不同均質(zhì)工藝處理對(duì)巴氏殺菌乳脂肪球膜蛋白質(zhì)組成的影響

張瑞明，劉夢(mèng)霞，王 祎，劉曉輝，于景華,*

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，北京 101107）

乳脂肪是牛乳的主要成分之一，在體系中以脂肪球的形式存在[1-2]。脂肪球表面由成分復(fù)雜的脂肪球膜[3]包裹，脂肪球膜主要由蛋白質(zhì)、脂類等組成[4]，這些蛋白質(zhì)以及脂類具有重要的功能[5]。在貯存過(guò)程中，脂肪球一直進(jìn)行不規(guī)則的布朗運(yùn)動(dòng)，由于熱運(yùn)動(dòng)相互碰撞時(shí)，在脂肪球膜處會(huì)發(fā)生相互滲透，導(dǎo)致脂肪球之間相互融合，進(jìn)而形成更大的脂肪球[6]，由于重力沉降作用和油-水界面密度差，便會(huì)產(chǎn)生脂肪上浮現(xiàn)象，最終影響產(chǎn)品品質(zhì)與貨架期。

脂肪球的粒徑大小可以反映脂肪穩(wěn)定性，通常脂肪球的平均直徑小于0.8 μm時(shí)，其上浮速度慢[7]。減小脂肪球直徑常用的方法是均質(zhì)，在均質(zhì)過(guò)程中，通過(guò)湍流、剪切力和氣穴現(xiàn)象的作用，使得脂肪球直徑迅速變小[8]。均質(zhì)壓力需要適當(dāng)[9]，因?yàn)榫|(zhì)會(huì)導(dǎo)致脂肪球膜上蛋白含量、種類以及結(jié)合方式發(fā)生變化[10]，從而影響牛乳的膠體和功能特性[11]。

脂肪球膜蛋白在乳相中含量極少[12-13]，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定出蛋白質(zhì)的種類有500多種[14]。豐度最高的有8 種[15]，其中6 種是糖蛋白，包括黏液素1、黃嘌呤氧化還原酶、黏液素15（又稱組織糖蛋白高碘酸薛夫III）、組織糖蛋白高碘酸薛夫IV（cluster of differentiation 36，CD36）、嗜乳脂蛋白和乳凝集素（又稱組織糖蛋白高碘酸薛夫6/7）[16]，另外兩種都是分子質(zhì)量更小的非糖基化蛋白，分別為脂肪分化相關(guān)蛋白和脂肪酸結(jié)合蛋白[17-18]。這些蛋白雖然量少，卻具有重要的功能，如黃嘌呤氧化還原酶（xanthine dehydrogenase/oxidase，XO）在乳腺的發(fā)育、腸道的抗菌和組織損傷中具有一定的作用[19]。嗜乳脂蛋白（butyrophilin，BTN）具有免疫調(diào)節(jié)作用[20-21]等。同時(shí)這些蛋白對(duì)維持體系的穩(wěn)定性也發(fā)揮著不可忽視的作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究在不同均質(zhì)條件下脂肪球膜蛋白組分的變化，并與天然脂肪球膜蛋白的組成進(jìn)行比較，確定形成乳穩(wěn)定體系所需脂肪球膜蛋白組成，以期為生產(chǎn)中均質(zhì)工藝參數(shù)調(diào)整，提高乳體系穩(wěn)定性，改善純?nèi)橹破返呢浖芷趦?nèi)脂肪上浮的缺陷提供可靠的理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理的鮮牛乳 滄興牧業(yè)有限公司。

氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、咪唑、乙醇、乙二胺四乙酸、硫酸銅、硫酸鉀（均為分析純）天津市化學(xué)試劑一廠；氯化鉀（分析純） 天津市景田化工有限公司；硼酸（分析純） 天津市百世化工有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）（純度＞93%） 美國(guó)Genview公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；甲酸（純度＞93%） 上海紫一試劑廠；乙腈（色譜純） 天津賽孚瑞科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FE20Mettler pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TDZ5-WS離心機(jī)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；752紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；BSA124S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；DYCZ-24DN型電泳儀 北京六一儀器廠；DL-600C電泳儀電源 北京東林昌盛生物科技有限公司；TW-Basic均質(zhì)機(jī) 上海沃迪自動(dòng)化裝備股份有限公司；Turbiscan Lab穩(wěn)定性分析儀 法國(guó)Formulation公司。

