四味余甘子方對高脂血癥大鼠FFA、CETP及ABCA1影響的實(shí)驗(yàn)研究＊

周盼盼，楊如意

（1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院 西寧 810000；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院 西寧 810000）

隨著社會生活水平的提高，高脂血癥已逐漸成為臨床常見的慢性疾病，發(fā)病率較前也已顯著上升，同時發(fā)病人群年齡較前明顯下降?！吨袊用駹I養(yǎng)與慢性病狀況報(bào)告（2015年）》顯示，2012 年我國18歲以上成人血脂異常即高脂血癥的患病率為40.4%，其TC、TG 水平較2002年明顯增高[1]。高脂血癥是誘發(fā)心臟血管病的危險因素,尤其是當(dāng)以LDL-C 或TC 升高為主時，是動脈粥樣硬化型心血管疾病的重要危險因素[2]。此外，大量研究開始提出高脂血癥和骨質(zhì)疏松[3]、慢性腎病[4]等疾病進(jìn)展之間的關(guān)聯(lián)，也有報(bào)道提示高脂血癥在糖尿病與牙周炎雙向關(guān)系中起著重要作用[5]。故積極防治高脂血癥有著極其重要的臨床意義。

本研究在中藏醫(yī)傳統(tǒng)理論指導(dǎo)下，在臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將余甘子（Phyllanthus emblica Linn.）、訶子（Terminalia chebula Retz.）、毛訶子Terminalia billerica(Gaertn.)Roxb.、藏茵陳（Tibetan capillaris）組方為四味余甘子方。旨在進(jìn)一步明確四味余甘子方對高脂血癥模型大鼠血脂、血清ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1（ATPbinding cassette transporter A1，ABCA1）、膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Cholesteryl ester transfer protein，CETP）、血清游離脂肪酸（Free fatty acid，F(xiàn)FA）及肝臟組織ABCA1 表達(dá)的影響，并試探討其可能的作用機(jī)制，以期對臨床防治高脂血癥有所裨益。

1 材料

1.1 動物

SPF 級SD 雄性大鼠60 只，體質(zhì)量200 g±20 g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)提供，許可證號：SYXK（甘）2015-0005。

1.2 藥物與試劑

四味余甘子方由余甘子、訶子、毛訶子、藏茵陳按一定比例組成。本實(shí)驗(yàn)所用余甘子提取物（批號：ZL2017061201）、藏茵陳提取物（批號：ZL2017082106）、訶子提取物（批號：ZL2017082201）、毛訶子提取物（批號：ZL2017082202），均由南京澤朗生物科技有限公司提供4°C貯存?zhèn)溆谩Ｑ的z囊由北大維信生物科技有限公司生產(chǎn)（批號：20161110）。

脂肪乳劑配方：膽固醇2%、食用豬油10%、蛋黃粉5%、吐溫-80 0.2%、丙硫氧嘧啶1%，自制；膽固醇（批準(zhǔn)文號：復(fù)合津Q/HG3-1288-99）由天津原四通化工廠生產(chǎn)；蛋黃粉由江蘇祥晟生物科技有限公司提供；吐溫80（批號：20170323A）由河南亞統(tǒng)食品原料有限公司提供；丙基硫氧嘧啶由武漢勝天宇生物科技有限公司提供。

TC、TG、LDL-C、HDL-C、ABCA1、CETP、FFA 還原酶試劑盒均由上海遠(yuǎn)慕公司提供，批號均為2018012。免疫組化試劑：ABCA1：Santa Cruz 公司產(chǎn)品,貨號：sc-58219；鼠二抗：北京中杉金橋，貨號：sp-9002；顯色劑：DAB：北京中杉產(chǎn)品，貨號：ZLI-9032。

1.3 儀器

全自動血液生化分析儀：日本AU640-OlymPus。顯微鏡：日本奧林巴斯BX51T-PHD-J11。CMOS：日本奧林巴斯。多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)：美國Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus 6.0。

2 方法

2.1 藥物及脂肪乳劑的制備

實(shí)驗(yàn)時四味余甘子方以及血脂康用蒸餾水溶解，配制成相應(yīng)濃度水劑備用。配制脂肪乳劑時先將定量豬油隔水融化，邊攪拌邊加入一定比例的膽固醇、蛋黃粉、丙基硫氧嘧啶，加入吐溫-80 乳化，最后以蒸餾水定容[6]備用。

