人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對早發(fā)性卵巢功能不全大鼠的影響

莊亞瓊　楊晴晴　段暢　張林東　封全靈

【摘要】 目的：探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUCMSCs）對早發(fā)性卵巢功能不全模型大鼠卵巢功能的影響。方法：將正常動(dòng)情周期的36只雌性ICR小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為移植組（n=12）、模型對照組（n=12）與空白對照組（n=12）?？瞻讓φ战M大鼠不進(jìn)行任何處理，模型對照組和移植組大鼠腹腔注射順鉑（CDDP）建立早發(fā)性卵巢功能不全（POI）模型。移植組通過尾靜脈注射hUCMSCs進(jìn)行治療，模型對照組與空白對照組均注射等量滅菌用水。移植后2周，觀察三組一般情況，HE染色三組的切片中各階段的卵泡情況，同時(shí)觀察卵巢結(jié)構(gòu)變化。測定血清中雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）和抗苗勒管激素（AMH）水平，并分析卵巢儲備功能的變化。結(jié)果：電鏡下顯示，模型對照組顆粒細(xì)胞核溶解、核膜消失、線粒體空泡化，線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量逐漸減少。移植組顆粒細(xì)胞細(xì)胞核膜逐漸修復(fù)，核仁出現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體少量存在。造模后3 d，模型對照組E2含量低于空白對照組，F(xiàn)SH含量高于空白對照組（P<0.05）。移植后2周，移植組AMH含量高于模型對照組（P<0.05），三組AMH比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：hUCMSCs移植對POI大鼠的卵巢結(jié)構(gòu)和功能具有一定的修復(fù)作用。

【關(guān)鍵詞】 間充質(zhì)干細(xì)胞; 早發(fā)性卵巢功能不全; 順鉑

Effects of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells on Rats with Premature Ovarian Insufficiency/ZHUANG Yaqiong，YANG Qingqing，DUAN Chang，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（23）：0-018

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells（hUCMSCs）on ovarian function in rats with early-onset ovarian dysfunction.Method：36 female ICR mice with normal estrous cycle were divided into transplantation group（n=12），model control group（n=12）and blank control group（n=12）according to random number table method.The blank control group without any treatment.The model control group and transplantation group rats were intraperitoneally injected with cisplatin（CDDP）to establish premature ovarian insufficiency（POI）model.The transplantation group was treated with intravenous injection of hUCMSCs.The model control group and blank control group were injected with the same amount of sterilizing water.2 weeks after transplantation，the general conditions of the three groups were observed，and the follicular conditions at each stage in the sections of the three groups with HE staining were observed，and the structural changes of the ovary were observed at the same time.The levels of estradiol（E2），follicle stimulating hormone（FSH），luteinizing hormone（LH）and anti-Mullerian hormone（AMH）in serum were measured，and the changes of ovarian reserve function were analyzed.Result：Electron microscopy showed that the number of mitochondria and endoplasmic reticulum decreased gradually in the model control group，while the number of nuclear membrane repaired gradually，nucleolus appeared，and endoplasmic reticulum and mitochondria existed little in the transplantation group.3 days after modeling，E2 content in the model control group was lower than that in the blank control group，and FSH content was higher than that in the blank control group（P<0.05）.At 2 weeks after transplantation，AMH content in the transplantation group was higher than that in the model control group（P<0.05）.AMH in the three groups were compared，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：hUCMSCs transplantation can repair the ovarian structure and function of POI rats.

【Key words】 Mesenchymal stem cells; Premature ovarian insufficiency; CDDP

First-authors address：Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.23.004