1.3 方法

1.3.1 巴氏殺菌乳的制備

將標(biāo)準(zhǔn)化的鮮牛乳置于水浴鍋中預(yù)熱，在固定均質(zhì)壓力的條件下設(shè)置不同的預(yù)熱溫度，分別為50、60、70 ℃；在固定預(yù)熱溫度的條件下設(shè)置不同的均質(zhì)壓力，分別為20、30、40、45 MPa；均質(zhì)后于水浴鍋中滅菌，條件為75 ℃、15 s[22]；滅菌后于冰水浴中快速降溫后置于4 ℃貯存。

1.3.2 巴氏殺菌乳穩(wěn)定性系數(shù)的測(cè)定

采用Turbiscan Lab穩(wěn)定性分析儀對(duì)樣品進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試。對(duì)于透明體系，選取透射光的透過(guò)率為指標(biāo)，不透明體系則選取背散射光的反射率為指標(biāo)（巴氏殺菌乳屬于不透明體系，因此選擇的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指標(biāo)為反射率）。穩(wěn)定分析儀給出的評(píng)價(jià)指標(biāo)是樣品觀察時(shí)間內(nèi)背散射光的平均變化率，也稱穩(wěn)定性系數(shù)（dynamic stability index，TSI）。TSI與體系的穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)，即TSI越小，體系越穩(wěn)定；TSI越大，體系越不穩(wěn)定。

測(cè)量時(shí)，取樣品約20 mL加入樣品池，加蓋后置于儀器的樣品槽中，設(shè)定60 min掃描一次，共掃描7 h，即可直接得到樣品的TSI。

1.3.3 乳脂肪球膜蛋白的提取

乳脂肪球膜蛋白的提取方法參考Le[23]和Zamora[24]等的方法并略作修改。將牛乳預(yù)熱至3 6 ℃后，4 000 r/min離心25 min收集上層乳脂；再用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌，以去除脫脂乳中的酪蛋白（casein，CN）、乳清蛋白（lactalbumin，La）、乳糖。PBS與乳脂肪以5∶1（V/V）混合，39 ℃輕微振蕩水浴30 min后，4 000 r/min離心30 min后收集上層乳脂；PBS重復(fù)洗滌乳脂兩次，再用蒸餾水洗滌一遍；將洗滌干凈的乳脂與SDS-Tris溶液1∶1（m/m）混合，60 ℃輕微振蕩水浴30 min后，4 ℃、5 000×g離心15 min，下層液體即為含有乳脂肪球膜蛋白的樣品。

1.3.4 乳脂肪球膜蛋白質(zhì)的SDS-PAGE定性分析

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）參照de Feijter等[25]的方法，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE分析，還原膠與非還原膠的配制參照趙亭亭等[26]的方法。

1.3.5 液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定乳脂肪球膜蛋白組成及含量

1.3.5.1 蛋白質(zhì)定量

使用8 mol/L尿素復(fù)溶1.3.3節(jié)中提取的乳脂肪球膜蛋白樣品，用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定：1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：配制0.1 mg/mL的牛血清白蛋白溶液，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[27]。2）蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：取1 mL待測(cè)洗液與5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑混合均勻，靜置5 min后于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，20 min內(nèi)測(cè)完。調(diào)整洗液中蛋白質(zhì)量濃度，使所有樣品蛋白質(zhì)量濃度均為3 mg/mL，備用。

