高效液相色譜法對(duì)白酒中的L-乳酸和D-乳酸的手性分離和測(cè)定

江 鋒，趙振宇，聶 葉，李清亮，劉 松，王和玉

（貴州茅臺(tái)酒股份有限公司，貴州仁懷 564501）

乳酸（Lactic acid）學(xué)名2-羥基丙酸，結(jié)構(gòu)式為CH3CHOHCOOH，相對(duì)分子質(zhì)量為90.08，由于分子內(nèi)含有一個(gè)不對(duì)稱碳原子，因此具有旋光異構(gòu)現(xiàn)象[1]，可區(qū)分為L(zhǎng)-乳酸和D-乳酸，當(dāng)兩者以等比例混合時(shí)，即成為內(nèi)消旋的DL-乳酸。

目前，分離和測(cè)定L-乳酸與D-乳酸手性對(duì)映體的方法主要包括酶法[2]、氣相色譜(GC)[3]、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)[4]、毛細(xì)管電泳(CE)[5]、液質(zhì)聯(lián)用(LCMS)[6]、手性高效液相色譜法(HPLC)[7]以及柱前衍生將手性對(duì)映體改變成非手性物質(zhì)再用HPLC 測(cè)定的方法[8]。不同的方法都有局限性，如酶法測(cè)定步驟多，酶易失活，測(cè)定誤差大；EDTA 定鈣法測(cè)量誤差大，對(duì)乳酸的兩種對(duì)映體無(wú)法精確定量，如果采用普通的有機(jī)酸色譜柱，是無(wú)法區(qū)分乳酸的兩種對(duì)映體的。

自然界中天然的乳酸是L-乳酸，D-乳酸主要通過(guò)合成產(chǎn)生。D-乳酸的合成方法可以分為化學(xué)合成法、酶法和微生物發(fā)酵法。乳酸是白酒中重要的有機(jī)酸，其含量的多少對(duì)白酒的口味和后味有較大影響，國(guó)內(nèi)暫無(wú)白酒中乳酸構(gòu)型的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，建立能快速、靈敏和高效拆分檢測(cè)白酒中兩種乳酸對(duì)映異構(gòu)體的方法非常必要。

本研究利用手性色譜柱中青霉胺與二價(jià)銅離子配位體，對(duì)乳酸的兩種對(duì)映體的絡(luò)合能力的不同[9]，將L-乳酸和D-乳酸進(jìn)行拆分并定量，研究了該法對(duì)于乳酸標(biāo)準(zhǔn)品和酒樣樣品的乳酸檢測(cè)重現(xiàn)性，還研究了在白酒中添加L-乳酸和D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品后的檢測(cè)回收率，最后用該法檢測(cè)了20 種市售白酒中的L-乳酸和D-乳酸含量。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：白酒，包括濃香型、醬香型、清香型等市售的白酒20種。

試劑：L-乳酸，色譜純，98%純度，Sigma-Aldrich 公司出品；D-乳酸，色譜純，93%純度，Sigma-Aldrich 公司出品；異丙醇，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心。

儀器設(shè)備：超高效液相色譜儀(Agilent 1260 Series)帶二極管陣列檢測(cè)器、手性柱Chirex 3126(D)-penicillami（4.6 mm i.d×250 mm L,5 μm）（美國(guó)菲羅門）、分析天平（METTLER TOLEDO XP205）、純水儀（艾科浦RM-220）；Talboys 數(shù)顯型多管式旋渦混合器（美國(guó)）；KQ-500DA 昆山超聲儀器（昆山舒美）；BLC-1玻璃砂芯過(guò)濾裝置，0.45 μm濾膜（安捷倫，再生纖維素濾膜）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

取1 mL 酒樣置于10 mL 離心管中，加入4 mL超純水，旋渦振蕩混勻，經(jīng)水系0.22 μ m 的微孔濾膜過(guò)濾后用于液相色譜測(cè)定。

1.2.2 色譜條件

流動(dòng)相：2 mmol/L 的5%異丙醇流動(dòng)相溶液配制，稱取CuSO4·5H2O 0.500 g，加入50 mL雙蒸水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL 的容量瓶中，加入50 mL 的色譜純異丙醇，再用雙蒸水定容至1000 mL，用0.45 μ m孔徑的合成纖維素濾膜進(jìn)行真空超濾，超聲波脫氣；流動(dòng)相流速為1 mL/min；柱溫30 ℃；二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液用前均經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾；進(jìn)樣量為5 μL。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別準(zhǔn)確稱取一定量的L-乳酸、D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水溶解并定容于100 mL 容量瓶中，配成L-乳酸、D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)液，然后進(jìn)行稀釋，分別配成0.020mg/mL、0.050mg/mL、0.100mg/mL、0.200mg/mL、0.400 mg/mL、0.600 mg/mL、0.800 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。上機(jī)前經(jīng)0.22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾。

