納米顆粒在側流免疫層析技術中的應用研究進展

田亞晨，王淑娟，馬 蘭，謝曼曼，許東坡，劉 程，丁承超，郭 亮，方水琴，王 翔，邱景璇，董慶利，劉 箐*

（上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093）

側流免疫層析（lateral flow immunoassay，LFIA）技術是一種結合了色譜分析和免疫反應原理的固相免疫層析技術，最初稱為“溶膠顆粒免疫測定”，是一種典型的現(xiàn)場檢測技術。標記材料同時承擔LFIA檢測結果的“可視化”和“抗體標記”兩大功能，對該方法的靈敏度、檢測限（limit of detection，LOD）等性能至關重要。以20～30 nm金納米顆粒作為標記物的LFIA，由于亮度不足導致靈敏度低[1-2]。而新型納米顆粒用于生物分析標記物質，極大地改善了標記物性能，顯著提升了現(xiàn)有分析方法的靈敏度及特異性。因此，新型納米顆粒標記物可提高傳統(tǒng)LFIA的分析性能，并廣泛應用于實際檢測中。本文就各種新型納米顆粒標記物的優(yōu)缺點及各類納米顆粒對試紙條性能的改善進行詳盡分析，以期對LFIA技術的發(fā)展提供借鑒。

1 納米顆粒簡介

納米顆粒一般是指三維空間尺寸至少有一維尺寸在1～100 nm范圍內的超微粒子。納米顆粒一般具有表面效應、小尺寸效應、量子效應、宏觀量子隧道效應等特性[3]。與正常粒子相比，納米顆粒具有大的比表面積，其光、熱、磁敏感特性和表面穩(wěn)定性較高，擁有“21世紀最有前途材料”的美譽[4]。納米材料由于具有特殊的結構層次、較強的吸附能力、良好的定向性能、生物相容性以及結構相容性（酶、抗原、抗體以及生物分子受體具有和納米材料相似的尺寸約2～20 nm）等優(yōu)勢，在抗原抗體的標記上具有很大的應用潛能，是LFIA最常用的抗體標記材料。另外LFIA材料還要求具有功能廣、響應時間短、靈敏度高、檢測范圍廣等優(yōu)點，納米材料能較好地滿足上述要求。

2 納米顆粒分類及優(yōu)缺點

目前，LFIA的分析靈敏度主要通過使用3 種類型的納米顆粒標記物來增強。LFIA中的納米顆粒標記物按材料可分為有色納米顆粒、發(fā)光納米顆粒以及磁性納米顆粒等。其中，發(fā)光納米顆粒又包括量子點（quantum dots，QDs）及時間分辨熒光微球（time-resolved fluorescent microspheres，TRFNs）、上轉換熒光納米顆粒（up conversion nanoparticles，UCP）、染料摻雜的熒光納米顆粒等；有色納米顆粒包括常規(guī)膠體金納米顆粒（gold nanoparticles，GNPs）、碳納米顆粒（carbon nanoparticles，CNPs）和膠體硒納米顆粒（colloidal selenium nanoparticles，SNPs）等[5-6]。表1總結了不同的納米顆粒在LFIA中的優(yōu)缺點。

表1 不同的納米顆粒在LFIA中的優(yōu)缺點Table 1 Advantages and disadvantages of different nanoparticles in LFIA

續(xù)表1

2.1 有色納米顆粒

2.1.1 膠體金納米顆粒

GNPs由氯金酸在還原劑檸檬酸三鈉等的作用下聚合成為特定大小的金顆粒，并通過靜電作用而形成的一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，直徑在l～150 nm，屬于多相不均勻體系，顏色呈桔紅色到紫紅色。膠體金因具有顏色鮮亮、易于制備、生物相容性佳、高度穩(wěn)定及化學可示蹤性及良好光學性狀等諸多優(yōu)點而被廣泛用作LFIA標記探針[35]。