1.3.5.2 SDS-PAGE鑒定溶解效果

SDS-PAGE方法同1.3.4節(jié)。

1.3.5.3 FASP法酶解蛋白質(zhì)

液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）聯(lián)用的樣品采用超濾輔助樣品制備（filter-aided sample preparation，F(xiàn)ASP）法[28-29]酶解處理。從1.3.3節(jié)提取的脂肪球膜蛋白樣品中取出100 μg蛋白質(zhì)使用FASP法進(jìn)行蛋白質(zhì)酶解，具體步驟如下：向樣品中加入與蛋白樣品相同體積的8 mol/L尿素；加入DL-二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT），使DTT終濃度達(dá)到10 mmol/L，然后在37 ℃條件下反應(yīng)2.5 h；加入碘乙酰胺（iodoracetamide，IAA）至終濃度50 mmol/L，避光反應(yīng)40 min；轉(zhuǎn)至3K超濾管中12 000×g下離心，之后棄掉濾液；加入400 μL 8 mol/L尿素，12 000×g下離心，棄掉濾液，重復(fù)兩次；向超濾管中加入400 μL 50 mmol/L碳酸氫銨溶液，12 000×g下離心，棄掉濾液，重復(fù)3 次。向超濾管中加入200 μL 50 mmol/L碳酸氫銨溶液；向超濾管中以m（樣品）∶m（酶）＝50∶1加入胰蛋白酶，于37 ℃搖床酶解16 h；在4 ℃、12 000×g條件下離心，收集濾液，冷凍干燥。

1.3.5.4 LC-MS/MS檢測(cè)參數(shù)及樣品編號(hào)

采用Nano Acquity高效液相色譜，色譜柱：C18（15 cm×75 μm，3 μm）；分離條件：上樣量為2 μg；流動(dòng)相A為0.1%（體積分?jǐn)?shù)，后同）甲酸-水溶液；流動(dòng)相B為0.1%甲酸-乙腈溶液。采用梯度洗脫，0～10 min 95% A，10～140 min 90% A，140～158 min 70% A，158～160 min 55% A，160～165 min 5% A，165～180 min 95% A；流速400 nL/min。

串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass spectrometry，MS/MS）分析采用Scientific Q Exactive質(zhì)譜儀；噴霧電壓：2.0 kV；毛細(xì)管溫度：320 ℃；S-lens RF水平：55；分辨率：一級(jí)70 000，m/z 200，二級(jí)17 500，m/z 200；母離子掃描范圍：m/z 300～1 800，子離子從m/z 100開(kāi)始掃描；MS1 AGC目標(biāo)：3e6，離子注入時(shí)間：60 ms，MS2 AGC目標(biāo)：5e4，離子注入時(shí)間：80 ms；離子篩選窗口：2.2 m/z；碎裂模式：HCD；能量NCE 27；Data-dependent MS/MS：Top 20；動(dòng)態(tài)排除時(shí)間：30 s。

取6 個(gè)巴氏殺菌乳樣品進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè)，其樣品編號(hào)和相應(yīng)制備方法為：L1（預(yù)熱溫度60 ℃、均質(zhì)壓力20 MPa）、L2 （預(yù)熱溫度60 ℃、均質(zhì)壓力30 MPa）、L3（預(yù)熱溫度60 ℃、均質(zhì)壓力40 MPa）、 L4（預(yù)熱溫度60 ℃、均質(zhì)壓力45 MPa）、L5 （預(yù)熱溫度50 ℃、均質(zhì)壓力40 MPa）、L6（預(yù)熱溫度70 ℃、均質(zhì)壓力40 MPa）。

1.3.5.5 LC-MS/MS蛋白質(zhì)組學(xué)分析

使用蛋白質(zhì)組學(xué)分析軟件Proteome Discoverer 2.1對(duì)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行蛋白質(zhì)定性與定量分析，檢索數(shù)據(jù)庫(kù)采用Uniprot網(wǎng)站下載的Bos Taurus全庫(kù)（數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)9913），同時(shí)為了去除假陽(yáng)性結(jié)果，數(shù)據(jù)檢索采用正反庫(kù)檢索策略，檢索結(jié)果在多肽層次采用偽發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）≤1%篩選條件，在蛋白層次采用Q Value≤1%的篩選條件。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Turbiscan Lab全能穩(wěn)定分析儀的TLAB EXPERT軟件采集數(shù)據(jù)，采用SPSS軟件分析數(shù)據(jù)，并用Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同均質(zhì)工藝條件對(duì)巴氏殺菌乳T(mén)SI的影響

