體外模擬消化過(guò)程中果膠對(duì)竹葉黃酮生物可及性的影響

李占明，俞 玥，梁 奕，田 磊，戴 煌，徐 磊，周冬仁,*，毛 豪

（1.江蘇科技大學(xué)糧食學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212004；2.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108；3.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；4.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江 湖州 313001）

膳食天然抗氧化劑如植物黃酮類化合物可以有效緩解氧化應(yīng)激，抑制多種疾病的發(fā)生及發(fā)展，提高人體健康水平[1]。開(kāi)展天然植物抗氧化劑的相關(guān)研究具有良好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，并有助于擴(kuò)充植物功能成分的相關(guān)營(yíng)養(yǎng)學(xué)知識(shí)[2-3]。然而，由于黃酮化合物的生物可及性較低，限制了其生物活性的發(fā)揮[4]。黃酮類化合物的低穩(wěn)定性和非靶向釋放也與黃酮化合物活性的降低有關(guān)[5]。因此，提高植物黃酮類化合物在胃腸消化過(guò)程中的生物可及性是提高其健康效益的關(guān)鍵[6]。

在胃腸道消化中，不同消化階段的pH值變化較大，減弱胃腸道消化過(guò)程中的竹葉黃酮降解對(duì)提高生物可及性具有重要意義[7-8]。含有黃酮類化合物的食物到達(dá)小腸，然后進(jìn)入血液。一般來(lái)說(shuō)，同時(shí)食用含有其他食物基質(zhì)和黃酮類化合物的食物有助于提高黃酮化合物的生物可及性，抵消體內(nèi)不同消化階段pH值的變化對(duì)黃酮化合物的降解[9]。研究發(fā)現(xiàn)，食品中的淀粉和纖維素產(chǎn)生的物理空隙限制了消化液和黃酮混合過(guò)程，有效降低了黃酮類化合物的降解，有助于更多的黃酮化合物到達(dá)腸壁，進(jìn)而被吸收或者代謝[10-12]。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，水溶性的膳食纖維素黃原膠有助于提高模擬消化過(guò)程中4 種竹葉黃酮的生物可及性[13]。然而，果膠對(duì)黃酮類化合物保護(hù)作用的相關(guān)研究鮮見(jiàn)報(bào)道，需要進(jìn)一步深入探索。

體外模擬胃腸消化模型因可提供篩選食物成分的機(jī)會(huì)、研究期限短、研究成本低，并可以避免使用動(dòng)物模型而引起的倫理問(wèn)題，從而得到了廣泛的關(guān)注[14-16]?，F(xiàn)有研究表明，體外胃腸消化模型已被廣泛應(yīng)用于食品或藥品的模擬消化過(guò)程，并應(yīng)用于分析不同處理對(duì)目標(biāo)化合物的活性影響和活性分子生物可及性的相關(guān)研究中[17-18]。

近年來(lái)，竹葉黃酮化合物因具有抗氧化、抗炎、抗心血管疾病等良好的生物活性而受到廣泛關(guān)注[19]。據(jù)報(bào)道，提取自竹葉中的竹葉黃酮類化合物的特征性成分為葒草苷、異葒草苷、牡荊素和異牡荊素[20-21]，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 4 種竹葉黃酮的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structures of isoorientin, orientin, isovitexin and vitexin from bamboo leaves

目前相關(guān)研究主要集中在黃酮類化合物的抗氧化活性等方面[22-23]。然而，鮮有研究闡明胃腸道消化過(guò)程對(duì)竹葉黃酮生物可及性的影響[13]，而良好的生物可及性是竹葉黃酮發(fā)揮其生物活性的基礎(chǔ)。前期研究發(fā)現(xiàn)，在模擬腸道消化時(shí)，添加果膠可顯著提升竹葉提取物中竹葉黃酮的生物可及性。因此，本研究采用體外模擬胃腸消化模型測(cè)定竹葉黃酮化合物的生物可及性，結(jié)合超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）儀分析闡明果膠對(duì)竹葉黃酮提取物中4 種特征性成分體外模擬胃腸消化過(guò)程中的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)中，采用主成分分析和聚類分析相結(jié)合的方法，研究了4 種黃酮類化合物在體外模擬胃腸消化過(guò)程中的變化，相關(guān)研究有助于闡明體外消化過(guò)程中竹葉黃酮生物可及性的變化，對(duì)竹葉黃酮類功能食品的開(kāi)發(fā)具有良好的促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

