利用中國倉鼠肺細(xì)胞體外微核試驗評價三七提取液的遺傳毒性

唐 嬌，楊 穎，李 慶，趙 敏，*，楊杏芬，3，*

(1．廣東省疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)生毒理所，廣東廣州 511430；2．廣東省公共衛(wèi)生研究院健康風(fēng)險評估研究室，廣東 廣州 511430；3．南方醫(yī)科大學(xué)食物安全與健康研究中心，廣東廣州 510515)

三七是我國的傳統(tǒng)中藥，具有很高的藥用價值。由于其具有活血化瘀[1]、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能[2]、保肝[3-4]、降血脂及防止動脈粥樣硬化[5]的作用，近些年被廣泛用于日常保健及保健食品的開發(fā)利用。但是，對于三七的安全性評價資料多是零散、不成體系的，尤其是遺傳毒性評價資料更是鮮見，而體外微核試驗由于其可以簡便、快速、準(zhǔn)確地檢測出斷裂劑和非整倍體誘導(dǎo)劑故廣泛應(yīng)用于化合物遺傳毒性篩選及評價[6-7]。鑒于此，本研究擬通過體外微核試驗對三七提取液的遺傳毒性進行初步評價，為其開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試物 三七購于廣州健安堂藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地為云南文山州。機械粉碎成粉末，經(jīng)中國廣州分析測試中心檢測三七粉中三七皂苷R1的含量為1.92%。參照文獻制備三七提取液[8]：稱取三七粉末200 g，加入70%乙醇1 L，提取2 h，共提取3次，合并醇液回收乙醇到無味，再濃縮水到300 mL。濃縮液5 000 r/min離心15 min，取上清液再濃縮至50 mL，相當(dāng)于生藥4 g/mL，血清瓶中密封保存，供試驗用。

1.1.2 細(xì)胞株、主要儀器與試劑 中國倉鼠肺細(xì)胞(Chinese hamster lung cell，CHL)，購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；倒置顯微鏡，購于日本Olympus公司；光學(xué)顯微鏡，購于德國Zeiss公司；二氧化碳培養(yǎng)箱、低轉(zhuǎn)速離心機、Varioskan Flash全波長掃描式多功能酶標(biāo)儀，均購于美國Thermo公司。

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、絲裂霉素C(mitomycin C)、細(xì)胞松弛素(cyto B)、Giemsa染料均購自美國Sigma公司，MEM培養(yǎng)基、新生小牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，中性紅染料購自美國Amersco公司，甲醇、乙酸等試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 大鼠肝S9的誘導(dǎo)和制備 健康成年SD大鼠，體質(zhì)量130～170 g，按500 mg/kg的濃度一次腹腔注射濃度為200 g/L的多氯聯(lián)苯，5 d后解剖取肝臟稱量質(zhì)量，用新鮮冰冷濃度為0.15 mol/L的氯化鉀溶液連續(xù)沖洗肝臟，每克肝臟加入0.1 mol/L氯化鉀溶液3 ml，連同燒杯移入冰浴中，剪碎肝臟，用玻璃勻漿器制成肝勻漿，用低溫高速離心機20 000 r/min離心10 min，吸出上清，分裝于無菌凍存管中，鑒定活性后，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 中性紅攝取法測定三七提取液對CHL細(xì)胞的毒性 將CHL細(xì)胞復(fù)蘇傳代至對數(shù)增殖期，以1×105個/mL的濃度接種于96孔板中，設(shè)立空白組，陰性對照組及0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL共8個濃度的三七提取液組，每組設(shè)3個復(fù)孔，于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，按不同的組別加入新鮮培養(yǎng)基及不同濃度的受試物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔中加入中性紅，4 h后中止反應(yīng)，加入中性紅解析液，充分混勻，在酶標(biāo)儀540 nm處讀取各孔吸光度D(540)值，按照公式計算細(xì)胞存活率。

1.2.2 體外微核試驗 采用體外胞質(zhì)分裂阻斷微核分析法進行體外微核試驗[9]。取對數(shù)增殖期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL接種于6孔板中，于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗細(xì)胞兩次，加入無血清培養(yǎng)液及一定濃度的受試物(需要代謝活化的同時加入肝S9代謝活化酶系統(tǒng))。用MEM培養(yǎng)基稀釋三七提取液，使三七受試物的濃度分別為2.5、1.25、0.625 mg/mL，陽性對照為20μg/mL環(huán)磷酰胺(+S9)和1.0μg/mL絲裂霉素C(-S9)，陰性對照為等量的MEM培養(yǎng)基，每組設(shè)3個平行孔，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h。結(jié)束后吸去含受試物的培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞兩次，加入含10%血清的新鮮培養(yǎng)液和濃度為3μg/mL的細(xì)胞松弛素B后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。將用胰酶消化后收集的細(xì)胞用0.075 mol/L氯化鉀低滲液低滲，反復(fù)固定后滴冰玻片，再以10%Giemsa磷酸鹽緩沖液染色，純凈水沖洗后自然風(fēng)干。在光學(xué)顯微鏡下觀察，每個濃度組均觀察3張玻片，每張玻片分析1 000個結(jié)構(gòu)完整、著色清晰的雙核細(xì)胞，計算微核細(xì)胞率。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析 利用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，吸光度值比較采用單因素方差分析，微核率比較采用χ2檢驗，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 中性紅攝取法測定細(xì)胞毒性