圖1 不同預(yù)熱溫度對(duì)乳脂肪TSI的影響Fig. 1 Effect of different preheating temperatures on turbiscan stability index of milk fat

TSI與樣品穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)，即TSI越大表示樣品穩(wěn)定性越差。由圖1可以看出，不同均質(zhì)壓力下，預(yù)熱溫度分別為50、60 ℃和70 ℃時(shí)，60 ℃巴氏殺菌乳的脂肪穩(wěn)定性均表現(xiàn)最好。

圖2 不同均質(zhì)壓力對(duì)乳脂肪TSI的影響Fig. 2 Effect of different homogenization pressures on turbiscan stability index of milk fat

由圖2可以看出，不同預(yù)熱溫度下，均質(zhì)壓力分別為20、30、40 MPa和45 MPa時(shí)，40 MPa巴氏殺菌乳總體脂肪穩(wěn)定性最好。

因此，從TSI來(lái)判斷，預(yù)熱溫度60 ℃、均質(zhì)壓力40 MPa時(shí)，巴氏殺菌乳脂肪穩(wěn)定性最好。

2.2 乳脂肪球膜蛋白質(zhì)的SDS-PAGE定性分析結(jié)果

由圖3可知，生牛乳中XO、CD36、BTN在非還原條件下不存在，在還原條件（添加β-巰基乙醇）下出現(xiàn)，說(shuō)明這些脂肪球膜蛋白可能是通過(guò)二硫鍵作用力結(jié)合在脂肪球膜上；泳道2樣品XO、CD36、BTN、ADPH在非還原條件下不存在，而在還原條件下存在，說(shuō)明XO、CD36、BTN、ADPH這些蛋白通過(guò)二硫鍵形式結(jié)合存在；與泳道1樣品對(duì)比可知，預(yù)熱后均質(zhì)導(dǎo)致部分CN、La參與了脂肪球膜蛋白的組成，這與Ye Aqian等[30]的結(jié)論一致。而且均質(zhì)后，αs1-CN、β-CN的含量明顯增多，這可能是其參與了脂肪球膜的再構(gòu)建，對(duì)再構(gòu)建體系的穩(wěn)定性發(fā)揮作用。經(jīng)過(guò)均質(zhì)處理的泳道3～8樣品在非還原條件下存在XO、BTN、ADPH，與泳道1、2樣品對(duì)比，可能是均質(zhì)導(dǎo)致一部分XO、BTN、ADPH之間的二硫鍵作用力減弱，以非二硫鍵作用力存在于脂肪球膜上。非還原條件下的泳道1～8樣品，在濃縮膠的上樣孔處和濃縮膠與分離膠分界處有明顯的大分子物質(zhì)堆積；而在還原條件下，僅泳道1、2樣品有大分子物質(zhì)堆積，泳道3～8樣品沒(méi)有大分子物質(zhì)堆積，證明未均質(zhì)的牛乳脂肪球膜蛋白之間除了二硫鍵作用力外，還有其他的連接方式，使其成為大分子復(fù)合物，在均質(zhì)后這種作用力被消除。

圖3 牛乳脂肪球膜蛋白質(zhì)SDS-PAGE分析圖譜Fig. 3 SDS-PAGE patterns of MFGM proteins under non-reducing and reducing conditions

2.3 LC-MS/MS檢測(cè)乳脂肪球膜蛋白結(jié)果

2.3.1 蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果

表1 不同均質(zhì)工藝條件處理的巴氏殺菌乳脂肪球膜LC-MS/MS鑒定的蛋白總數(shù)量Table 1 Number of MFGM proteins identified by LC-MS/MS from different homogenized pasteurized milks