竹葉 浙江圣氏生物有限公司；果膠、福林-酚試劑、α-淀粉酶 美國(guó)西格瑪奧德里奇試劑公司；胃蛋白酶、胰酶、膽酸鈉 上海阿拉丁生化試劑公司；葒草苷、異葒草苷、牡荊素、異牡荊素等化合物的標(biāo)準(zhǔn)品由實(shí)驗(yàn)室自行制備（純度＞97%）。其他試劑為分析純或色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

Bioteck離心機(jī)、多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；ACQUITY UPLC柱分析系統(tǒng) 美國(guó)沃特世科技公司；漩渦混勻儀 德國(guó)IKA公司；機(jī)械攪拌器 上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；掃描電子顯微鏡 德國(guó)卡爾蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

樣品制備參照文獻(xiàn)[13]并略作修改，簡(jiǎn)述如下：采用實(shí)驗(yàn)室用小型磨粉機(jī)磨碎竹葉（Pleioblastus kongosanensis f. aureostriatus）樣品后，按照料液比1∶10（m/m）加入蒸餾水后，進(jìn)行機(jī)械攪拌，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，提取竹葉黃酮。提取所得的混合物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后進(jìn)行冷凍干燥，收集固體粉末（竹葉黃酮提取物）用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。添加果膠組樣品制備過(guò)程如下：竹葉黃酮提取物經(jīng)水溶解后，與制備好的果膠溶液混合（竹葉黃酮提取物終質(zhì)量濃度10 mg/mL、果膠終濃度質(zhì)量濃度8 mg/mL），漩渦混勻后4 ℃避光過(guò)夜。以直接消化組的樣品（不添加果膠，竹葉黃酮提取物終質(zhì)量濃度10 mg/mL）作為對(duì)照。測(cè)定竹葉黃酮提取物總酚、總黃酮含量。

1.3.2 總酚含量測(cè)定

采用福林-酚法測(cè)定竹葉黃酮提取物的總酚含量[24]。將不同體積（0、30、60、90、120、150 μL）的0.1 mg/mL沒(méi)食子酸工作溶液加入離心管后，加入40 μL福林-酚試劑，再加入100 μL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%碳酸鈉溶液。用去離子水將反應(yīng)體系定容至1 mL，反應(yīng)90 min后，采用酶標(biāo)儀在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總酚含量，結(jié)果以每克干物質(zhì)中沒(méi)食子酸質(zhì)量表示，單位為mg/g。

1.3.3 總黃酮含量測(cè)定

總黃酮含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)[25]的方法，以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，結(jié)果以每克干物質(zhì)中兒茶素質(zhì)量表示，單位為mg/g。

1.3.4 體外消化模型的建立

體外模擬胃腸道消化參考González-Montoya等[26]的方法并略作修改。取18 mL竹葉黃酮提取物溶液（含果膠或不含果膠），加入2 mL α-淀粉酶，以形成模擬口腔消化液（pH 7.0），漩渦后37 ℃孵育10 min后，用鹽酸溶液（1 mol/L）調(diào)整pH值到2.0±0.1，同時(shí)取4 個(gè)樣（每個(gè)樣體積為400 μL）作為口腔消化后的樣品（記為A10），將收集好的A10樣品的pH值調(diào)整到7.0±0.1后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。然后，取1 mL的胃蛋白酶（10 mg/mL）加入到取樣后剩余的A10樣品溶液中，37 ℃孵育 90 min，再將溶液的pH值調(diào)整到7.0±0.1后進(jìn)行取樣，得到模擬胃消化后的樣品B90（取4 個(gè)樣，每個(gè)400 μL）。在取樣后剩余的B90樣品中加入2.5 mL的胰酶（8 mg/mL）和2.5 mL膽酸鹽溶液（50 mg/mL）中形成模擬腸道消化液，37 ℃孵育 90 min后，在95 ℃水浴加熱10 min終止反應(yīng)，得到模擬腸道消化后的樣品C90（取樣4 個(gè)，每個(gè)400 μL）。取樣結(jié)束后，所有樣品經(jīng)冷凍干燥，干燥后的粉末貯藏在-20 ℃以備后續(xù)分析。