2.1.2 碳納米顆粒

CNPs也稱為膠體碳或炭黑，粒徑在10～100 nm之間，是一類有色顆粒標記物，可進行定性或半定量檢測。作為GNPs的替代標記物，CNPs具有許多優(yōu)異的性質，例如易制備、高穩(wěn)定性、無毒性、易于綴合及不需活化等[36]。

2.1.3 膠體硒納米顆粒

SNPs也稱為膠體硒，是另一種應用于免疫檢測技術領域的納米標記物。與膠體金類似，同樣是通過調整反應條件獲得不同納米級別的硒顆粒，具有表面效應和小尺寸效應。另外，它還具有成本低、與蛋白標記簡單、標記后不易聚沉以及便于調整粒徑范圍等優(yōu)點[37]。

2.2 發(fā)光納米顆粒

2.2.1 量子點

QDs是一種熒光半導體納米晶體，一般為球形或類球形，粒徑通常在2～20 nm之間。常見的QDs由IV、II～VI、IV～VI或III～V族元素組成，具體包括硅QDs、鍺QDs、硫化鎘QDs、硒化鎘QDs、碲化鎘QDs、硒化鋅QDs、硫化鉛QDs、硒化鉛QDs、磷化銦QDs和砷化銦QDs等[38]。QDs具有獨特的光學性質，如激發(fā)光譜寬且連續(xù)分布，而發(fā)射光譜窄而對稱，光化學穩(wěn)定性強以及熒光壽命長等優(yōu)越的熒光特性，被認為是紙基分析中最有潛力的生物標記物。

2.2.2 上轉換熒光納米顆粒

UCP是一種由主基質（氟化物等）、吸收子（Er、Yb、Sm等稀土離子）及發(fā)射子（Tm、Ho、Tb等稀土離子）組成的熒光物質，是一類新近開發(fā)的熒光探針，與普通的下轉換納米材料相比，UCP是用低能量的近紅外光激發(fā)，發(fā)射高能量的可見光；因此，對生物組織傷害小且穿透能力強，是理想的熒光納米材料[39-40]。

2.2.3 染料摻雜的納米顆粒

2.2.3.1 染料摻雜的二氧化硅納米顆粒

二氧化硅納米顆粒的尺寸和粒度分布均一、成本低，具有良好的生物相容性和豐富的表面基團可以進行修飾。與QDs和UCP不同，二氧化硅納米顆粒自身雖不能發(fā)光，但可將功能性物質包裹或摻雜到二氧化硅納米顆粒中，如熒光染料、金納米顆粒、QDs、稀土發(fā)光材料等，從而形成發(fā)光復合納米材料。鑒于以上優(yōu)點，二氧化硅納米顆粒被廣泛應用于生物檢測領域[41]。目前，研究人員開發(fā)了摻雜有鑭系元素螯合物的二氧化硅納米顆粒，以增強二氧化硅納米顆粒的熒光性能并提高檢測靈敏度。TRFNs指添加了具有熒光特性物質（以鑭系元素為代表）的二氧化硅納米顆粒[42]。

2.2.3.2 染料摻雜的聚苯乙烯納米顆粒

聚苯乙烯納米顆粒是另一類用于摻雜染料分子的納米材料。與染料摻雜的二氧化硅納米顆粒相似，染料摻雜的聚苯乙烯納米顆?？梢蕴峁┍扔坞x染料分子更高的熒光信號，從而提高膜基LFIA的分析性能[43]。

2.3 磁性納米顆粒

磁性納米顆粒（magnetic nanoparticles，MNPs）指尺寸為納米級的磁性材料（以Fe3O4為代表），具有良好的磁導向性和生物相容性，易于制備，可與抗體耦合形成免疫磁珠[44]。