2.2 分組、造模及給藥

60 只SD 大鼠按體重以隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6組，正常對照組、模型對照組、陽性藥物（血脂康）組、四味余甘子方低劑量組（以下簡稱為低劑量組）、四味余甘子方中劑量組（以下簡稱為中劑量組）、四味余甘子方高劑量組（以下簡稱為高劑量組）。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，除正常對照組繼續(xù)喂普通飼料外，其余各組均在喂普通飼料基礎(chǔ)上加以脂肪乳劑灌胃造模，劑量以1 mL·(100 g·d)-1計(jì)，正常對照組以等量生理鹽水灌胃。造模同時，血脂康組、低劑量組、中劑量及高劑量組每天分別以0.11 g·kg-1、5.4 g·kg-1、10.8 g·kg-1、16.2 g·kg-1相應(yīng)藥物劑量灌胃，灌胃劑量以1 mL·(100 g·d)-1計(jì)，正常對照組及模型組每天以等量生理鹽水灌胃，共4周。

2.3 檢測指標(biāo)及方法

2.3.1 檢測血脂相關(guān)指標(biāo)及血清CETP、FFA

于最后一次給藥后，禁食禁水12 h后，以戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈采血，靜置，離心（3000 r，10 min），取血清，測定TC、TG、HDL-C、LDL-C、ABCA1、CETP、FFA含量。嚴(yán)格按ELISA檢測試劑盒說明進(jìn)行操作。

2.3.2 檢測肝臟ABCA1

腹主動脈采血后，取出肝臟，取小于0.5 cm ×0.5 cm×0.1 cm組織塊，用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，石蠟包埋，切片，脫蠟、入水，用免疫組化法測定ABCA1。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用簡明統(tǒng)計(jì)分析CS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組均數(shù)比較，方差齊時用t檢驗(yàn)，方差不齊時用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對高脂血癥模型大鼠血脂的影響

與正常對照組比較，模型對照組TC、TG、LDL-C含量明顯升高，HDL-C含量明顯下降（P＜0.05）；與模型對照組比較，各給藥組TC、TG、LDL-C 均有所下降，LDL-C 有所升高（P＜0.05）；與血脂康組比較，低劑量組對血脂的調(diào)節(jié)作用較弱（P＜0.05）；中劑量組對TC、LDL-C的調(diào)節(jié)作用略優(yōu)于血脂康組，但其對TG、HDLC的調(diào)節(jié)作用弱于血脂康組（P＜0.05）；而高劑量組對血脂的調(diào)節(jié)作用要優(yōu)于血脂康組（P＜0.05）（表1）。

表1 各組血脂比較（n=10,±S）

表1 各組血脂比較（n=10,±S）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05；與血脂康組比較，ΔP＜0.05。

3.2 對高脂血癥模型大鼠血清ABCA1、CETP、FFA的影響

與正常對照組比較，模型對照組ABCA1明顯降低（P＜0.05），CETP、FFA 均明顯升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，血脂康組、低劑量組、中劑量組及高劑量組血清ABCA1均有所增加（P＜0.05），CETP、FFA均明顯下降（P＜0.01）；與血脂康組比較，低、中、高劑量組CETP、FFA 均有不同程度下降（P＜0.01），低劑量組ABCA1低于血脂康組（P＜0.05），而中劑量組、高劑量組ABCA1 均有不同程度增加（P＜0.01）；以高劑量組對ABCA1、CETP、FFA 的干預(yù)作用較顯著（P＜0.05，P＜0.01）（表2）。

表2 各組血清ABCA1、CETP、FFA的比較（n=10,±S）

表2 各組血清ABCA1、CETP、FFA的比較（n=10,±S）

注：與正常對照組比較，1*P＜0.05，*P＜0.01；與模型對照組比較，1#P＜0.05，#P＜0.01；與血脂康組比較，1ΔP＜0.05，P＜0.01。

3.3 對高脂血癥模型大鼠肝臟組織ABCA1 表達(dá)的影響

光鏡下可見，ABCA1 在大鼠肝細(xì)胞胞漿中表達(dá)，呈黃棕色。正常對照組表達(dá)廣泛，黃棕色顆粒密布，染色較深；模型對照組呈散在表達(dá)，染色較淺。經(jīng)藥物干預(yù)后，各用藥組大鼠肝組織中呈黃染顆粒的陽性細(xì)胞較模型對照組明顯增多，染色均有不同程度加深，低、中、高劑量組黃染顆粒高于血脂康組（圖1）。