經(jīng)體外模擬消化的3 個(gè)階段（口腔、胃、腸）后，直接消化組的樣品分別記為dA10、dB90、dC90，添加果膠后消化的樣品記為pA10、pB90、pC90，原始樣品未經(jīng)體外模擬消化處理的樣品記為O。

1.3.5 竹葉黃酮質(zhì)量濃度和生物可及性的測(cè)定

采用UPLC測(cè)定10 mg/mL竹葉黃酮提取物消化前后及果膠添加組消化后的竹葉黃酮（異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、牡荊素）質(zhì)量濃度。將不同消化階段的樣品溶解在1 mL甲醇中，漩渦充分混勻，然后8 000×g離心15 min，取上清液1 μL進(jìn)行UPLC分析。UPLC分析采用ACQUITY UPLC BEH C8色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相A（乙腈）、流動(dòng)相B（體積分?jǐn)?shù)0.1%磷酸溶液）的體積比為82∶18，流速為0.21 mL/min。依據(jù)340 nm波長(zhǎng)處的吸光度，經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶液中4 種竹葉黃酮的質(zhì)量濃度，并計(jì)算其生物可及性，生物可及性是模擬消化后樣品中的竹葉黃酮質(zhì)量濃度與原始樣品中竹葉黃酮質(zhì)量濃度的比值[27]。

1.3.6 掃描電子顯微鏡觀察

為了考察添加果膠的效果，將8 mg/mL果膠溶液、10 mg/mL竹葉黃酮提取物溶液、果膠和竹葉黃酮提取物終質(zhì)量濃度分別為8、10 mg/mL的混合溶液按照掃描電子顯微鏡樣品測(cè)試要求制備樣品后，觀察其顆粒形貌。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用主成分分析和聚類分析研究不同處理樣品中4 種竹葉黃酮質(zhì)量濃度的聚類趨勢(shì)，數(shù)據(jù)差異采用SPSS 19.0軟件的單因素方差分析方法進(jìn)行比較，P＜0.05時(shí)表示差異顯著，采用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚含量及UPLC定量結(jié)果

未經(jīng)消化的竹葉黃酮提取物中總酚含量為（78.834±1.287）mg/g，總黃酮含量為（79.932±2.076）mg/g。4 種竹葉黃酮的UPLC如圖2所示，未經(jīng)消化的10 mg/L竹葉黃酮提取物溶液中異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、牡荊素的質(zhì)量濃度分別為239.251、67.052、58.123、27.04 mg/L。

圖2 4 種竹葉黃酮的UPLC譜圖Fig. 2 UPLC profile of four bamboo flavonoids

2.2 體外模擬消化中各階段不同樣品組的黃酮質(zhì)量濃度

圖3 不同體外模擬消化階段各樣品中4 種竹葉黃酮的質(zhì)量濃度Fig. 3 Concentrations of bamboo leaf flavonoids at different simulated in vitro digestion stages

在各階段不同樣品中的4 種竹葉黃酮化合物中，異葒草苷質(zhì)量濃度最高，其次為葒草苷、異牡荊素、牡荊素。與直接消化樣品和添加果膠的樣品相比，原始樣品中竹葉黃酮的質(zhì)量濃度最高。如圖3所示，與直接消化樣品相比，在3 個(gè)階段消化過(guò)程中，添加果膠均顯著抑制了4 種竹葉黃酮質(zhì)量濃度的降低（P＜0.05）。經(jīng)口腔消化后，與直接消化組相比，添加果膠組的異葒草苷質(zhì)量濃度顯著提高（從150.4 mg/L提高到207.8 mg/L），葒草苷、異牡荊素和牡荊素的質(zhì)量濃度分別提高了17.7%、41.4%和35.1%（圖3A）。胃模擬消化添加果膠樣品后，與直接消化樣品相比，異葒草苷、葒草苷、異牡荊素、牡荊素質(zhì)量濃度分別增加25.1%、32.2%、40.9%、56.7%（圖3B）。與直接消化相比，添加果膠可提高腸模擬消化后4 種竹葉黃酮的質(zhì)量濃度（圖3C）。