3 納米顆粒在LFIA中的功能及應用

LOD、特異性和檢測時間是評估LFIA技術的主要標準。納米材料的引入為LFIA技術實現(xiàn)高靈敏、高特異性和快速檢測奠定了良好基礎[45-46]。

3.1 提高檢測靈敏度

在傳統(tǒng)的免疫層析（immunochromatographic assay，ICA）技術中，膠體金被用作標記物，然而膠體金較低的光學信號以及較少的抗體吸附量限制了ICA技術靈敏度的提高，因此標記材料的選擇對提高ICA技術的靈敏度具有重要意義。目前，已報道了大量提高LFIA靈敏度的研究，一種策略是利用許多有色納米顆粒作為標記物，以提高測定靈敏度，如碳納米管和TRFNs、QDs和UCP[47]。在TRFNs中，每個熒光微球可包裹成千上萬個熒光分子，熒光標記率高，有效提高了分析靈敏度。例如，Zhang Yong等[48]對鹽酸克侖特羅進行定量檢測，系統(tǒng)地比較了TRFNs-LFIA和GNPs-LFIA，LOD分別為16、68 pg/mL，TRFNs-ICA的靈敏度優(yōu)于膠體金免疫層析（colloidal gold-ICA，CG-ICA），但TRFNs-LFIA的基質效應高。金納米花（gold nano flower，AuNF）的多分支結構和大的比表面積使其具有強光學信號和親和力，因此AuNF制備的ICA試紙條靈敏度更高。如Zhang Wenjing等[49]合成具有5 種不同粒徑大?。?3、47、79、152、195 nm）的AuNF，并將它們作為標記物用于人絨毛膜促性腺激素檢測，直徑為47～79 nm的中型AuNF顯示出的靈敏度最高（9 mIU/mL），比傳統(tǒng)的基于CNPs的LFIA技術的LOD低10 倍。另外，研究人員開發(fā)了銀增強、金增強、酶增強、雙標記等策略以實現(xiàn)高靈敏度的定量測定，對實現(xiàn)LFIA超靈敏檢測具有重要意義。雖然通過銀或者金來放大金標記信號是有效的增敏途徑，但仍受到銀溶液制備以及洗滌的限制。為克服這些問題，研究人員對傳統(tǒng)LFIA進行改進。例如Yang Wei等[50]改進了銀放大金標信號的夾心LFIA以檢測相思子毒素，與傳統(tǒng)的LFIA相比，增加了AgNO3墊和減速墊（還原劑墊）（圖1），LOD為0.1 ng/mL，靈敏度增加了100 倍。目前，研究人員利用GNPs光熱效應性質，用特定波長的激光照射激發(fā)GNPs的光熱效應進而使溫度升高，利用此特性，可將光熱效應應用于膠體金試紙條方法，使靈敏度明顯提高。劉靜靜[51]利用納米材料光熱效應檢測大腸桿菌，靈敏度提高了10 倍。

圖1 新型銀增強膠CG-ICA試紙條[50]Fig. 1 Schematic of silver-enhanced immunochromatographic test strip[50]

對于熒光納米顆粒，盡管可以通過多種策略實現(xiàn)高靈敏度，但熒光信號易于猝滅并且遭受光漂白的問題，有可能導致靈敏度降低并且不適合大規(guī)模生產(chǎn)和長期保存。在過去的10 年中，超順磁性納米顆粒（superparamagnetic nanoparticles，SMNPs）作為一種新型標記材料引起了極大的關注，通過檢測NC檢測帶表面的磁信號，取代傳統(tǒng)的光學信號，極大地提高了敏感性和準確性。Wang Yanyan等[44]使用不同尺寸和磁鐵礦含量的SMNPs作為標簽研究定量LFIA技術并利用巨磁傳感器檢測，靈敏度提高10～1 000 倍。另外，Razo等[52]將GNPs和SMNPs聯(lián)合用于測流ICA試紙條，實現(xiàn)信號雙重增強，檢測馬鈴薯病毒X（圖2），靈敏度明顯提高，解決了因SMNPs的高熒光猝滅性質和磁性熒光探針無法進行定量檢測的問題。

圖2 不同形式的LFIA檢測分析物[52]Fig. 2 Detectable complexes formed in different LFIA formats[52]

