ER表達(dá)，則表明腫瘤細(xì)胞可以接受內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，因此可以采取內(nèi)分泌治療，對臨床治療及預(yù)后評價具有指導(dǎo)價值[18]。研究顯示，在浸潤性乳腺癌組織和轉(zhuǎn)移的腋下淋巴結(jié)中均可見Her-2蛋白的高表達(dá)，表明Her-2的高表達(dá)與乳腺癌患者的無病存活期及腫瘤復(fù)發(fā)高度相關(guān)聯(lián)[19]；Her-2被認(rèn)為是判斷乳腺癌患者預(yù)后和分子靶向治療的關(guān)鍵性標(biāo)志物[20]。

研究表明，XRCC3是中國北方婦女乳腺癌的易感性基因[21]，本研究也顯示兩個SNP位點對乳腺癌具有潛在的致病風(fēng)險；在本研究收集的乳腺癌患者樣本中我們觀察到，在XRCC3基因4個位點rs861534、rs861537、rs3212092、rs861530中，rs861534位點攜帶GG/AG基因型和rs861530位點具有AG/AA基因型者，其罹患乳腺癌的風(fēng)險較高；對于這兩個多態(tài)性位點與乳腺癌風(fēng)險性關(guān)系，以前文獻中還沒有相關(guān)報道。其他XRCC3基因位點rs861537、rs3212092與乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險無相關(guān)性。我們還比較了乳腺癌患者的相關(guān)臨床病理學(xué)指標(biāo)與各位點基因型的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果表明，乳腺癌組織中雌激素受體(ER)表達(dá)陽性和陰性的患者相比較，在XRCC3 rs861537位點GG/AG基因型的ER-與ER+患者具有微小的差別，提示ER+的乳腺癌患者攜帶者GG/AG基因型可能具有較高的內(nèi)分泌治療風(fēng)險，預(yù)后較差；在rs3212092位點，與Her-2-蛋白表達(dá)患者相比較，Her-2+表達(dá)患者并攜帶CT和TT基因型，預(yù)后不良，并具有明顯復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險，在以后的分子靶向治療中也不會獲益；另外，Her-2蛋白高表達(dá)的腫瘤多同步伴隨p53基因的突變，在腫瘤耐藥性方面具有協(xié)同作用，對患者的病情、預(yù)后及化療效果有負(fù)面影響[22]。

在此后研究中，我們還將進行其他堿基修復(fù)基因，如APEX1、MUTYH、OGG1等基因的分析研究，擴大樣本量，并且進一步收集入選的患者及健康人其他信息，如生活環(huán)境、生活習(xí)慣等其他信息，進行分層分析，并對不同位點和基因間進行交互關(guān)系和關(guān)聯(lián)研究，以及功能學(xué)的研究，尋找西北地區(qū)與乳腺癌易感性相關(guān)的易感基因型，并將其作為西北婦女特有的分子標(biāo)志物用于篩選高危和易感人群，為實現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療、個體預(yù)防和治療提供科學(xué)依據(jù)。