基于TLR4/NF-κB信號(hào)通路探討醒腦靜改善反復(fù)缺血-再灌注腦損傷小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用研究

廖衛(wèi)寧　楊麗　張合　董文理

【摘要】 目的：探討醒腦靜通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路改善反復(fù)缺血-再灌注（I/R）腦損傷小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用。方法：將50只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組，醒腦靜低、中、高劑量組，制備大鼠腦反復(fù)I/R損傷模型。造模成功2 h后，醒腦靜低、中、高劑量組分別給予醒腦靜注射液1、5、10 mL/kg進(jìn)行腹腔注射，1次/d，連續(xù)給藥7 d。假手術(shù)組和模型組腹腔給予等容量生理鹽水。用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，對(duì)腦組織進(jìn)行TTC染色，檢測(cè)腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、TLR4、NF-κB和IκBα表達(dá)。結(jié)果：與假手術(shù)組相比，模型組小鼠逃避潛伏期的時(shí)間和腦梗死體積均顯著升高，腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、TLR4、NF-κB和IκBα表達(dá)均顯著升高，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著降低（P<0.05）;與模型組相比，各醒腦靜治療組小鼠逃避潛伏期的時(shí)間和腦梗死體積均顯著降低，腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、TLR4、NF-κB和IκBα表達(dá)均顯著降低，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加（P<0.05），且隨藥物劑量增大而變化（P<0.05）。結(jié)論：醒腦靜能減小腦梗死體積，改善反復(fù)腦I/R損傷小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與抑制腦組織中TLR4/NF-κB信號(hào)通路，減輕炎癥刺激有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 醒腦靜; TLR4/NF-κB信號(hào)通路; 反復(fù)缺血-再灌注腦損傷; 學(xué)習(xí)記憶能力

Effect of Xingnaojing on Learning and Memory in Mice with Repeated Ischemia-reperfusion Brain Injury Based on TLR4/NF-κB Signaling Pathway/LIAO Weining，YANG Li，ZHANG He，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（21）：030-034

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Xingnaojing on learning and memory in mice with repeated ischemia-reperfusion brain injury based on TLR4/NF-κB signaling pathway.Method：Fifty male C57BL/6 mice were randomly divided into sham-operated group and model group，and Xingnaojing low，medium and high dose groups.The brain repeated I/R injury model were established.Two hours after the successful establishment of the model，Xingnaojing low，medium and high dose groups were given intraperitoneal injection of 1，5 and 10 mL/kg respectively，once a day for 7 days.The sham-operated group and model group were given intraperitoneal saline of equal volume.Morris water maze test was used to detect the learning and memory ability of mice.TTC staining was used to detect the expression of TNF-α，IL-1β，IL-6，TLR4，NF-κB and IκBα in brain tissue.Result：Compared with the sham-operated group，the time of escape latency and the volume of cerebral infarction in the model group were significantly increased，and the expressions of TNF-α，IL-1β，IL-6，TLR4，NF-κB and IκBα in brain tissue were significantly increased，and the times of crossing the platform were significantly decreased（P<0.05）.Compared with the model group，the time of escape latency and the volume of cerebral infarction in the Xingnaojing treatment group were significantly decreased，and the expressions of TNF-α，IL-1β and IL-6 in brain tissue were significantly decreased，and the expression of TLR4，NF-κB and IκBα decreased significantly，and the number of times crossing the platform increased significantly（P<0.05），and changed with the increase of drug dosage（P<0.05）.Conclusion：Xingnaojing can reduce the volume of cerebral infarction and improve the learning and memory ability of mice with repeated brain I/R injury.Its mechanism may be related to inhibiting TLR4/NF-κB signaling pathway in brain tissue and alleviating inflammatory stimulation.

【Key words】 Xingnaojing; TLR4/NF-κB signaling pathway; Repeated cerebral ischemia-reperfusion injury; Learning and memory ability

First-authors address：Xianning Central Hospital，the First Affiliated Hospital of Hubei University of Science and Technology，Xianning 437100，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.21.008