圖1 各組大鼠肝臟組織免疫組化ABCA1

免疫組化分析結(jié)果顯示，模型對照組大鼠肝組織中ABCA1蛋白表達(dá)量比正常對照組明顯降低，經(jīng)藥物干預(yù)后，與模型對照組相比，各給藥組均能顯著升高肝組織中ABCA1的蛋白表達(dá)量（P＜0.05），其中，高、中、低劑量組均高于血脂康組，以高劑量組最為明顯（表3）。

表3 四味余甘子方對高脂血癥模型大鼠肝臟組織ABCA1表達(dá)的影響

4 討論

目前臨床治療高脂血癥的藥物主要為HGM-CoA還原酶抑制劑（他汀類）、苯氧芳酸類（貝特類）、煙酸類、膽酸螯合劑（樹脂類）、腸道膽固醇吸收抑制劑、普羅布考及n-3脂肪酸制劑。最常使用的是他汀類和貝特類，臨床降脂治療多首選他汀類。他汀類藥物可以誘導(dǎo)LDL-C下降，從而降低心血管疾病發(fā)病率和死亡率，主要用于治療原發(fā)性、繼發(fā)性高膽固醇血癥，目前他汀類藥物已成為高脂血癥治療的基石。但在臨床實(shí)踐中，許多患者使用他汀類藥物治療其血脂水平仍不能達(dá)標(biāo)。2012 年血脂異常國際研究——中國住院患者他汀類藥物治療率88.9%，接受治療患者中，38.5%未達(dá)低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）目標(biāo)值[7]，LDL-C相關(guān)的殘留風(fēng)險仍然存在。而他汀類藥物的副作用有消化道反應(yīng)、肝毒性、肌病、血糖升高及神經(jīng)毒性等，肌病為其常見的嚴(yán)重不良反應(yīng)，嚴(yán)重時可發(fā)生橫紋肌溶解，他汀類藥物導(dǎo)致血小板減少的案例近年也屢有報(bào)道[8-10]。其他降脂藥亦有不良反應(yīng)，如貝特類藥物的不良反應(yīng)主要為消化道癥狀、膽石癥、肝功損害等，與他汀類藥物聯(lián)用可發(fā)生肌病[11,12]。

由于以他汀類為代表的降脂藥并不能使高脂血癥患者的血脂均達(dá)到理想的水平，且有一定的副作用，因此，篩選具有調(diào)脂作用的中藏藥制劑，充分發(fā)揮祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)防治高脂血癥的優(yōu)勢是當(dāng)前國內(nèi)中醫(yī)界共同關(guān)注的重點(diǎn)。目前已有大量試驗(yàn)證明中藥單獨(dú)或聯(lián)用降脂藥治療高脂血癥能取得不錯甚至優(yōu)于單用降脂藥的臨床效果[13-16]。故積極研究中藏藥對高脂血癥的作用并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，對臨床防治高脂血癥有著很重要的意義。

通過對高脂血癥的深入研究，在中藏醫(yī)傳統(tǒng)理論指導(dǎo)下，課題組根據(jù)臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)選用四味余甘子方治療高脂血癥。四味余甘子方由余甘子、訶子、毛訶子、藏茵陳組方而成?！吨腥A人民共和國藥典》將余甘子作為藏族習(xí)用藥材收錄，藏醫(yī)藥經(jīng)典著作《晶珠本草》記載余甘子被用來治療培根病、赤巴病及血病，其中血病就包括高血脂?，F(xiàn)代藥理研究也表明，余甘子、訶子、毛訶子有一定的調(diào)脂作用[17,18]，已有研究提出毛訶子、藏茵陳具有一定的肝臟保護(hù)作用[19,20]。