1.2.4 定性與定量

將相同色譜條件下的樣品色譜圖與乳酸標(biāo)準(zhǔn)液色譜圖進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)保留時(shí)間確定樣品中的L-乳酸、D-乳酸。用外標(biāo)法定量，計(jì)算出樣品中L-乳酸和D-乳酸的含量。

1.2.5 精密度試驗(yàn)

取一定濃度的L-乳酸、D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，觀察L-乳酸和D-乳酸的保留時(shí)間及峰面積，計(jì)算RSD值。

1.2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一個(gè)酒樣6 份，觀察保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算保留時(shí)間和峰面積的RSD值。

1.2.7 回收率試驗(yàn)

分別向已知L-乳酸、D-乳酸濃度的酒樣中加入3 種濃度的L-乳酸、D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取5 μL注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣3 次，觀察保留時(shí)間和分析含量，計(jì)算保留時(shí)間的RSD 值和含量的回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 手性柱HPLC 法對(duì)乳酸標(biāo)準(zhǔn)品與白酒中乳酸的手性拆分和檢測(cè)

乳酸2種對(duì)映體手性拆分HPLC圖譜見圖1。

圖1 乳酸2種對(duì)映體手性拆分HPLC圖譜

由圖1可知，乳酸對(duì)映體L-乳酸的出峰時(shí)間約為13.0 min，D-乳酸的出峰時(shí)間約為16.0 min，根據(jù)乳酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和峰面積，得L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=2.05X+0.673，回歸系數(shù)R2=0.999；D-乳酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1.633X+0.86，回歸系數(shù)R2=0.999。式中X 為乳酸濃度（g/L），Y 為乳酸的峰面積。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和圖1 的出峰時(shí)間與峰面積，可計(jì)算L-乳酸和D-乳酸的含量，可知該白酒酒樣中以D-乳酸為主，D-乳酸的含量占乳酸總量的86%以上。本研究利用手性柱Chirex 3126 檢測(cè)L-乳酸和D-乳酸，Chirex 3126 是一種配體交換柱，以固相化與過(guò)渡金屬離子（Cu2+）配位的配體為固定相，基于流動(dòng)相中的配體與固定相的配體間交換平衡以及穩(wěn)定性來(lái)分離L-乳酸和D-乳酸[9]。

2.2 精密度試驗(yàn)

對(duì)待測(cè)L-乳酸、D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品平行測(cè)定6 次，結(jié)果表明精密度滿足分析要求，其結(jié)果見表1。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取酒樣1樣品，連續(xù)取6份，測(cè)定L-乳酸、D-乳酸的含量，其結(jié)果見表2。

2.4 回收率試驗(yàn)

為了考察測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，進(jìn)行了回收率的測(cè)定，結(jié)果見表3?？梢钥闯?，L-乳酸的回收率分別為98.47%、100.75%、100.71%，RSD 分別為0.13%、0.59%、0.75%；D-乳酸的回收率分別為107.88%、105.65%、100.1%，RSD 分別為0、0.75%、1.17%?；厥章试?8.47%～107.88%之間，RSD小于2%，說(shuō)明該方法測(cè)定結(jié)果比較可靠。

表1 精密度試驗(yàn)

表2 重復(fù)性試驗(yàn)

表3 回收率試驗(yàn)

2.5 最低檢出限的測(cè)定

用L-乳酸、D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行逐步稀釋后，進(jìn)行HPLC 分析，以3 倍信噪比計(jì)算最低檢出限為5 mg/L。

2.6 利用手性柱HPLC 法檢測(cè)白酒產(chǎn)品中L-乳酸和D-乳酸的含量

利用手性柱HPLC 方法測(cè)得白酒樣品JY1—JY20 中L-乳酸和D-乳酸含量，酒樣包括濃香型、醬香型、清香型等市售的白酒。白酒中L-乳酸和D-乳酸的含量見表4。

結(jié)果表明，大部分酒樣里D-乳酸明顯高于L-乳酸，只有JY10、JY13、JY16 的L-乳酸與D-乳酸含量相近。

3 結(jié)論

采用高效液相法和手性柱可以將白酒中的L-乳酸和D-乳酸分開，L-乳酸和D-乳酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.020～0.800 g/L 范圍線性良好，兩者的線性相關(guān)系數(shù)都為0.999。白酒中L-乳酸和D-乳酸的回收率分別是98.47%～100.75%和100.10%～107.88%。該方法操作簡(jiǎn)便，精密度和準(zhǔn)確度高，適用于白酒中L-乳酸和D-乳酸的測(cè)定。

表4 20種市售白酒的L-乳酸和D-乳酸含量