血管內(nèi)皮生長因子和水通道蛋白在肺水腫中的表達分析

劉永浩

【摘要】 目的：探討血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和水通道蛋白在肺水腫中的表達。方法：選取86只

健康SD大鼠，按照隨機數(shù)字表法將其分為研究組和對照組，各43只。研究組制作創(chuàng)傷性肺水腫模型，對照組不做任何干預(yù)。比較兩組大鼠死亡情況、肺含水量，血清和肺組織中的VEGF、水通道蛋白-1（AQP-1）水平，血清炎性因子（hs-CRP、IL-6、TNF-α）水平。結(jié)果：研究組大鼠死亡率、肺含水率均高于對照組（P<0.05）;制模后6、24、48 h，研究組血清VEGF、AQP-1水平均高于對照組（P<0.05）;研究組肺組織中VEGF、AQP-1表達均高于對照組（P<0.05）;研究組hs-CRP、IL-6、TNF-α水平均高于對照組（P<0.05）。結(jié)論：創(chuàng)傷性肺水腫大鼠血清和肺組織中的VEGF、AQP-1水平均明顯升高。

【關(guān)鍵詞】 水通道蛋白; 血管內(nèi)皮生長因子; 肺水腫

Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and Aquaporin in Pulmonary Edema/LIU Yonghao.//Medical Innovation of China，2019，16（23）：0-022

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of vascular endothelial growth factor（VEGF）and aquaporin in pulmonary edema.Method：A total of 86 healthy SD rats were selected，according to the random number table method，they were divided into study group and control group，43 rats in each group.Traumatic pulmonary edema model was made in study group，and no intervention was given in control group.The mortality，lung water content，serum and lung tissue levels of VEGF，aquaporin-1（AQP-1），and serum levels of inflammatory factors（hs-CRP，IL-6，TNF-α）between two groups were compared.Result：The mortality and lung water content in study group were higher than those of control group（P<0.05）.After moulding 6，24 and 48 hours，the levels of serum VEGF and AQP-1 in study group were higher than those of control group（P<0.05）.The expressions of VEGF and AQP-1 in lung tissue of study group were higher than those of control group（P<0.05）.The levels of hs-CRP，IL-6 and TNF-α in study group were higher than those of control group（P<0.05）.Conclusion：The levels of VEGF and AQP-1 in serum and lung tissue of rats with traumatic pulmonary edema are significantly increased.

【Key words】 Aquaporin; Vascular endothelial growth factor; Pulmonary edema

First-authors address：Linyi Traditional Chinese Medicine Hospital，Linyi 276002，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.23.005

胸外傷是目前在臨床上比較常見的損傷類型，在發(fā)生胸外傷后患者多會伴有不同程度的肺挫傷[1]。有研究證實，在發(fā)生肺挫傷后會出現(xiàn)強烈肺實質(zhì)炎性反應(yīng)，患者往往還會伴有不同程度的凝血功能障礙，目前發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）具有高度特異性，當(dāng)組織出現(xiàn)缺血、缺氧時會對其分泌產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，當(dāng)患者出現(xiàn)創(chuàng)傷性肺損傷時會導(dǎo)致VEGF出現(xiàn)異常表達[2]。而且肺水腫是發(fā)生肺挫傷后必然出現(xiàn)的癥狀，水通道蛋白是屬于對水特異性通透的膜蛋白[3]。近幾年有學(xué)者指出，肺部水轉(zhuǎn)運與水通道蛋白的表達有著密切的聯(lián)系，因此在評估肺水腫時可以通過檢測該物質(zhì)表達的方式進行判定[4]。此次研究通過制作肺水腫大鼠模型，分析其肺組織和周圍血液中VEGF和水通道蛋白的表達，進一步證實肺水腫與VEGF和水通道蛋白間的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取86只健康SD大鼠（上海交通大學(xué)附屬醫(yī)院動物中心提供），均為雄鼠，按照隨機數(shù)字表法將其分為研究組和對照組，各43只。對照組體重265～287 g，平均（276.3±2.1）g，研究組體重260～296 g，平均（275.2±2.3）g，兩組體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 制作肺挫傷動物實驗?zāi)M器具，采用爆震傷實驗進行制備;撞擊操作器具;高速低溫離心機（HITACHI20PR-52D，日本）;顯微鏡（OLYMPUS BX51，日本）;水通道蛋白-1（AQP-1）的正反向引物;RNA提取試劑盒（上海酶聯(lián)免疫生物有限公司）;全波長酶標(biāo)儀（Thermo Scientific，美國）;蛋白測定試劑盒（上海酶聯(lián)免疫生物有限公司）;電子天平等。

