堿法提取普洱茶渣膳食纖維的工藝優(yōu)化

孟圓，夏婷*，程艷，耿貝貝，權(quán)冰艷，2，宋睿喆，于金浩，王敏，白曉麗

（1. 天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津 300457；2. 天士力醫(yī)藥集團股份有限公司 創(chuàng)新中藥關(guān)鍵技術(shù)國家重點實驗室，天津 300410）

茶起源于我國，已有千年發(fā)展歷史，并成為風(fēng)靡世界的三大無酒精飲料之一[1-2]。近年來，我國茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，種植面積不斷擴大，產(chǎn)量急劇增長，2021 年茶園面積達326 億m2，茶葉產(chǎn)量達306 萬t[3]。普洱茶屬于黑茶，是以云南大葉種曬青茶為原料，經(jīng)發(fā)酵制成，具有獨特品質(zhì)特征。普洱茶中含有多種營養(yǎng)成分，膳食纖維含量9%～22%，蛋白質(zhì)含量20%～30%，此外還含有茶褐素、茶多酚和茶多糖等活性成分[4]。據(jù)報道，約90%的茶葉在加工和消費后成為茶渣，這些茶渣通常被直接丟棄，會造成環(huán)境污染，此外，茶渣也通常作為燃料、肥料、生物吸附劑直接使用[5-6]。目前茶渣中營養(yǎng)物質(zhì)的有效利用仍不足，因此，對普洱茶廢棄物的高值化利用具有重要的科學(xué)意義。

膳食纖維是一種不被人體消化酶所消化，也不被小腸吸收的以多糖為主體的高分子物質(zhì)的總稱[7]。膳食纖維被稱為人類第七大營養(yǎng)素，按照溶解性可分為水溶性膳食纖維和水不溶性膳食纖維。其中水不溶性膳食纖維具有良好的吸水性和膨脹性，能調(diào)節(jié)腸道功能，防止便秘，同時對心血管疾病、糖尿病、結(jié)腸癌等具有預(yù)防作用[8]。近年來多項研究顯示化學(xué)法、物理法、酶法和發(fā)酵法是膳食纖維的主要提取方法[9]。其中化學(xué)法中的堿法是膳食纖維提取的常用方法。丁莎莎[10]采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的NaOH 溶液提取油橄欖果渣膳食纖維，結(jié)果得到產(chǎn)率為52.39%的油橄欖果渣不溶性膳食纖維。Wang 等[11]發(fā)現(xiàn)采用5%的NaOH 提取得到的獼猴桃膳食纖維含量相較于酶法、酸法更高，并且提取后膳食纖維表現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性。Karra 等[12]發(fā)現(xiàn)堿法提取的椰棗花膳食纖維含量為89.75%，比水提取的椰棗花膳食纖維含量高，并且蛋白質(zhì)和脂質(zhì)含量較水提法明顯降低。因而，采用堿法能更有效地提高膳食纖維提取率，更好地去除植物中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)雜質(zhì)。

本研究擬以普洱茶渣為原料，采用堿法提取普洱茶渣中的膳食纖維（tea dietary fiber，TDF），通過Box-Behnken 試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析，獲得最佳提取工藝條件。并對提取前后的普洱茶渣中TDF 的含量及組成進行分析，以期提高普洱茶渣的綜合利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶渣：云南天士力帝泊洱生物茶集團有限公司；氫氧化鈉：天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；鹽酸：福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；95%乙醇：康科德科技有限公司；硫酸：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；十氫化萘、雙氧水：天津市大茂化學(xué)試劑廠；無水亞硫酸鈉：天津渤化化學(xué)試劑有限公司；丙酮：洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司；十六烷基三甲基溴化銨：廣東翁江化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

火焰原子吸收光譜儀（GGX-100）：北京海光儀器有限公司；紫外分光光度計（U-3900）：日立株式會社；鼓風(fēng)干燥箱（UF160）：美墨爾特（上海）貿(mào)易有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（WGLL-125BE）：天津市泰斯特儀器有限公司；快速水分測定儀（MA37-1CN）：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S）：鄧州長城科工貿(mào)有限公司；馬弗爐（SX2-2.5-10）：天津市中環(huán)實驗電爐有限公司；粗脂肪測定儀（SZF-06A）：上海新嘉電子有限公司；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DB）：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 茶膳食纖維堿法提取工藝

稱取15 g 茶渣，按料液比1∶25（g/mL）加入1.40%的NaOH 溶液，攪拌至分散均勻，再進行超聲輔助提取1 h，提取完畢后，水洗滌提取后的樣品，直至濾液為中性，過濾，濾渣在105 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥，備用。