缺血性腦卒中是全球成年人死亡和殘疾的主要原因[1]。組織纖溶酶原激活劑（t-PA）靜脈溶栓治療缺血性腦卒中目前已獲批準(zhǔn)，但會(huì)引起腦缺血/再灌注（I/R）損傷等繼發(fā)性損傷[2]。所以，預(yù)防腦I/R損傷對(duì)缺血性腦卒中的治療具有重要意義。免疫介導(dǎo)在腦I/R損傷中的作用日益被關(guān)注[3]。Toll樣受體（TLRs）在炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)中的重要作用已被證實(shí)，Toll樣受體4（TLR4）在腦I/R后被發(fā)現(xiàn)具有高度的誘導(dǎo)作用，可誘導(dǎo)激活多個(gè)激酶和核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）[4]。有研究顯示，TLR4/NF-κB信號(hào)通路參與腦I/R損傷的損傷性炎癥過(guò)程，抑制TLR4/NF-kB信號(hào)通路可下調(diào)炎癥反應(yīng)，減輕腦損傷[5]。因此，TLR4/NF-kB信號(hào)通路可能是腦I/R損傷的治療靶點(diǎn)。目前，許多研究集中在探索抗炎和神經(jīng)保護(hù)因子，可能減輕腦I/R損傷。醒腦靜由麝香、冰片等提取精制而成的傳統(tǒng)中藥，對(duì)各種病因引起的意識(shí)障礙以及高熱等具有顯著療效，可通過(guò)降低腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但醒腦靜對(duì)意識(shí)障礙的治療作用的機(jī)制尚不清楚[6-7]。因此，考慮到醒腦靜在炎性疾病和意識(shí)障礙中的作用，本研究假設(shè)醒腦靜通過(guò)下調(diào)TLR4/NF-κB信號(hào)通路來(lái)保護(hù)腦I/R損傷，探索醒腦靜在腦I/R損傷中的潛在作用及其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取雄性6周齡C57BL/6小鼠50只，體重18～24 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（冀）2012-0002。在SPF環(huán)境中自由進(jìn)食和飲水，控制飼養(yǎng)環(huán)境晝夜循環(huán)（12 h/12 h），適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物相關(guān)處置均符合《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求。

1.2 主要試劑與儀器 醒腦靜注射液（生產(chǎn)廠家：無(wú)錫濟(jì)民可信山禾藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：Z32020563）;三苯基四氮唑（TTC）（生產(chǎn)廠家：美國(guó)Biosharp公司，注冊(cè)證號(hào)：EZ1609A129）;3%戊巴比妥（生產(chǎn)廠家：上海上藥新亞藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：H31020532）;肌酸磷化脢-同工脢MB（CK-MB）和乳酸脫氫酶（LDH）[生產(chǎn)廠家：中生北控生物科技有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：京藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2010第2400837號(hào)和第2400838號(hào)];TNF-α、IL-1β和IL-6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（生產(chǎn)廠家：京美生物科技有限公司）;BCA蛋白測(cè)定試劑盒和Western Blot試劑盒（生產(chǎn)廠家：上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;蛋白抽提試劑盒（生產(chǎn)廠家：武漢博士德生物工程有限公司）;TLR4、NF-κB和IκBα（生產(chǎn)廠家：美國(guó)Santa Cruz公司）;鼠抗β-actin單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記親和純化山羊抗鼠IgG二抗（生產(chǎn)廠家：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）;Morris水迷宮裝置及DigBehv動(dòng)物行為分析系統(tǒng)（生產(chǎn)廠家：上海吉量軟件科技有限公司，中國(guó)）;HBS-1096B酶標(biāo)儀（生產(chǎn)廠家：南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;凝膠成像儀（生產(chǎn)廠家：美國(guó)UVP公司）;BIO-RAD垂直電泳儀（生產(chǎn)廠家：美國(guó)BIO-RAD公司）。

1.3 分組與造模 根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠均分為假手術(shù)組，模型組，醒腦靜低、中、高劑量組。每組用5只大鼠進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)和TTC染色、5只進(jìn)行腦蛋白測(cè)定。制備大鼠腦反復(fù)I/R損傷模型：大鼠禁食12 h后用3%戊巴比妥（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，用無(wú)損動(dòng)脈夾夾閉左側(cè)頸總動(dòng)脈20 min，松開(kāi)動(dòng)脈夾10 min后再關(guān)閉，反復(fù)3次，最后去除動(dòng)脈夾，恢復(fù)血液供應(yīng)，用生理鹽水清洗切口后逐層縫合，分籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組只分離血管，不進(jìn)行阻塞血流。造模成功2 h后，醒腦靜低、中、高劑量組分別給予醒腦靜注射液1、5、10 mL/kg進(jìn)行腹腔注射，1次/d，連續(xù)給藥7 d。假手術(shù)組和模型組腹腔給予等容量生理鹽水。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 術(shù)前第3天至手術(shù)前小鼠在Morris水迷宮內(nèi)自由游泳以適應(yīng)環(huán)境，術(shù)后第3天開(kāi)始對(duì)大鼠進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練，連續(xù)進(jìn)行4 d。在停藥后進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。

1.5 TTC染色 做完Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)后處死小鼠，取完整腦組織，行冠狀位切片，厚度2 mm，置于2%的TTC染液中孵育30 min，用磷酸鹽緩沖液終止染色。用Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算梗死體積。

1.6 Elisa法檢測(cè)腦組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平 取適量損傷側(cè)腦組織，制成勻漿，吸取上清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行IL-1β和TNF-α含量測(cè)定，在450 nm處測(cè)各孔吸光度（A）值。

1.7 Western Blot法檢測(cè)腦組織中TLR4、NF-κB和IκBα的表達(dá) 取適量損傷側(cè)腦組織，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，用預(yù)冷的PIPA裂解液充分勻漿，冰浴2 h;離心取上清，-80 ℃保存。進(jìn)行電泳、切膠;孵育一抗、孵育二抗，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并進(jìn)行分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，組間比較用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 醒腦靜對(duì)反復(fù)腦I/R損傷小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 與假手術(shù)組相比，模型組小鼠逃避潛伏期時(shí)間顯著升高，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組相比，各醒腦靜治療組小鼠逃避潛伏期的時(shí)間均顯著降低，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著升高，且隨藥物劑量增大而變化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腦梗死體積顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組相比，各醒腦靜治療組小鼠腦梗死體積顯著降低，且隨藥物劑量增大而降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1和圖1。