1.2.2 制作肺水腫模型 對照組不做任何干預(yù)，研究組采用胸部撞擊方法進行肺水腫模型制作，使用胸部撞擊器撞擊大鼠胸部第3～6根處肋骨，撞擊部位范圍直徑在1.9 cm左右，在進行胸部撞擊時與大鼠胸廓之間的距離保持在20 cm左右，在撞擊時注意對撞擊模式的控制，以免造成大鼠肋骨骨折、氣胸及心包積液等情況，從而影響研究結(jié)果，在操作結(jié)束后，應(yīng)當(dāng)取制作模型進行胸腔探查，排除肋骨骨折、心包積液及氣胸等并發(fā)癥，研究組43例模型均成功制作，未出現(xiàn)以上并發(fā)癥[5]。

1.3 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) 比較兩組大鼠死亡情況、肺含水量，血清VEGF、AQP-1水平，肺組織中VEGF、AQP-1水平，血清炎性因子水平[高敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）]。（1）經(jīng)左頸動脈取2 mL動脈血，離心獲得血清，3 000 r/min，離心10 min，獲得上層血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測hs-CRP、IL-6、TNF-α、AQP-1、VEGF。（2）剪取少量肺組織，采用液氮進行固定，將其研磨成粉，加入蛋白裂解液，離心獲得上層清液，3 000 r/min，離心30 min，采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法進行水平測定[6]。（3）將大鼠處死后，打開胸腔，將肺臟游離，切斷氣管，取出大鼠全部肺組織，采用電子天平進行稱重，然后將大鼠肺臟置入恒溫烤箱進行烘干，隔2小時進行一次稱重，在每次稱重損傷<0.05 g時停止烘干，計數(shù)肺臟重量為恒重，根據(jù)所得干濕重量進行肺含水率計算，肺含水率=（濕重-干重）/濕重×100%[7]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 18.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，組內(nèi)比較采用配對t檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠死亡率及肺含水率比較 研究組大鼠死亡率、肺含水率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 兩組不同時間段血清VEGF、AQP-1水平比較 制模后6、24、48 h，研究組血清VEGF、AQP-1水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.3 兩組肺組織中VEGF、AQP-1表達比較 研究組肺組織中VEGF、AQP-1表達均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3。

2.4 兩組炎性因子水平比較 研究組hs-CRP、IL-6、TNF-α水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表4。

3 討論

肺挫傷會由多種原因?qū)е?，最常見的就是交通事故，患者在發(fā)生肺挫傷后因肺實質(zhì)受到損傷，進而會引發(fā)肺部出現(xiàn)一系列的炎癥，肺水腫是肺挫傷后最常見的繼發(fā)性癥狀[8]。作用力的大小直接影響肺挫傷的嚴(yán)重程度，而且損傷程度也會與本身胸部肌肉的彈性等因素有關(guān)，因此本研究在進行模型制備時選用胸部撞擊器進行撞擊，而不是采用自由落體撞擊，從而確保大鼠肺挫傷模型的打擊力度均勻，而且在進行模型制備時兩組大鼠均未接受呼吸機干預(yù)，完全模擬自然肺挫傷發(fā)病經(jīng)過[9]。在建立大鼠模型前，對兩組大鼠進行健康檢查，大鼠均呼吸正常，無口鼻分泌物，研究組大鼠在建立肺損傷模型后出現(xiàn)心率加速，呼吸次數(shù)明顯增加，而且在大鼠口鼻有血性液體溢出，這一癥狀表明，肺損傷大鼠模型建立成功[5，10]。

