自釀原漿啤酒氨基酸態(tài)氮含量和總酸的測(cè)定

米 智，劉荔貞，武曉紅，駢亞男

（1.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西大同 037009；2.山西大同大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，山西大同 037009）

啤酒是以大麥芽為主要原料，添加顆粒酒花，經(jīng)酵母菌發(fā)酵釀制而成的含二氧化碳、起泡、低酒精濃度的飲料酒。啤酒作為一種低酒精度的麥芽飲品，因其具有良好的風(fēng)味、豐富的營(yíng)養(yǎng)及良好的口感而頗受消費(fèi)者喜愛。

啤酒是全球消費(fèi)人數(shù)最多、分布國(guó)家最廣、產(chǎn)銷量最大的酒種。因其具備特有的“色香味”，故風(fēng)味物質(zhì)是其質(zhì)量的重要組成部分。啤酒風(fēng)味主要包括聞到的香氣（aroma）、嘗到的口味（taste）及感覺到的口感（mouthfeel）[1]。香氣、口味是由一種或幾種風(fēng)味化學(xué)物質(zhì)刺激嗅覺傳感器或味覺傳感器產(chǎn)生?？诟惺瞧【婆c口腔、牙齒、牙齦等的接觸感覺，由觸覺傳感器產(chǎn)生，受物質(zhì)本身及物質(zhì)間交互作用的影響，是啤酒的一種綜合感覺[2]。已經(jīng)證明，適度飲用啤酒，至少與喝葡萄酒效果相同，可降低冠心病、心臟病的發(fā)病率，降低糖尿病的死亡率等[3-4]。

化學(xué)成分是風(fēng)味形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)決定了啤酒的質(zhì)量和風(fēng)格特色。啤酒中的風(fēng)味物質(zhì)有數(shù)千種之多，主要包括醇類、酯類、有機(jī)酸類、酮類、醛類、呋喃類（麥芽香）、吡嗪類（麥芽香）、烯類（顆粒酒花香）、氨基酸、二甲基硫醚（DMS）和二氧化硫等[5]。它們之間微妙的平衡關(guān)系，共同構(gòu)成啤酒的特有風(fēng)格。啤酒的苦味主要源自酒花樹脂，極少部分來(lái)自釀造過(guò)程的苦味肽、氨基酸、多酚等非顆粒酒花成分[6-7]。啤酒的風(fēng)味和香氣也受到二氧化碳?jí)毫Φ挠绊慬8-9]。有文獻(xiàn)報(bào)道，啤酒中所有風(fēng)味活性成分都是由酵母產(chǎn)生的，這些化合物決定啤酒的最終質(zhì)量[10]。啤酒中含有各種酸類200 種以上，這些酸及其鹽類控制著啤酒的pH 值和總酸的含量[11]。就口感而言，酸類物質(zhì)是啤酒的主要風(fēng)味成分之一?？偹徇m度的啤酒口感清爽；酸含量太低時(shí)啤酒口感粗糙、不爽；總酸偏高,口味單調(diào)，入口有不愉快的感覺[12]。啤酒的氨基酸態(tài)氮是用來(lái)反映其中的氨基酸及小肽總體水平的重要指標(biāo)，其含量的高低也影響酒的質(zhì)量等級(jí)和整體風(fēng)味[13]。所以，啤酒總酸和氨基酸態(tài)氮的檢驗(yàn)和控制是十分重要的。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：山西大同大學(xué)生物工程試驗(yàn)中心釀造原漿啤酒，市售常見啤酒（易拉罐裝雪花、哈爾濱和純生啤酒）。

菌種及原料：啤酒活性干酵母s-23（弗曼迪斯酵母有限公司），大麥芽（山東濟(jì)南豪魯機(jī)械設(shè)備有限公司），顆粒酒花（美國(guó)Cascade，威海德科生物科技有限公司）。

試劑：氫氧化鈉（AR，上海源葉生物科技有限公司）、甲醛（天津市福晨化學(xué)試劑廠）、酚酞（無(wú)錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司）、pH6.86、pH 9.18 標(biāo)準(zhǔn)緩沖液（成都方舟科技有限公司）。

儀器設(shè)備：山西大同大學(xué)生物工程試驗(yàn)中心100 L 原漿啤酒生產(chǎn)線，糖度計(jì)，精密電子天平、恒溫水浴鍋、堿式滴定管、pHS-3C 酸度計(jì)，成都世紀(jì)方舟科技有限公司；電磁爐（蘇泊爾）、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州市金壇友聯(lián)儀器研究所；85-2 數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，常州市金壇良友儀器有限公司等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 自釀原漿啤酒生產(chǎn)工藝（圖1）

