心無憂片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

羅鐳 邵喜英

[摘要] 目的 建立并提升心無憂片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 方法 采用薄層色譜法對心無憂片中的細(xì)辛、茵陳及丹參進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法測定心無憂片中丹酚酸B的含量。色譜柱為Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（25∶75），流速為1.0 mL/min，檢測波長為286 nm，柱溫為30℃。 結(jié)果 鑒別方法專屬性強，定量方法簡便、準(zhǔn)確，丹酚酸B進(jìn)樣量在0.0735～3.6750 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為1.0000;平均回收率為101.20%，RSD為1.05%。 結(jié)論 該方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為心無憂片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

[關(guān)鍵詞] 心無憂片;薄層色譜法;高效液相色譜法;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

[中圖分類號] R927.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）07（a）-0029-05

Study on the improvement of quality standard of Xinwuyou Tablets

LUO Lei1? ?SHAO Xiying2

1.Department of Traditional Chinese Medicine， Zhejiang Institute for Food and Drug Control， Zhejiang Province， Hangzhou? ?310052， China; 2.Department of Medical Oncology， Zhejiang Cancer Hospital， Zhejiang Province， Hangzhou? ?310022， China

[Abstract] Objective To eastablish and improve the quality standard of Xinwuyou Tablets. Methods Thin-layer chromatography was used to identify Asari Radix et Rhizoma， Artemisiae Scopariae Herba and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma， and high performance liquid chromatography was applied for the determination of salvianolic acid B in Xinwuyou Tablets. Kromasil C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was adopted with a mobile phase of acetonitrile-0.1% phosphoric acid （25∶75） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength wad set at 286 nm and the column tempetature was 30℃. Results The thin-layer chromatography identification was highly specific. The method of content determination was simple and accurate. The good linearity with peak areas was achieved in the range of 0.0735-3.6750 μg （r = 1.0000） for salvianolic acid B. The average recovery was 101.20% and the RSD was 1.05%. Conclusion The method is simple， accurate and reproducible， and can be used for the quality control of Xinwuyou Tablets.

[Key words] Xinwuyou Tablets; Thin-layer chromatography; High performance liquid chromatography; Quality standard

心無憂片是由黃楊木、細(xì)辛、丹參、川芎、茵陳、射干、土木香、瓜蔞皮八味中藥組成的復(fù)方制劑，具有理氣活血、寬胸止痛的功效，用于胸痹氣滯血瘀癥，癥見胸痛、胸悶、心悸、氣短、頭昏、乏力等[1]。邵友鳳[2]、李劍平等[3]用心無憂片治療冠心病、心絞痛，結(jié)果顯示能增加心肌供氧、擴張冠脈、改善冠脈血流量、增加心臟耐缺氧能力。閔旸等[4]通過抗冠狀動脈血栓作用動物實驗研究，發(fā)現(xiàn)心無憂片對狗冠脈結(jié)扎引起的心肌梗死有明顯的治療作用，對大鼠藥物引起的心肌缺血有明顯的預(yù)防作用，對動物實驗性血栓形成和血小板聚集有明顯的抑制作用。

心無憂片現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅制訂了丹參酮ⅡA的薄層鑒別[1]，質(zhì)控項目少。檢索心無憂片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究文獻(xiàn)[5-7]，大部分為研究丹參酮ⅡA等脂溶性成分，而心無憂片生產(chǎn)工藝為水煎煮，脂溶性成分水煎煮得率低，不太適合作為心無憂片的含測指標(biāo)。對方中其他藥味的含測方法進(jìn)行文獻(xiàn)查閱[8-14]，大多還是以脂溶性成分為主。綜合考量，最終選擇丹參中水溶性成分丹酚酸B作為含測指標(biāo)，參照文獻(xiàn)[15-18]建立了心無憂片中丹酚酸B含測方法。近年來研究報道[19-21]，丹酚酸B能夠抗心肌纖維化，對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。因此選擇丹酚酸B作為含測指標(biāo)，正好與心無憂片治療冠心病、心絞痛的功效相呼應(yīng)，對于心無憂片質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)的提升具有重要的意義。

心無憂片現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控項目簡單，為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，筆者對心無憂片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了深化研究，建立了心無憂片中細(xì)辛、茵陳、丹參薄層色譜鑒別及丹酚酸B的高效液相色譜法（HPLC）含量測定方法，提升了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AD型高效液相色譜儀（日本島津公司）;XPE205十萬分之一分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）;Elmasonic P型超聲儀（德國Elma公司）;Milli-Q型純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