細(xì)胞毒性試驗結(jié)果見表1。可以觀察到當(dāng)三七提取液濃度為2.5 mg/mL時，與陰性對照相比，吸光度值顯著降低(P＜0.05)，且隨著三七提取液濃度的增加，吸光度值逐漸降低，細(xì)胞存活率也逐漸降低，存在濃度效應(yīng)關(guān)系。

2.2 體外微核試驗

微核的判斷如圖1所示。三七提取液各濃度組對CHL細(xì)胞微核細(xì)胞率的影響見表2。在有無代謝活化系統(tǒng)存在的兩種條件下，三七提取液各濃度組微核細(xì)胞率與陰性對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，體外微核試驗結(jié)果為陰性。

表1 中性紅攝取法測定三七提取液對CHL細(xì)胞的毒性作用

圖1 具有一個微核的雙核細(xì)胞

表2 三七提取液的CHL細(xì)胞體外微核試驗結(jié)果

3 討論

Heddle[10]在1978年首次提出體外微核試驗，由于相較于體內(nèi)試驗簡便、快速、準(zhǔn)確、耗費低、試驗周期短、不受動物個體差異的影響、易于實現(xiàn)自動化而快速發(fā)展，在評價遺傳毒性的試驗體系中有重要位置。歐洲替代方法驗證中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM)對體外微核試驗及染色體畸變試驗的相關(guān)性進行驗證，認(rèn)為體外微核試驗是一種重現(xiàn)性好，精確度高的染色體畸變試驗的替代方法[11]，2008年發(fā)布了體外微核試驗可以替代體外染色體畸變試驗用于遺傳毒性檢測的指導(dǎo)原則[12]。2010年，經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Cooperation and Development，OECD)將體外微核試驗列入指導(dǎo)原則TG487[9]。2011年，國際協(xié)調(diào)委員會(International Conference on Harmonization，ICH)將體外微核試驗列入指導(dǎo)原則S2R(1)[13]。體外微核試驗是以微核作為遺傳毒性檢測終點，常用的方法為細(xì)胞分裂阻滯微核分析法。通過加入細(xì)胞松弛素B使胞質(zhì)分裂受阻，形成雙核細(xì)胞，表明觀察的細(xì)胞經(jīng)過一次有絲分裂，如果受試物是染色體斷裂劑或非整倍體誘發(fā)劑，就可能在雙核細(xì)胞中出現(xiàn)微核。此方法解決了不同細(xì)胞分裂不同步的問題，使微核實驗結(jié)果靈敏度、準(zhǔn)確性更高，并有助于實現(xiàn)微核實驗標(biāo)準(zhǔn)化流程的建立[14-15]。本實驗即用細(xì)胞分裂阻滯微核分析法來檢測三七提取液對CHL細(xì)胞微核細(xì)胞率的影響，評價三七提取液的遺傳毒性。

三七為五加科植物三七的干燥根，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥，也是普遍食用的藥食同源物質(zhì)[16]，現(xiàn)在三七以低于臨床的劑量用于保健品的開發(fā)，被添加入能量飲料、茶或功能性食品中[17]。伴隨著三七越來越廣泛的應(yīng)用，也亟需不斷完善三七的安全性評價資料。本實驗中，三七提取液的體外微核試驗的劑量是通過中性紅攝取法測定細(xì)胞毒性試驗的結(jié)果來確定的。在遺傳毒性試驗前先進行細(xì)胞毒性試驗，確定受試物對細(xì)胞的毒性濃度。在中性紅攝取法測定細(xì)胞毒性試驗中，當(dāng)三七提取液濃度為2.500 mg/mL時，OD值出現(xiàn)顯著性降低，對CHL細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，使CHL細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)減少。故體外微核試驗以2.500 mg/mL作為受試物的高濃度，按照2倍間距遞減設(shè)中、低濃度。本實驗表明三七提取液在0.625、1.250、2.500 mg/mL濃度下，加與不加S9均不會引起CHL細(xì)胞微核細(xì)胞率較陰性對照組的顯著增加，體外微核試驗結(jié)果為陰性，未觀察到三七提取液對CHL細(xì)胞有染色體損傷作用，不具有遺傳毒性。本研究首次利用體外微核試驗評價三七的遺傳毒性。關(guān)于三七遺傳毒性的既往研究表明[18]，參考《食品安全性毒理學(xué)評價程序》完成的三七小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗和Ames試驗的結(jié)果均為陰性，顯示三七不具有遺傳毒性。本研究結(jié)果與其一致。