1.3.2 單因素試驗

1）在固定堿解溫度60 ℃、堿解時間1 h、料液比1∶10（g/mL）的條件下，考察堿液濃度（1%、2%、3%、4%、5%）對TDF 提取率的影響。

2）在固定堿液濃度2%、堿解時間1 h、料液比1∶10（g/mL）的條件下，考察堿解溫度（60、70、80、90、100 ℃）對TDF 提取率的影響。

3）在固定堿液濃度2%、堿解溫度60 ℃、料液比1∶10（g/mL）的條件下，考察堿解時間（1、2、3、4、5 h）對TDF 提取率的影響。

4）在固定堿液濃度2%、堿解溫度60 ℃、堿解時間1 h 的條件下，考察料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）]對TDF 提取率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面試驗

基于單因素試驗結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken 中心組合試驗設(shè)計原理，以堿液濃度（A）、堿解溫度（B）、堿解時間（C）、料液比（D）為自變量，以TDF 提取率為響應(yīng)值，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法求取優(yōu)化的工藝參數(shù)，試驗因素及水平如表1 所示。

表1 Box-Behnken 設(shè)計試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3.4 茶渣基本成分測定

1.3.4.1 總膳食纖維含量測定

參照GB 5009.88—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中膳食纖維的測定》測定總膳食纖維含量。

1.3.4.2 纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量測定

參考Escarnot 等[13]的方法稍作修改，測定纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量，具體操作方法如下。

中性洗滌纖維測定：準(zhǔn)確稱取1.00 g（M1）樣品，添加100 mL 中性洗滌劑、數(shù)滴十氫化萘及0.5 g 無水亞硫酸鈉，煮沸1 h，在已知質(zhì)量的坩堝（M2）中用沸水和丙酮洗滌殘渣。將殘渣在105 ℃烘箱干燥過夜，冷卻至室溫后，稱量恒重（M3）。

酸性洗滌纖維測定：準(zhǔn)確稱取1.00 g（M4）樣品與酸性洗滌液（2%十六烷三甲基溴化銨）煮沸1 h，在已知質(zhì)量的坩堝（M5）中用蒸餾水和丙酮清洗殘渣，將清洗后的殘渣放置在105 ℃烘箱中干燥過夜，冷卻至室溫后，稱量恒重（M6）。

纖維素含量測定：向酸性洗滌過程中剩余的殘渣中添加72%的硫酸進行消化3 h，消化完畢后用熱蒸餾水清洗殘渣，殘渣再次在105 ℃烘箱干燥過夜，冷卻至室溫后，稱量恒重（M7）。

木質(zhì)素含量測定：將纖維素測定剩余的殘渣置于馬弗爐中550 ℃煅燒3 h 灰化，稱量恒重（M8）。

中性洗滌纖維含量（Y1，%）按下列公式計算。

式中：M1為中性洗滌時試樣的質(zhì)量，g；M2為坩堝的質(zhì)量，g；M3為坩堝和中性洗滌剩余殘渣的質(zhì)量，g。

酸性洗滌纖維含量（Y2，%）按下列公式計算。

式中：M4為酸性洗滌時試樣的質(zhì)量，g；M5為坩堝的質(zhì)量，g；M6為坩堝和酸性洗滌后剩余殘渣的質(zhì)量，g。

纖維素含量（Y3，%）按下列公式計算。

式中：M7為經(jīng)72%硫酸處理后的殘渣的質(zhì)量，g。

木質(zhì)素含量（Y4，%）按下列公式計算。

式中：M8為經(jīng)72%硫酸處理后的殘渣灰化后的質(zhì)量，g。

半纖維素含量（Y5，%）按下列公式計算。

1.3.4.3 果膠含量測定

參考Blumenkrantz 等[14]的方法測定果膠含量。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析處理

所有試驗均重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 25.0 對試驗數(shù)據(jù)進行ANOVA 方差分析和Tukey 顯著性檢驗。P＜0.05 表示組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶膳食纖維提取單因素試驗分析

2.1.1 堿液濃度對TDF 提取率的影響

堿液濃度對TDF 提取率的影響見圖1。

圖1 堿液濃度對TDF 提取率的影響Fig.1 Effect of alkali concentration on the yield of TDF

如圖1 所示，隨著堿液濃度的提高，TDF 提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)堿液濃度到達4%時TDF提取率達到最高，堿液濃度為5%時TDF 提取率下降。在TDF 提取工藝中，NaOH 主要發(fā)揮水解茶渣中蛋白質(zhì)，皂化脂質(zhì)和去除其他水溶性雜質(zhì)的作用[15]。堿液濃度過高會使部分纖維水解[16]，因此，這可能是堿液濃度為5%時TDF 提取率下降的原因。此外，堿液濃度過高會增加工業(yè)生產(chǎn)成本和對設(shè)備的腐蝕性[17]。因此，選擇TDF 提取的堿液濃度為3%～5%，進行下一階段的響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.1.2 堿解溫度對TDF 提取率的影響