2.3 不同處理后竹葉黃酮質(zhì)量濃度變化的線性關(guān)系

圖4 4 種竹葉黃酮質(zhì)量濃度變化的線性關(guān)系Fig. 4 Linear relationships between contents of four bamboo leaf flavonoids

為了評(píng)價(jià)果膠的保護(hù)性能，采用多元分析方法揭示不同處理模擬消化階段4 種竹葉黃酮質(zhì)量濃度之進(jìn)行線性擬合，結(jié)果如圖4所示。4 次重復(fù)的7 種樣品（原始樣品+3 個(gè)階段直接消化組樣品+3 個(gè)階段果膠添加組樣品）的不同竹葉黃酮質(zhì)量濃度之間存在良好的線性關(guān)系。并且，線性相關(guān)性可能與不同竹葉黃酮的結(jié)構(gòu)相似性有關(guān)聯(lián)[27-28]。

2.4 腸道消化后4 種竹葉黃酮的生物可及性及熱圖分析結(jié)果

為了進(jìn)一步揭示果膠的保護(hù)作用，分別對(duì)直接消化和添加果膠的兩組樣品中4 種竹葉黃酮在腸道消化后的生物可及性進(jìn)行研究，結(jié)果如表1所示。添加果膠的樣品與直接消化樣品相比，4 種竹葉黃酮經(jīng)腸道消化后的生物可及性顯著提高，其中異牡荊素和牡荊素的生物可及性分別提高了75.1%和80.2%。比較發(fā)現(xiàn)，相較于葒草苷和異葒草苷，果膠對(duì)異牡荊素和牡荊素的生物可及性提升更為明顯。生物可及性的差異可能是黃酮分子結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致的[29]。研究表明，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物可及性與其結(jié)構(gòu)存在相關(guān)性[28]。含植物多酚及纖維素的食物基質(zhì)中，植物多酚與纖維之間的相互作用能改變多酚經(jīng)胃腸道消化后的釋放與吸收效率[27]。果膠的添加顯著提高了4 種竹葉黃酮的生物可及性（P＜0.05），使其能夠更多地到達(dá)腸壁進(jìn)而進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，從而更好地發(fā)揮其生物活性。本研究中，果膠對(duì)提升腸道異牡荊素和牡荊素的生物可及性的效果顯著優(yōu)于異葒草苷和葒草苷。異牡荊素和牡荊素互為同分異構(gòu)體，葒草苷和異葒草苷互為同分異構(gòu)體，這表明竹葉黃酮結(jié)構(gòu)和生物可及性之間的關(guān)聯(lián)性。

表1 模擬腸道消化后4 種竹葉黃酮的生物可及性Table 1 Bioaccessibility of four bamboo leaf flavonoids after stimulated intestinal digestion in the presence and absence of pectin

熱圖分析（圖5）結(jié)果也表明了異牡荊素和牡荊素在同樣處理時(shí)其質(zhì)量濃度變化接近，而葒草苷和異葒草苷的質(zhì)量濃度變化接近，兩對(duì)同分異構(gòu)體展示了不同的聚類趨勢(shì)。Kermani等[30]的研究也表明，不同的聚類趨勢(shì)可能由竹葉黃酮的結(jié)構(gòu)差異引起。

圖5 4 種竹葉黃酮的熱圖分析Fig. 5 Heatmap analysis of the concentrations of four bamboo leaf flavonoids at different digestion stages

2.5 主成分分析和聚類分析結(jié)果

圖6 不同處理后樣品中竹葉黃酮質(zhì)量濃度的主成分分析（A）及聚類分析（B）Fig. 6 Principal components analysis plot (A) and cluster analysis plot (B)for the concentrations of four bamboo leaf flavonoids at different digestion stages in the presence and absence of pectin