圖1 自釀原漿啤酒生產(chǎn)工藝流程圖

（1）大麥原料的選擇。大麥芽一般含有淀粉、半纖維素和麥膠物質(zhì)、蛋白質(zhì)和多酚物質(zhì)，而蛋白質(zhì)含量高低和類型，直接影響制麥芽醪和釀造工藝及啤酒的質(zhì)量。一般宜選用蛋白質(zhì)含量低、色度和黏度較低的大麥芽原料。

（2）大麥芽的粉碎。由于大麥芽具有谷皮，粉碎可適當(dāng)細(xì)些，有較大的比表面積，使物料中儲(chǔ)藏物質(zhì)增加和水、酶的接觸面積，加速酶促反應(yīng)及物料的溶解。大麥芽粉碎時(shí)應(yīng)做到皮殼破而不碎，以提高過(guò)濾效率，故要盡量使用濕法粉碎或增濕粉碎，以保持大麥芽種皮和果皮的完整性。所謂濕法粉碎，是將麥芽用20～50 ℃的溫水浸泡15～20 min，使麥芽含水量達(dá)25%～30%之后，再用濕式粉碎機(jī)粉碎，之后兌入30～40 ℃的水調(diào)漿，泵入糖化鍋。大麥芽粉碎時(shí)，谷皮25%～30%，粗粒8%～12%，細(xì)粒30%～35%，細(xì)粉20%～25%。

（3）糖化。糖化主要指麥芽和輔料中高分子貯藏物質(zhì)及其分解產(chǎn)物，通過(guò)麥芽中各種水解酶類作用，以及水和熱力作用，使之分解并溶解于水。主要考慮淀粉等糖類和蛋白質(zhì)的分解。淀粉糖化時(shí)，主要有α-淀粉酶、β-淀粉酶、異淀粉酶和葡萄糖酶4 種，綜合4 種酶的最適溫度和最適pH 值，投料溫度為50～55 ℃，70 min，pH 值為5～6 之間；隨后升溫至60～65 ℃，70 min，pH 值為5～6 之間。最后用碘液試醪液不呈色來(lái)鑒別。

麥芽蛋白水解最終產(chǎn)物——氨基酸是合成啤酒酵母含氮物質(zhì)的主要來(lái)源。麥汁中可溶性氮及其分解中間產(chǎn)物——肽類是啤酒風(fēng)味和泡持性的重要物質(zhì)，它們賦予啤酒醇厚豐滿的口感。在糖化工程中蛋白質(zhì)分解主要依靠麥芽的蛋白酶和羧肽酶催化水解，其次是氨肽酶和二肽酶，它們的作用溫度是40～65 ℃，蛋白質(zhì)休止分階段進(jìn)行，增加63 ℃溫度段，并適當(dāng)延長(zhǎng)休止時(shí)間。

其糖化工藝如下：

50 ℃投料，保溫30 min→55 ℃保溫70 min→65 ℃保溫80 min→72 ℃直至碘檢合格為止→75 ℃麥汁過(guò)濾。糖化各階段的升溫應(yīng)按1 ℃/min 進(jìn)行控制。

（4）過(guò)濾。麥芽醪過(guò)濾之后剩下的麥糟，應(yīng)該用75 ℃水洗糟1～2次，每次20～30 min，中間開耕刀攪拌1次，以求最大化得到糖度高的醪液。

（5）麥汁煮沸。麥汁煮沸階段，應(yīng)提高煮沸強(qiáng)度，延長(zhǎng)煮沸時(shí)間。如采用外加熱煮沸，在108～110 ℃的溫度下，只需煮沸60～80 min。顆粒酒花中的主要成分有樹脂、顆粒酒花油、多酚等，這些成分在煮沸過(guò)程中的氧化、聚合和異構(gòu)化，對(duì)啤酒有極為重要的意義。顆粒酒花添加量是熱麥汁量的0.1%，分兩次添加顆粒酒花，第一次在初沸10 min時(shí)，添加量為顆粒酒花總量的一半（苦花），第二次煮沸70 min，添加量為顆粒酒花總量的另一半（香花），麥汁煮沸過(guò)程中，由于類黑素的形成以及多酚物質(zhì)的氧化使麥汁的色度不斷上升。