目前，LFIA技術除了改善標記材料來提高靈敏度以外，尋找識別力更強的物質替代抗體與抗原特異性反應、設計新型試紙條來提高ICA試紙條的檢測靈敏度已成為新的趨勢。另外，在傳統(tǒng)的光學LFIA技術中，主要使用反射光或熒光的閱讀器進行定量測定。膜的厚度為幾百微米[34]，捕獲的分析物在膜表面移動，同時會向膜內滲透。然而讀取器對膜進行掃描時僅檢測到了膜表面（約10 μm）分析物的信號，約90%的分析物未被檢測到，這也是試紙條靈敏度低的原因之一。因此除了改善標記物以外，如何更準確地讀取試紙條信息，也受到越來越多的關注。研究人員開發(fā)基于智能手機的成像系統(tǒng)，用于定量檢測，將智能成像引入LFIA中準確性明顯提高[53]。

3.2 實現(xiàn)高通量檢測

傳統(tǒng)LFIA實現(xiàn)多元檢測主要是在單個LFIA試紙條中設計多條檢測線。Taranova等[54]通過使用多色QDs對牛乳中的氧氟沙星（ofloxacin，OFL）、氯霉素（chloramphenicol，CAP）和鏈霉素（streptomycin，STM）同時檢測，設計了一種“交通燈”的競爭性LFIA技術（圖3）。該設計使用在625、585 nm和525 nm波長處具有發(fā)射峰的3 種水溶性QDs，分別產(chǎn)生紅色、黃色和綠色的3 個測試區(qū)。在“交通燈”分析中，OFL、CAP和STM的LOD分別達到0.3、0.12、0.2 ng/mL，比酶聯(lián)免疫吸附檢測（enzyme linked immune sorbent assay，ELISA）的LOD低80～200 倍。利用新型納米材料（QDs、UCP）發(fā)射顏色可調性，可以實現(xiàn)在只有一條檢測線和質控線情況下進行多元檢測。Wang Chunying等[55]開發(fā)了一種基于多色QDs的三明治式LFIA技術（圖4），同時檢測甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）和癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA），LOD分別為3 ng/mL和2 ng/mL。此外，為避免多元檢測試紙條交叉問題。Hong Wenyan等[56]開發(fā)基于UCP雙抗夾心模式的十通道試紙盤檢測系統(tǒng)，同時檢測經(jīng)鼠疫桿菌感染的動物及人血清樣品中的10 種抗體靶標，檢測得到F1抗體陽性率100%。該裝置的分析性能與常規(guī)ELISA相當。

多元檢測也是ICA技術發(fā)展的方向，且日益趨于成熟，即在同一條膜上同時檢測多種物質，以提高檢測效率，降低檢測成本。多元檢測尤其對有聯(lián)檢意義的多個指標的檢測有很大的應用價值。

圖3 “交通燈”ICA實驗競爭性檢測3 種抗生素流程圖[54]Fig. 3 Flow chart for “Traffic Light” immunochromatographic testwith competitive detection of three antibiotics[54]

圖4 基于多色QDs的三明治式LFIA技術[55]Fig. 4 Sandwich-type lateral flow immunochromatography based on multicolor quantum dots[55]

3.3 通過可修飾性降低假陽性

表2 不同納米顆粒的LFIA試紙條在生物檢測中的應用Table 2 Application of nanoparticle-based lateral flow immunochromatographic test strips in food safety testing