VEGF是由血管內(nèi)皮細胞分泌的一種糖蛋白，在機體各組織內(nèi)都可以檢測到[11]。該物質(zhì)的主要作用是促進血管內(nèi)皮細胞增殖，使血管的通透性增加，對于單核細胞、中性粒細胞的遷移起到趨化作用，VEGF對于凝血也可以起到調(diào)節(jié)作用，對于血管內(nèi)皮細胞損傷的修復(fù)起到促進作用，可以有效降低血栓形成，對抗細胞凋亡[12]。VEGF的主要來源是肺部，在正常情況下，VEGF主要表達是在間質(zhì)及肺泡Ⅱ型上皮細胞中[13]。但是在肺組織發(fā)生損傷后，VEGF作為敏感因子表達會出現(xiàn)明顯上調(diào)，這說明在肺挫傷后肺水腫的異常過程中有VEGF的參與[14]。通過對炎性活化的有絲分裂原蛋白激酶信號傳導(dǎo)系統(tǒng)進行控制，從而實現(xiàn)內(nèi)皮細胞鈣粘蛋白的重新排列[15]。通過細胞旁路使微循環(huán)內(nèi)蛋白和肺內(nèi)液體進入到肺間隙和肺泡，進而形成肺水腫，因此通過檢測VEGF水平可以進一步確定是否形成肺水腫[16]。本研究結(jié)果顯示，研究組制模后6、24、

48 h血清VEGF水平均高于對照組（P<0.05）;研究組肺組織中VEGF表達高于對照組（P<0.05）。筆者認為這是大鼠在制成肺損傷模型后，因缺血缺氧對血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生刺激，從而增加血液中VEGF表達，中性粒細胞也會分泌一定的VEGF，在機體處于炎癥狀態(tài)時，會刺激中性粒細胞產(chǎn)生大量VEGF，從而增加其血液中的含量。本研究并未對VEGF水平變化情況進行長期研究，曾有學(xué)者指出，在經(jīng)過一段時間的升高后，VEGF水平會隨著疾病的控制而出現(xiàn)下降[17]。

AQP-1屬于水特異性通透糖蛋白，是近幾年關(guān)于肺水代謝研究比較多的一種。曾有研究指出，當(dāng)出現(xiàn)肺挫傷后，機體會表現(xiàn)出非常強烈的炎癥反應(yīng)，進而出現(xiàn)肺水腫，因此AQP-1水平也會出現(xiàn)明顯上調(diào)，因此可以通過檢測AQP-1水平是否上調(diào)的方式判定是否出現(xiàn)肺水腫[18]。但是也有學(xué)者在研究中指出，在建立肺損傷大鼠模型后，短時間內(nèi)血清AQP-1水平不會發(fā)生明顯變化，而是會隨疾病發(fā)展而出現(xiàn)明顯升高[19]。本研究結(jié)果顯示，研究組制模后6、24、48 h血清AQP-1水平均高于對照組（P<0.05）;研究組肺組織中AQP-1表達高于對照組（P<0.05）。筆者認為這是因為AQP-1的上調(diào)增加了肺泡毛細血管的通透性，使原本的滲透壓失衡，促進肺內(nèi)液體進入肺間質(zhì)，形成肺水腫。但是因肺損傷后出現(xiàn)的低氧環(huán)境會促進VEGF表達，從而對血管內(nèi)皮表面蛋白重新分布，增加血管通透性，所以肺水腫的形成是VEGF和AQP-1的共同作用[19]。

綜上所述，在創(chuàng)傷性肺水腫大鼠肺組織中VEGF和AQP-1的表達均明顯升高，在外周血液中VEGF和AQP-1表達均明顯升高，可為今后對肺水腫情況評估提供參考。

參考文獻

[1]龍濤，李開南.白細胞介素8、血管內(nèi)皮生長因子在椎間盤退變中作用的研究進展[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（23）：153-156.