早發(fā)性卵巢功能不全（POI）指女性在40歲之前卵巢活動(dòng)衰退的臨床綜合征，以月經(jīng)紊亂（如停經(jīng)或稀發(fā)月經(jīng)）伴有高促性腺激素和低雌激素為特征。停經(jīng)或月經(jīng)稀發(fā)4個(gè)月，間隔>4周連續(xù)兩次，F(xiàn)SH>25 U/L[1]。POI主要引起雌激素缺乏癥狀，進(jìn)一步發(fā)展會導(dǎo)致卵巢早衰（POF）生育能力下降，目前POI治療方式有HRT激素治療和免疫治療等方法恢復(fù)卵巢功能，但是這些治療效果不能促進(jìn)自身卵巢組織再生修復(fù)[2]。近年來，國內(nèi)外試圖應(yīng)用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療卵巢早衰，利用動(dòng)物模型進(jìn)行了探索，為早發(fā)性卵巢功能不全（卵巢早衰）患者的治療提供了可能的新希望。在化療藥物的應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)有些患者在使用化療藥物后出現(xiàn)了如持續(xù)閉經(jīng)和潮熱、多汗等低雌激素表現(xiàn)，內(nèi)分泌檢查結(jié)果提示卵巢功能減退并引起患者的不孕。本研究應(yīng)用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUCMSCs）治療由順鉑（CDDP）引起的卵巢早衰大鼠，觀察卵巢結(jié)構(gòu)及激素水平變化，為指導(dǎo)臨床提供依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）hUCMSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定。選取2018年12月于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院足月分娩產(chǎn)婦胎兒的臍帶樣本。產(chǎn)婦產(chǎn)前1個(gè)月內(nèi)均行母血檢測，無各種傳染疾病的健康孕婦。收集前所有患者及家屬均知情同意，并簽署知情同意書，本研究經(jīng)過鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，在嚴(yán)格無菌的條件下提取正常分娩的足月健康新生兒的臍帶和胎盤，將臍帶剔除動(dòng)靜脈血管，分離出的臍帶切割成1～2 mm的小塊，采用貼壁法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞保存?zhèn)溆?。在合適的培養(yǎng)基和環(huán)境下對hUCMSCs五代細(xì)胞株進(jìn)行復(fù)蘇、培養(yǎng)擴(kuò)增、傳代和保存。采用流式細(xì)胞儀鑒定，選擇生長良好的第5代的hUCMSCs，用1 mL注射器將1 mL細(xì)胞懸液注入移植組小鼠的尾靜脈中。（2）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑：陰道涂片提示有正常的發(fā)情周期的ICR雌性大鼠36只，體重（200±12）g，購自動(dòng)物中心。將36只雌性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組

12只，模型對照組12只，移植組12只。CDDP購自武漢博士德公司;檢測血清雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）和抗苗勒管激素（AMH）濃度的ELISA 試劑盒購自北京金橋生物。

1.2 方法 POI模型大鼠建立模型：對照組和移植組腹腔注射CDDP溶液，第1天注射 50 mg/kg，第2天連續(xù)注射16 mg/kg?？瞻讓φ战M注射等體積滅菌用水。模型對照組造模后無額外處理，觀察記錄大鼠一般情況，造模前及造模后3 d尾靜脈采血，檢測FSH、E2含量。移植組在造模完成后尾靜脈注射1×106/mL的hUCMSCs單細(xì)胞懸液1 mL。模型對照組與空白對照組均注射等量滅菌用水。

1.3 觀察指標(biāo) 造模后3 d，利用生化方法測定并比較空白對照組與模型對照組雌激素（E2）與抗苗勒管激素（AMH）的水平。移植后2周，利用生化方法測定并比較三組卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）及AMH水平，HE染色電鏡下觀察CDDP標(biāo)本及空白對照組的切片中各階段的卵泡情況，同時(shí)觀察卵巢結(jié)構(gòu)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析;計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組卵巢結(jié)構(gòu) hUCMSCs移植后2周，空白對照組顆粒細(xì)胞的細(xì)胞面膜完整、細(xì)胞無水腫，線粒體分布均勻、清晰可見，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)均勻，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)清晰可見，無擴(kuò)張現(xiàn)象，屬正常顆粒細(xì)胞形態(tài)。模型對照組顆粒細(xì)胞的細(xì)胞核溶解，核膜消失，染色質(zhì)固縮、邊聚，有凋亡小體出現(xiàn)，線粒體空泡化，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等細(xì)胞器數(shù)減少，移植組顆粒細(xì)胞核膜逐漸修復(fù)，核仁出現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體少量存在。見圖1。