（6）麥汁處理。大麥芽麥汁有較多的熱、冷凝固物，需分離，不僅有利于酵母發(fā)酵，而且有利于提高啤酒的非生物穩(wěn)定性。還需冷卻、充氧等一系列處理，才能制成發(fā)酵麥芽醪。

（7）發(fā)酵。利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有發(fā)酵罐的設(shè)備，按照現(xiàn)行工藝，每天檢測(cè)麥芽醪的糖度，最初麥芽醪入發(fā)酵罐時(shí)的糖度為11 單位，當(dāng)糖度下降至4.2～4.5 時(shí)，可以封罐。封罐4～6 d 后，溫度降至8.0～8.5 ℃，之后每天要檢測(cè)雙乙酰的還原量，并適度降溫。到達(dá)0 ℃及其以下之后，每天排渣一次，以防止酵母自溶。啤酒冷貯的溫度和時(shí)間對(duì)啤酒的冷穩(wěn)定性影響較大。啤酒的冷貯溫度為-1～0 ℃，冷貯時(shí)間至少在7 d 以上，同時(shí)在貯酒過(guò)程中溫度不得回升。

1.2.2 氨基酸態(tài)氮的測(cè)定

啤酒發(fā)酵過(guò)程大約半個(gè)月時(shí)間，故本試驗(yàn)從麥芽醪進(jìn)發(fā)酵罐第1 天開始，到發(fā)酵第15 天結(jié)束，每天同一時(shí)間點(diǎn)取啤酒樣本，同一時(shí)間點(diǎn)做對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)，保證發(fā)酵時(shí)間盡可能相同，做平行實(shí)驗(yàn)3 次，記錄數(shù)據(jù)，Excel分析數(shù)據(jù)。

由于氨基酸是兩性化合物，不能直接用氫氧化鈉溶液滴定，需要先加入甲醛使氨基的堿性被掩蔽后，呈現(xiàn)羧基酸性，才能對(duì)酒樣以氫氧化鈉溶液滴定。

氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定方法以食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.235—2016中的酸度計(jì)法（甲醛值法）[14]。具體步驟如下：

（1）準(zhǔn)確量取5 mL 待測(cè)啤酒移入100 mL 的容量瓶中定容。

（2）從容量瓶中吸取10 mL 稀釋后的啤酒待測(cè)樣品移入100 mL 燒杯中，加水30 mL，打開磁力攪拌器使其攪拌混勻。

（3）用0.05 mol/L 的NaOH 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至酸度計(jì)指示pH8.2，記錄消耗NaOH的體積。

（4）在上述試樣中加入10 mL 準(zhǔn)備好的甲醛溶液，搖勻。再用NaOH 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液繼續(xù)滴定至pH9.2，記錄消耗NaOH的體積。

（5）同時(shí)取80 mL 水，先用0.05 mol/L 的NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至溶液pH8.2，再加入10 mL 甲醛溶液，繼續(xù)用NaOH 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至pH9.2，做試劑空白試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，求平均值，求標(biāo)準(zhǔn)差。

式中：X——試樣中氨基酸態(tài)氮的含量，g/100 mL；

V1——測(cè)定用試樣稀釋液加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；

V2——試劑空白實(shí)驗(yàn)加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；

c——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/mL；

0.014——與1.00 mL 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[c(NaOH)=1.000 mol/L]相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g；

V——吸取試樣的體積，mL；

V3——試樣稀釋液的取用量，mL；

V4——試樣稀釋液的定容體積，mL；

100——單位換算系數(shù)。

1.2.3 總酸的測(cè)定

利用酸堿中和原理，用NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液直接滴定啤酒試樣中的總酸，以pH8.2 為電位滴定終點(diǎn)，根據(jù)消耗NaOH 溶液的體積計(jì)算出啤酒總酸的含量[15]。

酸度計(jì)的校正：按要求連接玻璃電極和飽和甘汞電極。取下甘汞電極膠帽，加液孔膠塞和下端膠帽，用pH6.68和pH9.18(25 ℃)標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液校正酸度計(jì)。

樣品的處理：取待測(cè)啤酒樣本約100 mL 于250 mL 燒杯中，置于40 ℃±0.5 ℃振蕩水浴中恒溫30 min，取出，冷卻至室溫。

樣品的測(cè)量：用水清洗電極，并用濾紙吸干附著電極的液珠。吸取啤酒樣品50 mL 于燒杯中，插入電極，開啟電磁攪拌器，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH8.2 即為終點(diǎn)。記錄所消耗氫氧化鈉的體積。