心無憂片（批號20151201、20150301、20140601，杭州天目山藥業(yè)股份有限公司）;對照品及對照藥材：細(xì)辛（批號：121204-201606）、茵陳（批號：120950-201608）、丹參酮ⅡA（批號：110766-201520）、丹酚酸B（批號：111562-201615，含量以96.2%計）均來源于中國食品藥品檢定研究院。液相用甲醇為Merck公司色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 細(xì)辛

取心無憂片20片，除去糖衣，研細(xì)，粉末倒入圓底燒瓶中，加水約200 mL，圓底燒瓶放入電熱套，燒瓶口接上揮發(fā)油提取器，提取器刻度部分加適量水，再加乙酸乙酯2 mL，開啟電熱套加熱至微沸，煮沸約3 h，分取乙酸乙酯液，作為供試品溶液。稱取細(xì)辛對照藥材約0.5 g，按上述方法制備對照藥材溶液。另按處方量制備除去細(xì)辛的心無憂片陰性樣品，按上述方法制備心無憂片陰性供試品溶液。分別吸取上面3種樣品溶液各10 μL，少量多次點于同一塊硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（4∶1）混合溶液作為展開劑，展開至約8 cm，取出，置通風(fēng)柜吹干，噴以10%硫酸乙醇溶液顯色劑，在105℃加熱至斑點顯色清晰，放置紫外光燈（365 nm）下拍照，結(jié)果見圖1，心無憂片樣品溶液與對照藥材溶液均顯示一個相同顏色的熒光主斑點，陰性樣品溶液未顯示該熒光主斑點，說明缺味無干擾。

2.1.2 茵陳

取心無憂片20片，除去糖衣，研細(xì)，粉末倒入50 mL具塞錐形瓶，加入70%甲醇30 mL，蓋上塞子，用封口膜密封，置超聲儀中超聲處理20 min，放冷，濾紙過濾，濾液置水浴上蒸干，殘渣加水10 mL溶解，溶液加于D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為15 cm），先用水100 mL沖洗，水洗液棄去，再用30%乙醇50 mL沖洗，收集沖洗液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。稱取綠原酸對照品適量，加甲醇制備成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。另按處方量制備除去茵陳的陰性樣品，按上述方法制備心無憂片陰性供試品溶液。分別吸取上述3種溶液各10 μL，少量多次點于同一聚酰胺薄膜板上，用醋酸作為展開劑，展開至8 cm，取出，置通風(fēng)柜中吹干，再用氨蒸汽熏約3 min后，放置紫外光燈（365 nm）下拍照，結(jié)果見圖2，在心無憂片樣品溶液與對照品溶液顯一個相同的熒光斑點，陰性樣品溶液未顯該熒光斑點，缺味無干擾。

2.1.3 丹參

取本品2 g，除去糖衣，研細(xì)，粉末倒入100 mL圓底燒瓶，加入20 mL乙醇，置水浴上加熱回流1 h，過濾，濾液蒸干，殘渣用乙醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。稱取丹參酮ⅡA對照品適量，用乙醇制備成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。另按處方量制備除去丹參的陰性樣品，按上述方法制備心無憂片陰性供試品溶液。分別吸取上述3種溶液各10 μL，少量多次點于同一硅膠G薄層板上，用石油醚（30～60℃）-三氯甲烷-乙酸乙酯（35∶5∶1）混合溶液作為展開劑，展開8 cm，取出，置通風(fēng)柜中吹干，放置日光下拍照，結(jié)果見圖3，心無憂片供試品顯示與對照品相同顏色的斑點，缺味未顯該紅色斑點，表明缺味無干擾。

2.2 HPLC定量測定

2.2.1 色譜條件

Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;體積流量1.0 mL/min;流動相乙腈-0.1%磷酸溶液（25∶75）;檢測波長286 nm;柱溫30℃;進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 制備對照品溶液? 精密稱量丹酚酸B對照品19.10 mg，置50 mL量瓶中，用70%甲醇溶解并定容，搖勻，即得0.3675 mg/mL對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液2 mL，置于10 mL量瓶中，用70%甲醇溶解并定容，得到0.0735 mg/mL對照品溶液。