2.2 三組卵巢大體觀 空白對照組大鼠卵巢外觀無異常，造模后大鼠卵巢比空白對照組明顯縮小，卵巢表面的顆粒樣隆起明顯減少，卵巢可見局部有充血現(xiàn)象。模型對照組和移植組卵巢外觀相比差異不明顯。

2.3 三組各階段卵泡計(jì)數(shù)比較 三組始基卵泡、初級卵泡、竇卵泡和次級卵泡個(gè)數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.4 造模后3 d空白對照組與模型對照組E2、FSH水平 模型對照組E2含量低于空白對照組，模型對照組FSH含量高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.5 三組卵巢儲備功能變化 移植后2周，三組FSH/LH水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），移植組AMH含量高于模型對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），三組AMH比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

近些年來，間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛應(yīng)用于臨床各種疾病的治療研究，其類型主要有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于臨床的年份較長，應(yīng)用過程中出現(xiàn)了各種不足，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞需要對患者進(jìn)行骨髓穿刺，引起患者的疼痛不適，甚至得不到患者的配合，且骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞隨著供體年齡的增長分化能力和細(xì)胞數(shù)量均不能達(dá)到理想的效果，無論自體移植還是異體移植均有可能造成感染[3-4]。這些問題使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用大大受到了限制。而臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生長環(huán)境更易實(shí)現(xiàn)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖分化能力與低免疫原性，而且細(xì)胞來源相對安全提取和培養(yǎng)更加方便，不會給患者帶來額外的痛苦，也不易造成疾病在人群間的傳播[5-7]?；谀殠чg充質(zhì)干細(xì)胞的這些優(yōu)點(diǎn)，其未來在臨床可能擁有更好的發(fā)展前景，可能成為治療疾病的一種干細(xì)胞類型，在臨床上推廣更具有優(yōu)勢[8]。

間充質(zhì)干細(xì)胞治療在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究領(lǐng)域獲得了很大的進(jìn)展，部分研究成果已開始在惡性腫瘤、自身免疫系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等多種臨床試驗(yàn)中得到應(yīng)用。其中hUCMSCs在狼瘡性腎炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病、神經(jīng)障礙性疾、失代償期肝硬化、肝衰竭等疾病的臨床治療研究中取得的成果，提示干細(xì)胞移植治療有可能是未來卵巢早衰治療的一個(gè)方向[9-11]。

順鉑是一種常用的化療藥物，有研究表明其在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也可對正常細(xì)胞造成不同程度的傷害，順鉑化療過程中引發(fā)卵巢功能低下的報(bào)道逐年增加[12-14]。本研究通過順鉑作用于大鼠建立早發(fā)卵巢功能不全模型，結(jié)果得出：造模后3 d，模型對照組E2含量低于空白對照組（P<0.05），F(xiàn)SH含量高于空白對照組（P<0.05），提示造模成功。之后對CDDP建立的早發(fā)卵巢功能不全的大鼠模型進(jìn)行尾靜脈注射治療，移植后2周，移植組AMH含量高于模型對照組（P<0.05），提示移植組的大鼠卵巢功能得到了有效的改善，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在CDDP建立的早發(fā)卵巢功能不全的大鼠體內(nèi)存活和轉(zhuǎn)移，并且能夠?qū)Υ笫笱逯械腇SH、E2、AMH、LH這些激素水平產(chǎn)生影響，鏡下觀卵巢結(jié)構(gòu)中顆粒細(xì)胞核膜逐漸修復(fù)，核仁出現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體少量存在，可見臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的再生。