通過(guò)LC-MS/MS蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，檢測(cè)不同均質(zhì)工藝條件對(duì)脂肪球膜蛋白種類的影響。由表1、圖4可知，L1～L6樣品總共檢測(cè)到蛋白質(zhì)467 個(gè)，比較L1～L4樣品，預(yù)熱溫度60 ℃，不同均質(zhì)壓力的脂肪球膜蛋白種類數(shù)目接近，差異蛋白數(shù)量較少，分別為41、32、11、13 個(gè)，因此影響脂肪穩(wěn)定性的蛋白主要表現(xiàn)在特定蛋白質(zhì)的含量差異上。比較L3、L5、L6樣品，均質(zhì)壓力為40 MPa時(shí)不同預(yù)熱溫度處理的脂肪球膜蛋白種類數(shù)目有差異，隨著預(yù)熱溫度的升高蛋白種類減少，分別為27、91、7。但是通過(guò)基因本體論（gene ontology，GO）注釋分析，差異蛋白的分子功能并無(wú)特異性，有結(jié)合功能的蛋白質(zhì)在3 種樣品中都存在，因此影響脂肪穩(wěn)定性的蛋白主要表現(xiàn)在特定蛋白質(zhì)的含量差異上。

圖4 不同均質(zhì)壓力處理的巴氏殺菌乳脂肪球膜蛋白（A）和不同預(yù)熱溫度處理的巴氏殺菌乳脂肪球膜蛋白（B）韋恩圖Fig. 4 Venn diagrams for MFGM proteins in pasteurized milk treated at different homogenization pressures (A) and temperatures (B)

2.3.2 牛乳脂肪球膜蛋白構(gòu)成LC-MS/MS分析結(jié)果

圖5 不同預(yù)熱溫度對(duì)高豐度（A）和低豐度（B）再構(gòu)建乳脂肪球膜蛋白的影響Fig. 5 Effects of different preheating temperatures on composition of high- (A) and low-abundance (B) reconstituted MFGM proteins

由圖5可知，預(yù)熱溫度60 ℃時(shí)，XO、BTN、ADPH、乳鐵蛋白（lactoferrin，Lf）、β-lg、κ-CN、αs2-CN這幾種蛋白質(zhì)含量最低，可能是這幾種脂肪球膜蛋白在預(yù)熱60 ℃時(shí)的結(jié)合力最弱，在提取脂肪球膜蛋白過(guò)程中損失最多，Lf、β-lg、κ-CN、αs2-CN這幾種蛋白質(zhì)在預(yù)熱60 ℃時(shí)結(jié)合到脂肪球膜上的量最少；MUC1、αs1-CN、β-CN、BSA在預(yù)熱60 ℃時(shí)的含量最高，說(shuō)明脂肪球膜蛋白MUC1在預(yù)熱60 ℃時(shí)的結(jié)合力最強(qiáng)，最穩(wěn)定，而αs1-CN、β-CN、BSA結(jié)合到脂肪球膜上的量最多，結(jié)合最穩(wěn)定，結(jié)合2.1節(jié)穩(wěn)定性分析結(jié)果推測(cè)，可能是αs1-CN、β-CN、BSA參與了脂肪球膜的再構(gòu)建，對(duì)脂肪球穩(wěn)定性起到關(guān)鍵作用；FABP、PAS6/7、Ig的含量隨著預(yù)熱溫度的升高而減少，說(shuō)明脂肪球膜蛋白FABP、PAS6/7有熱不穩(wěn)定性，溫度升高后結(jié)合力減弱導(dǎo)致有所損失，而結(jié)合到膜上的Ig會(huì)隨著溫度的升高而脫落。α-La、CD36的含量隨著預(yù)熱溫度的升高而增多，說(shuō)明脂肪球膜蛋白CD36隨著預(yù)熱溫度的升高結(jié)合作用力更穩(wěn)定，CD36隨預(yù)熱溫度的升高損失得越少，而α-La隨著溫度的升高結(jié)合到脂肪球膜上的量增多。通過(guò)蛋白豐度的變化分析可知，預(yù)熱處理后脂肪球膜被破壞，會(huì)有部分膜組分流入乳相，同時(shí)也有乳蛋白結(jié)合到膜上。

圖6 不同均質(zhì)壓力對(duì)高豐度（A）和低豐度（B）再構(gòu)建乳脂肪球膜蛋白的影響Fig. 6 Effect of different homogenizations pressures on composition of high- (A) and low-abundance (B) reconstituted MFGM proteins