2.2.2.2 制備供試品溶液? 取心無憂片20片，除去糖衣，精密稱定，用料理機打粉，精密稱取粉末約0.5 g，倒入具塞錐形瓶里，精密量取70%甲醇25 mL加入具塞錐形瓶里，蓋上塞子，用封口膜密封，稱重，再置超聲儀中超聲30 min，放置室溫，再稱重，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，高速離心，取上清液作為供試品溶液。

2.2.2.3 制備陰性樣品溶液? 按處方配比（除去丹參）模擬制劑工藝，制備出缺少丹參的陰性樣品，再按上述“2.2.2.2”項下方法，制備陰性樣品溶液。

2.2.3 專屬性考察

采用自動進(jìn)樣器依次吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL，打入高效液相色譜儀系統(tǒng)，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，測定結(jié)果見圖4，供試品溶液呈現(xiàn)與對照品溶液一致的丹酚酸B色譜峰，陰性樣品溶液未出現(xiàn)丹酚酸B的色譜峰，表明陰性對照無干擾，方法專屬性良好。

2.2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.2.1”項下0.0735 mg/mL對照品溶液1、3、5、10 μL及0.3675 mg/mL對照品儲備液3、5、10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積作為縱坐標(biāo)（Y），以對照品進(jìn)樣量作為橫坐標(biāo)（X），制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為：Y = 658.35X- 2585.02（r = 1.0000），結(jié)果丹酚酸B進(jìn)樣量范圍在0.0735～3.6750 μg內(nèi)與其對應(yīng)的峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗

精密吸取“2.2.2.1”項下0.0735 mg/mL的丹酚酸B對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次測定丹酚酸B峰面積，結(jié)果丹酚酸B峰面積的RSD為0.24%，說明儀器進(jìn)樣偏差小、儀器精密度好。

2.2.6 重復(fù)性試驗

取同一批號（批號：20151201）心無憂片樣品6份，每份稱取約0.5 g，精密稱定，倒入具塞錐形瓶里，按照“2.2.2.2”項下步驟同法制備重復(fù)性用供試品溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果心無憂片中丹酚酸B的平均含量為3.243 mg/g，RSD為0.39%，表明供試品制備方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一份心無憂片供試品溶液，分別于0、3、9、18、24 h 進(jìn)樣測定丹酚酸B峰面積，計算各時間點丹酚酸B峰面積的RSD為0.23%，表明心無憂片供試品溶液中丹酚酸B成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗

采用加樣回收法，稱取已知含量的心無憂片樣品（批號：20151201）6份，每份約0.25 g，精密稱定，倒入置具塞錐形瓶里，分別加入丹酚酸B對照品溶液（0.3675 mg/mL）2 mL，精密量取70%甲醇23 mL加入具塞錐形瓶里，蓋上塞子，按照“2.2.2.2”項下步驟同法制備回收率用供試品溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣測定，計算回收率，結(jié)果心無憂片中丹酚酸B的平均回收率為100.01%，6份樣品RSD為0.15%，表明方法回收率良好，結(jié)果見表1。

2.2.9 樣品測定

對收集到的3批樣品，按建立的含量測定方法進(jìn)行測定，3批樣品測定結(jié)果分別為1.07、1.82、1.09 mg/片。

3 討論

3.1 細(xì)辛薄層色譜顯色方法的選擇

參考藥典方法為香草醛硫酸顯色后置日光下檢測，結(jié)果斑點雜亂，缺味有干擾。后采用硫酸乙醇顯色，置365 nm下檢測，結(jié)果有一個亮黃色的特征性斑點，缺味無干擾。該薄層方法系首次開發(fā)實現(xiàn)，可用于細(xì)辛藥材特征性薄層鑒別。

3.2 提取條件的選擇

比較了30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇不同提取溶劑，結(jié)果甲醇提取效率最低，30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇提取效率相當(dāng)，30%甲醇樣品溶液澄清度不如70%甲醇樣品溶液，故最終選擇70%甲醇作為提取溶劑。另外比較了超聲和回流兩種提取方法，無明顯差異，考慮到超聲提取更為簡便，最終選擇超聲提取。

3.3 丹酚酸B溶液穩(wěn)定性問題

實驗比較發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B對照品溶液光照后峰面積慢慢逐漸變小，采取避光措施后溶液穩(wěn)定性良好，實驗過程需注意避光操作。

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