本研究為期待間充質(zhì)干細(xì)胞治療早發(fā)性卵巢功能不全的治療提供了理論依據(jù)，初步探討靜脈注射方法的可行性，為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域提供了一些新的思路，為臨床上治療早發(fā)性卵巢功能不全提供新的方法。為化療藥物導(dǎo)致的POI的治療提供新的臨床借鑒研究。近年來POI的發(fā)病率呈上升趨勢。POI不但導(dǎo)致年輕女性閉經(jīng)、繼發(fā)性不孕、低雌激素等臨床癥狀，且對患者神經(jīng)系統(tǒng)、心腦血管、內(nèi)分泌、骨骼等全身多器官構(gòu)成影響，嚴(yán)重影響患者的身心健康[15-20]。但是POI還沒有非常有效的治療方法，因此針對POI的相關(guān)研究將為該疾病的治療具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可以在大鼠體內(nèi)存活并改善順鉑造模所致卵巢早發(fā)功能不全，可以在一定程度上修復(fù)卵巢的內(nèi)分泌功能。但是人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能否在人體內(nèi)存活和發(fā)揮作用以及其發(fā)揮作用的具體機(jī)制仍需免疫學(xué)及移植試驗(yàn)進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1]杜靜，劉文慧，王婷，等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對卵巢早衰大鼠卵巢超微結(jié)構(gòu)和功能的影響[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2018，27（2）：127-130.

[2]阿卜力孜·克熱木，阿孜古麗·要力瓦斯，穆拉迪力·約麥爾，等.慢性應(yīng)激對卵巢早衰大鼠血清中E2、FSH、LH及β-EP水平的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2019，37（3）：631-634，778-779.

[3]侯巧妮，馬會明，相麗，等.人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞移植對化療所致卵巢早衰大鼠卵巢功能的影響[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2019，57（2）：52-60.

[4]周宇，賈玉玲，嚴(yán)大為，等.兩種小鼠卵巢早衰模型的比較[J].上海醫(yī)學(xué)，2018，41（8）：489-494.

[5]張瑩瑩，殷慧群，倪豐，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植在卵巢早衰小鼠卵巢功能重建中應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，44（1）：44-49.

[6]趙笛，趙丕文，武虹波，等.二仙湯對順鉑所致大鼠卵巢早衰模型中卵巢顆粒細(xì)胞增殖及周期的影響[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2017，10（2）：131-136.

[7]張麗娟，陶仕英，趙丕文，等.順鉑建立大鼠卵巢早衰模型的實(shí)驗(yàn)研究[J].世界中醫(yī)藥，2015，10（10）：1563-1565，1569.

[8] Prasad S，Gupta T，Divya A.Correlation of the day 3 FSH/LH ratio and LH concentration in predicting IVF outcome[J].J Rep Fertil，2013，14（1）：23-28

[9] Dayal M，Sagar S，Chaurasia A，et al.Anti-Mullerian hormone：a new maker of ovrian function[J].J Obstet Gynecol India，2014，64（2）：130-133

[10]胡佳佳，尹春艷.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對圍絕經(jīng)期大鼠INHB和AMH的影響[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2015，24（5）：357-359

[11]陳士嶺，周星宇.早發(fā)性卵巢功能不全的臨床診治進(jìn)展[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2018，56（4）：1-7.

[12]張靈俐，王婷，劉文慧等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療POF大鼠可行性及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2018，47（31）：3968-3972.

[13]孫海梅，楊姝，吳波等.優(yōu)化人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞方法的建立[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，39（4）：617-621.

[14]劉雅文.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞最佳制備條件的研究[J].生物化工，2018，4（3）：89-90.

[15]婁云云.間充質(zhì)干細(xì)胞制劑保存穩(wěn)定性探索[J].生物化工，2018，4（3）：63-64.

[16]李慧，張琛，崔恒，等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療早發(fā)性卵巢功能不全的研究進(jìn)展[J].中國婦產(chǎn)科臨床雜志，2017，18（5）：478-480.

[17]梁元晶，曾婷婷，路欣.化療藥物對大鼠卵巢儲備功能的影響[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2019，16（7）：27-30.

[18]高翔.環(huán)磷酰胺對風(fēng)濕病育齡婦女卵巢損傷的臨床研究[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2019，17（5）：149-151.

[19]王世宣，張金金.卵巢衰老的機(jī)制與預(yù)防研究進(jìn)展[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2019，57（2）：16-22，39.

[20]賈紫千，馮曉玲，趙顏，等.針?biāo)幗Y(jié)合治療卵巢儲備功能下降的研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥雜志，2019，34（3）：1124-1127.

（收稿日期：2019-04-15） （本文編輯：田婧）