本次研究結(jié)果表明，四味余甘子方對高脂血癥模型大鼠的血脂有調(diào)節(jié)作用，且以高劑量組作用最為顯著。同時通過對各組血清CETP、FFA 的檢測，最終表明各給藥組CETP、FFA 均有不同程度降低，且以高劑量組降低最為明顯,療效優(yōu)于血脂康組。

CETP 是一種血漿糖蛋白，在調(diào)節(jié)HDL-C 和膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用，能介導(dǎo)膽固醇酯與甘油三酯在HDL、VLDL和LDL之間進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，以調(diào)節(jié)脂代謝。有大量研究證實(shí)使用CETP 抑制劑，在降低LDLC和升高HDL-C 兩個方面均有效果，可以在一定程度上改善高脂血癥[21-24]。本研究結(jié)果顯示，四味余甘子方可降低高脂血癥模型大鼠CETP，該方對血脂的調(diào)節(jié)作用或與其抑制CETP有關(guān)。

FFA 是一種由脂肪組織內(nèi)TG 水解釋放的非酯化脂肪酸，可作為許多器官的直接能量來源，并可由肝臟轉(zhuǎn)化為酮體，對脂質(zhì)代謝有一定影響。已有研究提出FFA 可以上調(diào)3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶（MPST），MPST可通過抑制CSE/H2S（胱硫醚γ-裂解酶/硫化氫）和隨后上調(diào)的固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c通路（SREBP-1）、c-Jun 氨基末端激酶磷酸化（JNK）和肝臟氧化應(yīng)激途徑促進(jìn)脂肪變性，導(dǎo)致脂肪肝[25]。本研究結(jié)果顯示，四味余甘子方可降低血清FFA，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，效果優(yōu)于血脂康組，高劑量組效果較好。

本研究通過檢測各組大鼠血清ABCA1 以及肝臟組織ABCA1，以期明確四味余甘子方對ABCA1表達(dá)的影響，最終得出結(jié)論：四味余甘子方能增加ABCA1 的表達(dá)，以高劑量組最為明顯，且優(yōu)于血脂康組，其對血脂的調(diào)節(jié)作用或與其增強(qiáng)ABCA1表達(dá)相關(guān)。

ABCA1 是由12 個跨膜結(jié)構(gòu)域和兩個ATP 結(jié)合盒（ABC）結(jié)構(gòu)域組成的包括2261 個氨基酸的整合膜蛋白，主要分布在巨噬細(xì)胞和肝臟細(xì)胞，是膽固醇和磷脂從細(xì)胞流出到高密度脂蛋白（HDL）顆粒的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[26,27]，ABCA1 可以介導(dǎo)細(xì)胞游離膽固醇和磷脂流向細(xì)胞外受體載脂蛋白AI（apoAI），以形成新的HDL[28]。有研究提出ABCA1 介導(dǎo)的HDL 形成過程在早期動脈粥樣硬化病變發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，當(dāng)ABCA1表達(dá)下調(diào)時會促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)展[29,30]。

ABCA1受肝X受體（LXRs）、過氧化物酶體增殖因子活化受體（PPARs）和視黃酸X受體（RXRs）的調(diào)控[31]，LXRs 和PPARs 是與RXRs 形成專性異二聚體的核受體成員，LXRs 與RXRs 的協(xié)同作用可以調(diào)節(jié)肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中參與脂質(zhì)代謝基因的表達(dá)，LXRs在高細(xì)胞固醇負(fù)荷條件下被激活，并誘導(dǎo)膽固醇外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCA1和ABCG1（ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G1）的表達(dá)以促進(jìn)過量細(xì)胞膽固醇的外排[32]。PPARs 分為PPARα、PPARβ、PPARγ三型，PPARα激活后通過減少肝臟中的LXR/RXR異二聚化可以抑制LXRs信號傳導(dǎo)。還有研究提出前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin9型（PCSK9）可以通過下調(diào)ABCA1基因和ABCA1蛋白表達(dá)對ABCA介導(dǎo)的膽固醇流出起直接抑制作用[33]。

綜上，四味余甘子對高脂血癥模型大鼠的血脂有較明顯的調(diào)節(jié)作用，能顯著降低血清CETP 及FFA 水平，增強(qiáng)ABCA1 的表達(dá)。其更深入的作用機(jī)制，以及可能存在的其它作用途徑，亟待進(jìn)一步研究。