諸多影響因素，如樣品、LFIA本身的設計缺陷或操作不當，使得ICA技術在實際檢測過程中仍會出現(xiàn)假陽性。產(chǎn)生假陽性的主要原因是由于檢測環(huán)境、樣品基質等的干擾，容易破壞膠體金與蛋白質大分子間的靜電結合力，導致膠體金標記率低、產(chǎn)生裸金，蛋白與膠體金顆粒非特異性結合。一般情況下，在LFIA中為減少假陽性概率的出現(xiàn)，通常會選擇惰性蛋白對硝酸纖維素膜、納米標記物進行封閉。近年來研究人員利用修飾性納米顆粒，避免蛋白質與納米顆粒非特異性結合，從而降低假陽性率。TRFNs除提高靈敏度外，由于其表面修飾有合適密度的羧基，用于與蛋白或抗體的共價偶聯(lián)，提高標記率，有效避免假陽性，已經(jīng)逐漸取代第一代膠體金、彩色乳膠和第二代熒光微球技術[57]。羅凱[58]研究膠體金、QDs、熒光微球和TRFNs4 種標記物用于測定大腸桿菌O157:H7。由于TRFNs的修飾性強，有效避免了非特異性結合，使基于銪熒光微球的時間分辨ICA檢測方法靈敏度最高，為5.0×102CFU/mL，假陽性率較低，且對牛乳基質的耐受性能更好。目前，除了利用可修飾納米顆粒降低假陽性概率，對抗體進行修飾、增強抗體的特異性結合能力也成為降低假陽性概率的一個有效途徑[59]。

由于各種新型納米材料標記物的不斷研發(fā)與優(yōu)化分析，使得與之相關的檢測技術廣泛運用于醫(yī)藥、食品安全和環(huán)境監(jiān)測等方面。表2總結了不同納米顆粒的LFIA試紙條在各領域中的應用。

4 結 語

LFIA已經(jīng)歷經(jīng)幾十年發(fā)展而較為成熟，已實現(xiàn)商品化和規(guī)?；瘧?，但該系統(tǒng)在檢出限、靈敏度、定量測定和高通量檢測方面仍需改進。納米顆粒具有獨特的性質，如比表面積大、表面反應活性高。固有信號放大、光學分析譜和控制處理能力等，能夠改善LFIA技術分析性能。本文簡要總結了基于納米顆粒標記物的LFIA技術，以及納米顆粒對試紙條分析性能的改善作用。表明基于新型納米顆?？梢蕴岣週FIA技術的靈敏度和穩(wěn)定性。同時，基于納米顆粒的多重檢測層析技術已被開發(fā)建立。此外，納米顆粒也可用作電化學或光學傳導系統(tǒng)的修飾劑。

盡管納米顆粒對LFIA技術性能有很大的改善，但在實際應用中仍存在很多問題。目前，主要面臨的問題及發(fā)展的趨勢簡述如下：1）抗體對側流技術的影響。例如，捕獲和檢測抗體應該具有高純度以避免基質干擾。此外，由于空間位阻、強親水性和納米顆粒的疏水性，抗體對靶分析物的親和力或活性會顯著降低，因此納米顆粒綴合抗體應適當被優(yōu)化，以保持抗體-納米顆粒綴合物的高活性和穩(wěn)定性[98]。同時改進納米顆粒與抗體的綴合過程，以保持抗體-納米顆粒綴合物的高活性?？贵w-納米顆粒綴合物的長期穩(wěn)定性和可用性在靈敏度和選擇性方面對LFIA技術起著重要作用。2）硝酸纖維素膜的選擇。LFIA技術中膜材料的作用是確保每個組件的適用性和兼容性，并降低假陰性或假陽性信號。Lee等[99]研究LFIA技術中選擇合適的膜用于敏感檢測低分子質量化合物的重要性。3）檢測基質的復雜性。由于不同食品樣品的電解質濃度和pH值往往會有很大差異，納米顆粒標記物在不同檢測基質中的穩(wěn)定性和單分散性需進一步提高和改善[100]。對于熒光納米顆粒樣品基質有可能帶來高的背景干擾，嚴重影響靈敏度，如何消除樣品基質的干擾有待進一步研究。隨著納米技術與分子生物學技術的發(fā)展，各種納米顆粒作為新型標志物在改進LFIA技術方面顯示出巨大的潛力，將廣泛用于臨床診斷、食品安全性和環(huán)境監(jiān)測等領域。