采用主成分分析法對(duì)果膠原始樣品、直接消化組樣品和果膠添加組樣品在消化過(guò)程中4 種竹葉黃酮的質(zhì)量濃度進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6A所示，前兩個(gè)主成分可以累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到99.41%，可以表征原始數(shù)據(jù)變化的大部分特征信息。不同組別的樣品分布在不同區(qū)域，原始樣品聚為一類，直接消化組聚為一類，果膠添加組聚為一類，說(shuō)明主成分分析可以很好地反映樣品處理的分類信息。此外，同一組組內(nèi)樣品的分布不同，揭示了不同消化階段產(chǎn)生的效果不同。與直接消化組樣品相比，果膠添加樣品和原始樣品的分布區(qū)域更接近，存在聚類趨勢(shì)。此外，在添加果膠的3 個(gè)階段的樣品中，pA10樣品與原始樣品較接近，其次是pB90樣品，證實(shí)了同一組內(nèi)樣品經(jīng)不同的消化階段處理后存在不同的聚類趨勢(shì)。

對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析（圖6B），當(dāng)歐氏距離平方為1.5時(shí)，pA10樣本與原始樣本趨于聚類。當(dāng)歐氏距離平方為1.2時(shí)，dA10、dB90和pB90趨于聚類。當(dāng)歐氏距離平方為0.8時(shí)，dC90和pC90樣本趨于聚類。聚類趨勢(shì)分析結(jié)果也能表明，模擬腸道消化對(duì)竹葉黃酮質(zhì)量濃度的影響大于口腔和胃消化的影響，果膠的加入能提升不同模擬消化階段中竹葉黃酮的質(zhì)量濃度及其生物可及性。

2.6 黃酮生物可及性變化的機(jī)制

圖7 果膠分子提升竹葉黃酮分子生物可及性示意圖（A）和不同樣品的掃描電子顯微鏡圖（B）Fig. 7 Schematic diagram illustrating the protective effect of pectin on bamboo leaf flavonoids (A) and corresponding scanning electron microscope images (B)

果膠是一種膳食纖維，包括膠凝（光滑區(qū)域）和非膠凝（粗糙區(qū)域）兩部分，果膠分子的連續(xù)半乳糖酸鹽單位形成兩個(gè)鏈之間穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)[31]。半乳糖醛酸和（或）羥基之間的氫鍵有助于鏈締合[32]。因此，果膠復(fù)合物可以成功用于開(kāi)發(fā)親水生物活性分子的遞送體系[33]。Chen Hua[34]、Jo[35]等研究認(rèn)為，纖維或淀粉的空腔結(jié)構(gòu)可以用來(lái)容納生物活性分子以抑制消化處理造成的活性分子的分解。黃酮分子通過(guò)作用于細(xì)胞內(nèi)的受體蛋白，發(fā)揮抗炎抗氧化應(yīng)激等生物活性，這種相互作用多通過(guò)氫鍵、范德華力、疏水作用力等交聯(lián)，其中氫鍵起著重要作用[36]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已有研究[31-33]和不同溶液掃描電子顯微鏡圖（圖7B）推斷得到，在果膠溶液中添加竹葉黃酮提取物后，竹葉黃酮可以通過(guò)氫鍵及樹(shù)枝空間與果膠分子結(jié)合（圖7A），進(jìn)而果膠顆粒發(fā)揮其對(duì)黃酮分子的保護(hù)作用[29,37]。果膠的添加有助于增加竹葉黃酮在消化過(guò)程中的穩(wěn)定性，從而降低竹葉黃酮在消化液中的消化，提升竹葉黃酮在體外模擬消化過(guò)程中的生物可及性，使到達(dá)腸壁的竹葉黃酮量增加，進(jìn)而進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，得以發(fā)揮其生物功效。

3 結(jié) 論

通過(guò)體外模擬口腔、胃、腸消化并結(jié)合UPLC分析，探究果膠對(duì)竹葉提取物中竹葉黃酮化合物的保護(hù)作用。結(jié)果表明，果膠提升了竹葉黃酮在體外模擬消化過(guò)程中的生物可及性，其中，使腸道消化后異牡荊素和牡荊素生物可及性提高了75.1%和80.2%。采用主成分分析和聚類分析的方法對(duì)不同處理的聚類趨勢(shì)進(jìn)行了闡述，證實(shí)果膠的加入對(duì)竹葉黃酮分子生物可及性有顯著提升。綜上所述，果膠對(duì)竹葉黃酮的生物可及性具有增強(qiáng)作用，本研究對(duì)于相關(guān)功能性產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)具有良好的理論及應(yīng)用價(jià)值。