堿解溫度對TDF 提取率的影響見圖2。

圖2 堿解溫度對TDF 提取率的影響Fig.2 Effect of alkaline extraction temperature on the yield of TDF

如圖2 所示，隨堿解溫度的升高，TDF 提取率呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)溫度升至90 ℃后，TDF 提取率趨于穩(wěn)定，沒有明顯變化?？赡苁菧囟壬邥龠M原料中蛋白質(zhì)的溶脹、降解和脫離[18]。李镕基等[19]發(fā)現(xiàn)隨著堿浸溫度的升高，蛋白質(zhì)含量逐漸下降，當(dāng)溫度升至90 ℃時TDF 提取率達到最高。He 等[20]發(fā)現(xiàn)在高濃度堿液和高溫下能更徹底地去除淡竹葉中的雜質(zhì)，得到更高純度的淡竹葉纖維。因此，綜合經(jīng)濟成本、環(huán)境等因素考慮，選擇堿解溫度為80～100 ℃進行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.1.3 堿解時間對TDF 提取率的影響

堿解時間對TDF 提取率的影響見圖3。

圖3 堿解時間對TDF 提取率的影響Fig.3 Effect of alkaline extraction time on the yield of TDF

如圖3 所示，隨著堿解時間的延長，TDF 提取率逐漸上升，當(dāng)堿解時間達到3 h 時，TDF 提取率達到最高，之后隨著堿解時間的延長，TDF 提取率呈現(xiàn)下降趨勢。堿解時間過長會導(dǎo)致部分纖維素和半纖維素發(fā)生水解[21]，這是茶渣中TDF 提取率在3 h 后下降的原因。堿解時間延長能增加雜質(zhì)的溶出率，也會降低膳食纖維含量百分比[22]。因此，選擇堿解時間為2～4 h 進行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.1.4 料液比對TDF 提取率的影響

料液比對TDF 提取率的影響見圖4。

圖4 料液比對TDF 提取率的影響Fig.4 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of TDF

如圖4 所示，增加NaOH 溶液體積能提高TDF 提取率，當(dāng)料液比為1∶40（g/mL）時，TDF 提取率達到最高，之后隨NaOH 溶液體積增加，TDF 提取率出現(xiàn)下降趨勢，NaOH 溶液體積增大，原料與提取溶劑的接觸面積增大，進而增加雜質(zhì)的溶出[23]。因此，選擇料液比1∶20～1∶40（g/mL），進行下一階段的響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

2.2 茶膳食纖維提取響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

選擇堿液濃度（A）、堿解溫度（B）、堿解時間（C）及料液比（D）為考察對象，進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，試驗方案及結(jié)果如表2 所示。

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 The response surface design and test results

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型的建立及顯著性檢驗

對響應(yīng)面得到的試驗結(jié)果進行多元擬合，得到堿液濃度（A）、堿解溫度（B）、堿解時間（C）及料液比（D）4個因素與響應(yīng)值TDF 提取率（Y）之間的二次多項回歸方程：Y（TDF 提取率）=79.22-0.79A＋1.38B-1.26C＋0.33D-2.10AB ＋2.89AC ＋2.62AD -0.38BC -0.41BD -0.32CD -4.09A2＋0.19B2-2.71C2-3.66D2。

方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance

由表3 可知，該回歸模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項P=0.727 0＞0.05。此外，模型的確定系數(shù)R2=0.946 6，R2Adj=0.893 3，結(jié)果表示本次擬合的模型能夠解釋89.33%的響應(yīng)值變化。由表3 可知，影響TDF 提取率的4 個因素大小順序為B＞C＞A＞D，即堿解溫度＞堿解時間＞堿液濃度＞料液比。由該模型優(yōu)化得到的最優(yōu)工藝為堿液濃度3.35%、堿解溫度100 ℃、堿解時間2.36 h、料液比1∶28（g/mL），在該條件下得到的TDF 提取率理論值為82.259%。

2.2.3 各因素相互作用對膳食纖維提取率的影響

為了更加直觀地表示各因素交互作用與TDF 提取率之間的關(guān)系，通過Box-Behnken 試驗設(shè)計，將4 個影響因素（堿液濃度、堿解溫度、堿解時間及料液比）與TDF 提取率組成三維響應(yīng)曲面。各因素交互作用對膳食纖維提取率的影響見圖5。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面與等高線Fig.5 Response surface plot and contour plot of the effects of interactions between factors on the yield of dietary fiber from tea residue