結(jié)果計(jì)算：試樣的總酸含量即：100 mL 試樣消耗NaOH 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[c（NaOH）=1.0 mol/L]的毫升數(shù)，公式如下：

式中：X——樣品的總酸含量，mL/100 mL；

C——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/100 mL；

V——滴定所消耗氫氧化鈉溶液的體積，mL；

2——換算成100 mL樣品的系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸態(tài)氮含量

2.1.1 自釀原漿啤酒發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮含量（圖2）

圖2 麥芽醪連續(xù)發(fā)酵15 d氨基酸態(tài)氮含量變化

從圖2 可以得到，麥芽醪進(jìn)入發(fā)酵罐連續(xù)發(fā)酵15 d 氨基酸態(tài)氮含量的變化趨勢(shì)，前7 d 呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，在第4 天出現(xiàn)了極大值，約0.0115 g/100 mL，第1 天的氨基酸態(tài)氮含量是個(gè)極低值，約為0.0054 g/100 mL。在第2 周的時(shí)間里，氨基酸態(tài)氮在0.008 g/100 mL 上下波動(dòng)，而且在第14 天出現(xiàn)了極大值，約0.0116 g/100 mL，在將近出酒時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量最高，約為0.0142 g/100 mL，是15 d發(fā)酵過(guò)程中的最大值。

2.1.2 原漿成品啤酒與市售啤酒氨基酸態(tài)氮含量比較（圖3）

圖3 原漿成品啤酒與市售啤酒氨基酸態(tài)氮含量比較

通過(guò)測(cè)定自釀原漿成品啤酒與3 種常見市售啤酒的氨基酸態(tài)氮的含量，發(fā)現(xiàn)原漿成品啤酒、純生和哈爾濱啤酒的氨基酸態(tài)氮含量幾乎相當(dāng)，而燕京啤酒的氨基酸態(tài)氮含量是測(cè)定啤酒中含量最高，約為0.0115 g/100 mL。啤酒蛋白質(zhì)或含氮物質(zhì)會(huì)很大程度地影響啤酒泡沫的質(zhì)量[16-17]。蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物中總有氨基酸和多肽，而多肽物質(zhì)的存在是形成懸浮物和沉淀物的前驅(qū)物質(zhì)。因此蛋白質(zhì)含量的多少直接影響到啤酒的質(zhì)量[18-19]。

2.2 總酸

2.2.1 自釀原漿啤酒發(fā)酵過(guò)程中pH 值和總酸值(圖4)

從圖4 可以得到，麥芽醪在發(fā)酵的第1 天pH 值最高，約為5.4，第2 天酸性增強(qiáng)約為3.5，第3 天pH值約為4.8，而在隨后的12 d 時(shí)間里，pH 值一直保持在4.2 左右，比較恒定。而測(cè)定的總酸變化規(guī)律，幾乎同pH 值變化一致，但第3 天的總酸值是整個(gè)發(fā)酵階段的最大值，約為1.68 mL/100 mL，遠(yuǎn)高于醪液中第2天酸性最強(qiáng)時(shí)的總酸。

2.2.2 原漿成品啤酒與市售啤酒pH 值與總酸的比較（圖5）

圖4 麥芽醪連續(xù)發(fā)酵15 d的pH值和總酸變化

圖5 原漿成品啤酒與市售啤酒pH值和總酸的比較

通過(guò)測(cè)定自釀原漿成品啤酒與3 種常見市售啤酒的pH 值和總酸，發(fā)現(xiàn)原漿成品啤酒的pH 值最大，約為4.2，而其他市售常見啤酒的pH 值十分接近，約3.75。但是測(cè)定總酸的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，與pH 值沒有相關(guān)性，原漿成品啤酒的最高，其次是燕京啤酒的總酸值，而純生和哈爾濱啤酒的總酸相當(dāng)，是所測(cè)啤酒中最低。