由圖6可知，4 種樣品中的XO、PAS6/7、BTN、ADPH、FABP、Lf和β-lg這7 種蛋白質(zhì)含量的變化趨勢(shì)一致，隨均質(zhì)壓力的增大，先減少而后增加，且在均質(zhì)壓力40 MPa時(shí)蛋白質(zhì)含量最低。由2.1節(jié)結(jié)果可知，40 MPa時(shí)的巴氏殺菌乳脂肪是最穩(wěn)定的，說(shuō)明這些蛋白在此壓力下含量最適宜，可能是這些蛋白此時(shí)能夠與其他蛋白相互作用達(dá)到最佳作用效果，使得脂肪球最穩(wěn)定；XO和BTN兩種蛋白質(zhì)含量變化趨勢(shì)一致，也證明了Mulder[31]的結(jié)論：XO和BTN之間通過(guò)二硫鍵作用力形式結(jié)合存在。Lf、β-lg與XO、PAS6/7、BTN、ADPH、FABP的變化趨勢(shì)一致；而B(niǎo)SA在均質(zhì)壓力40 MPa時(shí)含量最高（圖6A），因此BSA可能是影響脂肪穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素；α-La和CD36這兩種蛋白隨著均質(zhì)壓力的增加而減少（圖6B），說(shuō)明均質(zhì)破壞了這兩種蛋白的結(jié)合作用力，使其容易從膜上脫落損失。

3 結(jié) 論

通過(guò)測(cè)定TSI確定了在預(yù)熱溫度為60 ℃、均質(zhì)壓力為40 MPa時(shí)的巴氏殺菌乳脂肪穩(wěn)定性最佳。通過(guò)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，XO、CD36、BTN、ADPH通過(guò)二硫鍵作用力存在于脂肪球膜上；均質(zhì)處理導(dǎo)致一部分XO、BTN、ADPH蛋白質(zhì)之間的二硫鍵作用力減弱，以非二硫鍵作用力作用形式存在于脂肪球膜上；預(yù)熱和均質(zhì)處理會(huì)導(dǎo)致CN、La參與脂肪球膜的組成；未均質(zhì)的牛乳脂肪球膜蛋白之間除了有二硫鍵作用力以外，還有其他的連接方式，使這些蛋白質(zhì)成為大分子復(fù)合物，而均質(zhì)后這種作用力被消除。

通過(guò)LC-MS/MS蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法檢測(cè)不同均質(zhì)工藝條件對(duì)脂肪球膜蛋白種類的影響：預(yù)熱溫度50～70 ℃、均質(zhì)壓力20～45 MPa范圍內(nèi)，均質(zhì)壓力對(duì)巴氏殺菌乳脂肪球膜蛋白種類無(wú)顯著影響；預(yù)熱溫度對(duì)巴氏殺菌乳脂肪球膜蛋白種類有影響，但這些差異蛋白無(wú)特殊分子功能。因此影響脂肪穩(wěn)定性的蛋白主要表現(xiàn)在特定蛋白質(zhì)的含量差異上。

通過(guò)LC-MS/MS鑒定分析不同均質(zhì)工藝處理的乳脂肪球膜蛋白含量變化情況：在均質(zhì)壓力40 MPa、預(yù)熱溫度60 ℃時(shí)，XO、BTN、ADPH、Lf、β-lg、κ-CN、αs2-CN這幾種蛋白質(zhì)的結(jié)合力最弱；而MUC1、αs1-CN、β-CN、BSA的結(jié)合最穩(wěn)定，說(shuō)明這幾種蛋白質(zhì)對(duì)脂肪球膜穩(wěn)定性方面起到關(guān)鍵作用；脂肪球膜蛋白FABP、PAS6/7具有熱不穩(wěn)定性；脂肪球膜蛋白CD36隨著預(yù)熱溫度的升高結(jié)合作用力更穩(wěn)定，而α-La隨著溫度的升高結(jié)合到脂肪球膜上的量增多；XO和BTN之間通過(guò)二硫鍵作用力形式結(jié)合存在；BSA在均質(zhì)壓力40 MPa時(shí)含量最高，可能是影響脂肪穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。