由圖5 可知，堿解溫度較堿液濃度的曲面軸陡，說明堿解溫度對TDF 提取率的影響更大，TDF 提取率隨堿解溫度的升高逐漸增大。堿液濃度和堿解溫度兩個因素的交互作用極顯著。當(dāng)堿液濃度一定時，TDF 提取率隨堿解時間的延長先逐漸增大后減小，堿解時間一定時，TDF 提取率隨著堿液濃度的增加先增大后減小，堿液濃度（A）和堿解時間（C）的等高線呈橢圓形，說明兩者的交互作用對TDF 提取率的影響極顯著。堿液濃度和料液比的交互作用影響極顯著，堿液濃度比料液比曲面軸陡，說明堿液濃度對TDF 提取率的影響更大，與方差分析結(jié)果一致。堿解時間比料液比的曲面更陡，說明堿解時間對TDF 提取率的影響更大，二者的交互作用對TDF 提取率影響不顯著。

綜上所述，堿液濃度（A）和堿解溫度（B）、堿液濃度（A）和堿解時間（C）以及堿液濃度（A）和料液比（D）的交互作用對TDF 提取率均有顯著影響，并且交互作用大小順序為AC＞AD＞AB。

2.2.4 工藝優(yōu)化與驗證試驗

根據(jù)響應(yīng)面分析法得到TDF 的理論最優(yōu)提取條件為堿液濃度3.35%、堿解溫度100 ℃、堿解時間2.36 h及料液比1∶28（g/mL），該條件下得到的TDF 提取率理論值為82.259%。在此工藝參數(shù)條件下進行驗證，重復(fù)操作3 次，得到的TDF 膳食纖維含量為82.26%。試驗結(jié)果表明，實際測得的結(jié)果與理論推測值高度一致。說明該回歸模型可以較真實地反映各因素對響應(yīng)值的影響，具有良好的預(yù)測效果。

2.3 茶膳食纖維成分分析

膳食纖維主要包括纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、果膠等。茶渣和TDF 中膳食纖維組成成分見圖6。

圖6 茶渣和TDF 中膳食纖維組成成分Fig.6 Dietary fiber components in tea residue and tea dietary fiber

由圖6 可知，提取前茶渣中膳食纖維含量為61.87%，其中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠的含量分別為22.12%、17.72%、32.9%、7.81%。在最優(yōu)工藝調(diào)節(jié)下，提取得到的TDF 中膳食纖維含量為82.26%，較茶渣中的含量極顯著升高（P＜0.001）。進一步分析TDF中膳食纖維的組成成分，研究發(fā)現(xiàn)TDF 的主要成分為以纖維素、半纖維素和木質(zhì)素為代表的不溶性膳食纖維和以果膠為代表的可溶性膳食纖維，其含量分別為52.10%、14.20%、15.30 和5.00%，提取后纖維素含量極顯著升高（P＜0.001），半纖維素含量顯著升高（P＜0.01）。纖維素是一種天然高分子化合物，是構(gòu)成植物細胞壁的重要組分，含有豐富的羥基，能與水分子結(jié)合，使纖維具有較好的水合能力，人體攝入纖維能增加糞便的含水量和體積，進而達到促進排便、改善便秘的效果[24]。半纖維素是一種由不同類型單糖組成的雜多糖，是構(gòu)成植物細胞壁結(jié)構(gòu)的第二大碳水化合物高聚物[25]。

3 結(jié)論

本研究采用堿法提取普洱茶渣膳食纖維，基于單因素試驗，結(jié)合Box-Behnken 試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析法，構(gòu)建堿液濃度、堿解溫度、堿解時間和料液比4 個因素對普洱茶渣膳食纖維提取率的回歸模型。最終得到影響普洱茶渣膳食纖維提取率的主次因素依次為堿解溫度＞堿解時間＞堿液濃度＞料液比。根據(jù)模型及響應(yīng)面分析，獲得最佳提取工藝為堿液濃度3.35%、堿解溫度100 ℃、堿解時間2.36 h 及料液比1∶28（g/mL）。在此條件下，提取得到的普洱茶渣膳食纖維得率最高，經(jīng)驗證得到的得率為82.260%，與理論推測值高度一致。提取得到的普洱茶渣膳食纖維得率較前明顯提高了20.39%，該普洱茶渣膳食纖維主要為不溶性膳食纖維，其中纖維素和半纖維素含量分別為52.10%、14.20%，較提取前含量顯著增高。普洱茶渣膳食纖維提取工藝的優(yōu)化，為普洱茶渣的綜合利用提供較好的理論依據(jù)和參考價值。