3 討論

氨基酸態(tài)氮指的是以氨基酸形式存在的氮元素的含量。氨基酸態(tài)氮是判定發(fā)酵產(chǎn)品發(fā)酵程度的特性指標(biāo)。從整個(gè)發(fā)酵過(guò)程來(lái)看，氨基酸態(tài)氮含量呈波動(dòng)性變化，但是在發(fā)酵的第3、第4 天和將近出酒的時(shí)候（14 d、15 d）含量最高，可能是在啤酒發(fā)酵初期，接種的啤酒酵母通過(guò)吸收麥汁中的含氮化合物，用于合成酵母菌細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸和其他含氮化合物，繁殖細(xì)胞?；畹钠【平湍钢荒芊置诤苌俚牡鞍酌福虼?，酵母菌只能從麥汁中吸收氨基酸、二肽、三肽等低肽氮化合物。故發(fā)酵前期（1 d、2 d）麥芽汁中的氨基酸態(tài)氮含量不高。啤酒酵母吸收氨基酸不是簡(jiǎn)單的濃度差擴(kuò)散作用，而是依賴于細(xì)胞壁分泌一系列的氨基酸輸送酶調(diào)節(jié)吸收，因此，發(fā)酵初期酵母必須合成一系列的氨基酸，由葡萄糖通過(guò)EMP 途徑形成酮酸，酮酸接受-NH2構(gòu)成早期不能合成的氨基酸，當(dāng)然也有些氨基酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶脫下-NH2，故麥芽醪當(dāng)中的氨基酸態(tài)氮呈波動(dòng)變化。麥芽醪中的氨基酸態(tài)氮還與啤酒生產(chǎn)工藝相關(guān)，比如麥芽醪煮沸中蛋白質(zhì)的分解，糖化過(guò)程中蛋白質(zhì)的分解，麥芽醪的溫度、pH 值會(huì)影響酶的活性，也會(huì)影響蛋白的分解，以及麥芽醪的濃度也會(huì)影響[20]。當(dāng)原漿啤酒發(fā)酵結(jié)束出酒的時(shí)候，我們發(fā)現(xiàn)其氨基酸態(tài)氮和常見市售啤酒的含量相當(dāng)，故我們整個(gè)發(fā)酵工藝就氨基酸態(tài)氮含量方面，幾乎符合市場(chǎng)要求。

啤酒中總酸的來(lái)源主要是麥芽等原料，糖化發(fā)酵的生化反應(yīng)和化學(xué)反應(yīng)、水及工藝調(diào)節(jié)外加酸[21]。從總酸測(cè)定圖可以看到，發(fā)酵前3 天的變化比較大，大約在1.08 mL/100 mL 到1.68 mL/100 mL 之間，隨后的12 d 內(nèi)，一直處于1.02 mL/100 mL 小幅度波動(dòng)，基本很穩(wěn)定。前期的總酸來(lái)源是麥芽的原始總酸和糖化反應(yīng)。

麥芽中的酶酸解，主要是植酸鈣鎂鹽（菲汀），在麥芽煮沸過(guò)程中被磷酸酯酶降解，生成酸性物質(zhì)[22-24]。還有甘油酸酶、淀粉磷酸酶和蛋白水解酶，以及糖類有氧呼吸過(guò)程的酸類物質(zhì)等，但可以看到，麥芽汁中的酸性物質(zhì)是磷酸性鹽組成的緩沖液，故在發(fā)酵的中后期，總酸含量趨近一個(gè)穩(wěn)定值。發(fā)酵過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生酸，比如：丙酮酸、α-酮戊二酸、乳酸、蘋果酸、琥珀酸、脂肪酸等。發(fā)酵后期，醪液中會(huì)通過(guò)丙酮酸進(jìn)行的歧化反應(yīng)，形成乙酸和乳酸。通過(guò)與常見市售啤酒中的總酸比較發(fā)現(xiàn)，自釀原漿成品啤酒中的總酸略高一點(diǎn)，可能與生產(chǎn)工藝或酵母菌有關(guān)，但仍然符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（小于2.6 mL/100 mL）。

無(wú)酸不成酒，啤酒的香味雖然不是來(lái)源于酸類物質(zhì)，但酸類物質(zhì)對(duì)啤酒的味道有很大的影響。啤酒中含有適量的可滴定總酸，能賦予啤酒以柔和清爽、愉快的口感，當(dāng)酸類物質(zhì)較少時(shí)，口感單一、較寡淡；但總酸過(guò)高(大于2.6 mL/100 mL)或嗅之有明顯的酸味(揮發(fā)性的乙酸等過(guò)高)的啤酒又是不被認(rèn)可的[25]。

啤酒中氮元素含量不能過(guò)高也不能過(guò)低。若過(guò)高時(shí)，會(huì)有強(qiáng)烈的濃醇感；過(guò)低時(shí)，不具備啤酒應(yīng)有的香味。只有在適合的范圍內(nèi)人們才能體驗(yàn)到啤酒獨(dú)特的清爽感，口腔中還會(huì)有綿延不絕的濕潤(rùn)感。