[2]張樂，孫洪贊，辛軍，等.宮頸癌18F-FDG PET/CT標(biāo)準(zhǔn)化攝取值與血管內(nèi)皮生長因子、水通道蛋白1表達及臨床病理特征的相關(guān)性[J].中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，2018，34（2）：260-264.

[3] Shah A R，Williams S，Baumal C R，et al.Predictors of Response to Intravitreal Anti-Vascular Endothelial Growth Factor Treatment of Age-Related Macular Degeneration[J].Am J Ophthalmol，2016，163：154-166.e8.

[4]郝興亮.水通道蛋白4、5、血管內(nèi)皮生長因子在非小細胞肺癌中的表達及意義[J].中國老年學(xué)雜志，2016，36（15）：3729-3730.

[5] Lockhart A C，Rothenberg M L，Dupont J，et al.Phase I study of intravenous vascular endothelial growth factor trap，aflibercept，in patients with advanced solid tumors[J].J Clin Oncol，2010，28（2）：207-214.

[6]李煌，張玉琴，闕金花，等.中藥有效成分對血腦屏障的影響研究概況[J].中華中醫(yī)藥雜志，2016，31（11）：4733-4736.

[7]陳懿，毛蕊，肖玲，等.川芎嗪對脂多糖誘導(dǎo)肺損傷大鼠肺組織水通道蛋白1、5表達影響的研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2017，42（1）：27-32.

[8] Pi C J，Liang K L，Ke Z Y，et al.Adenovirus-mediated expression of vascular endothelial growth factor-a potentiates bone morphogenetic protein9-induced osteogenic differentiation and bone formation[J].Biol Chem，2016，397（8）：765-775.

[9]李靖華，張濤，張勝逆，等.水通道蛋白-1及核因子κB在大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷中的表達及意義[J].中華消化外科雜志，2016，15（8）：830-835.

[10]姜艷，王雷琛，王劍波.高原肺水腫發(fā)病機制及防治研究進展[J].國際藥學(xué)研究雜志，2016，43（1）：139-145.

[11]周玲玲，夏國際，羅萍，等.促紅細胞生成素對急性肺損傷保護作用機制的研究進展[J].中國呼吸與危重監(jiān)護雜志，2018，17（1）：105-108.

[12]黃仁發(fā)，李賀生，梁群卿，等.冬蟲夏草對腎缺血-再灌注損傷大鼠血清和肺泡TNF-α、IL-1β以及腎和肺組織水通道蛋白1表達的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2018，38（7）：844-850.

[13]袁曉丹，郭銳，常振宇，等.LPS誘導(dǎo)的肉雞肺臟損傷中AQP1、AQP5表達變化研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017（13）：159-161.

[14] Campochiaro P A，Khanani A，Singer M，et al.Enhanced Benefit in Diabetic Macular Edema from AKB-9778 Tie2 Activation Combined with Vascular Endothelial Growth Factor Suppression[J].Ophthalmology，2016，123（8）：1722-1730.

[15]王克玲，王隆閣，陳玲，等.甲潑尼龍對腎上腺素肺水腫大鼠肺組織水通道蛋白1表達的影響[J].中華實用兒科臨床雜志，2017，32（9）：682-686.

[16]王小蘭，袁培培，吳廣操，等.南葶藶子對野百合堿誘導(dǎo)的肺源性心臟病大鼠內(nèi)分泌系統(tǒng)與肺組織水通道蛋白1表達的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（7）：3205-3208.

[17] Zhan N，Dong W G，Wang J.The clinical significance of vascular endothelial growth factor in malignant ascites[J].Tumour Biol，2016，37（3）：3719-3725.

[18]曾偉，孫昊鑫，馬廣強，等.二冬膏對LPS致急性肺損傷大鼠肺組織TNF-α、IL-6及AQP-1、AQP-5的影響[J].中藥藥理與臨床，2016，32（6）：10-13.

[19]何珍，鄭偉華，歐維琳，等.水通道蛋白4和P65在腸道病毒71型感染合并神經(jīng)源性肺水腫腦與肺組織的表達及意義[J].廣東醫(yī)學(xué)，2016，37（13）：1957-1960.

（收稿日期：2018-12-19） （本文編輯：董悅）