2.2 醒腦靜對(duì)反復(fù)腦I/R損傷小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組相比，各劑量醒腦靜治療組小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著降低，且隨藥物劑量增大而降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 醒腦靜對(duì)反復(fù)腦I/R損傷小鼠腦組織中TLR4、NF-κB和IκBα表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腦組織中TLR4、NF-κB和IκBα表達(dá)均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組相比，各劑量醒腦靜治療組小鼠腦組織中TLR4、NF-κB和IκBα表達(dá)均顯著降低，且隨藥物劑量增大而降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3和圖2。

3 討論

腦血管病是臨床常見(jiàn)病，腦缺血性卒中是最常見(jiàn)的。腦缺血性卒中的后果之一是腦缺血導(dǎo)致腦梗死，進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙和血管性癡呆，給患者及其家屬帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力[8]。選擇C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，因?yàn)樵谛∈笃废抵校珻57BL/6小鼠最易發(fā)生腦缺血。它們的后交通動(dòng)脈也發(fā)育不良，因此無(wú)法彌補(bǔ)額葉腦缺血，有助于建立反復(fù)腦I/R損傷模型[9]。Morris水迷宮主要檢測(cè)空間記憶能力，可以排除動(dòng)物情緒改變的干擾，尤其對(duì)與海馬密切相關(guān)的認(rèn)知功能高度敏感[10]。本研究結(jié)果表明，醒腦靜對(duì)小鼠大腦的學(xué)習(xí)記憶功能有神經(jīng)保護(hù)作用。同時(shí)，經(jīng)醒腦靜處理的小鼠腦梗死灶大小均有明顯改善。因此，醒腦靜可能是一種潛在的治療認(rèn)知缺陷的有效藥物。

近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，免疫介導(dǎo)機(jī)制在腦I/R繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。免疫介導(dǎo)的機(jī)制成為一個(gè)新的前沿，腦I/R引起的腦損傷部分原因是腦缺血發(fā)作后短時(shí)間內(nèi)炎癥繼發(fā)損傷[11]。因此，在設(shè)計(jì)改善腦I/R損傷結(jié)局的治療策略時(shí)需要更多的考慮，抑制炎癥反應(yīng)已成為腦I/R損傷的治療靶點(diǎn)。

醒腦靜在炎性疾病和神經(jīng)病理學(xué)中具有保護(hù)作用[12]。然而，醒腦靜對(duì)腦I/R損傷的神經(jīng)保護(hù)作用尚不清楚，醒腦靜對(duì)炎癥信號(hào)通路的拮抗能力尚待確定。在腦I/R損傷后的炎癥反應(yīng)中，膠質(zhì)細(xì)胞被激活，外周免疫細(xì)胞浸潤(rùn)大腦，分泌大量炎癥細(xì)胞因子，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。TNF-α、IL-1β和IL-6是潛在的細(xì)胞炎性因子，在腦I/R進(jìn)展過(guò)程中，TNF-α、IL-1β和IL-6的水平顯著增加[13]。本研究結(jié)果表明，醒腦靜顯著降低TNF-α、IL-1β和IL-6水平。因此，醒腦靜抑制腦I/R后炎癥反應(yīng)。在接下來(lái)的研究中，繼續(xù)探索了其神經(jīng)保護(hù)和抗炎作用的潛在機(jī)制。

TLRs的激活已被證實(shí)在炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，TLRs是一類跨膜模式識(shí)別受體，可被缺血損傷或應(yīng)激細(xì)胞釋放的內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）激活[14]。TLR4是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物TLRs。DAMPs可以激活鄰近小膠質(zhì)細(xì)胞中的TLR4/NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的釋放，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的變性和凋亡[15]。在腦I/R損傷中，TLR4表達(dá)增加，激活NF-κB，導(dǎo)致IκBα磷酸化[16]。近期研究也證明，TLR4缺乏癥小鼠腦I/R后TLR4低誘導(dǎo)，腦I/R損傷減輕[17]。炎癥的發(fā)生受到一系列基因的表達(dá)和調(diào)控，NF-κB是其中關(guān)鍵成員。在腦I/R損傷惡化后，NF-κB表達(dá)增加，導(dǎo)致生成大量的炎癥細(xì)胞因子并釋放[18]。本研究結(jié)果顯示，醒腦靜能抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路。

綜上所述，醒腦靜通過(guò)抑制腦組織中TLR4/NF-κB信號(hào)通路，能改善反復(fù)腦I/R損傷小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。同時(shí)，醒腦靜調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)參與了TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，為進(jìn)一步了解醒腦靜治療腦I/R損傷的機(jī)制提供了新的思路。

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（收稿日期：2019-05-08） （本文編輯：程旭然）