超聲聲學(xué)效應(yīng)在果蔬酚類化合物提取中的研究進(jìn)展

王鵬旭，成傳香，馬亞琴*，張 震，賈 蒙

（西南大學(xué)柑桔研究所，國家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712）

果蔬中的生物活性物質(zhì)對人體具有多種生理功能，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。由于果蔬中生物活性物質(zhì)具有含量少、易降解等特點(diǎn)，導(dǎo)致其提取難度大。因此，探究生物活性物質(zhì)的有效提取是加快其產(chǎn)業(yè)化、商業(yè)化的共識。傳統(tǒng)的提取方法有浸漬法、索氏提取法等，利用有機(jī)溶劑提取不僅增加生產(chǎn)成本，而且耗時長、耗能高，極易導(dǎo)致生物活性物質(zhì)的氧化和水解[1]。超聲輔助提取作為一種創(chuàng)新型提取技術(shù)，具有操作簡單、提取效率高、綠色環(huán)保、適用性廣等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室研究，進(jìn)而逐漸規(guī)?；?、工業(yè)化[2-4]。

超聲波在介質(zhì)中以縱波的形式傳輸，產(chǎn)生局部壓力的變化，導(dǎo)致介質(zhì)中存在的氣核形成空穴氣泡，空穴氣泡在達(dá)到一定尺寸時會變得不穩(wěn)定進(jìn)而崩塌，由此產(chǎn)生空化效應(yīng)[5-7]?？栈?yīng)被Thornycroft[8]于1895年首次發(fā)現(xiàn)，他發(fā)現(xiàn)水下螺旋槳的表面在相對短的運(yùn)行周期便會出現(xiàn)凹痕，發(fā)生腐蝕，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這是由于水動力產(chǎn)生的空穴氣泡破裂，在其附近產(chǎn)生強(qiáng)烈的壓力和溫度梯度造成的。1927年，Richards等[9]首次報(bào)道了超聲波的機(jī)械效應(yīng)和生物學(xué)效應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)空化效應(yīng)可能有利于促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)。1937年，Brohult[10]發(fā)現(xiàn)超聲波誘導(dǎo)的空化效應(yīng)會導(dǎo)致生物多聚物的降解。1963年，Lott等[11]首次將植物組織在超聲條件下連續(xù)處理提取植物中多種活性成分，發(fā)現(xiàn)提取效率明顯提高。21世紀(jì)初，超聲增強(qiáng)提取的機(jī)理通過超聲波破壞植物組織細(xì)胞壁、加快釋放內(nèi)含物被證明。同時，植物多酚有益于健康的特性加快了超聲提取技術(shù)應(yīng)用于植物活性物質(zhì)的研究。2004年，Herrera等[12]利用超聲從草莓中提取酚類化合物，結(jié)果表明超聲提取效率明顯優(yōu)于傳統(tǒng)浸提法和攪拌法，相比傳統(tǒng)浸提法（提取時間2～20 h），超聲提取僅需要90 s，這一結(jié)論與超聲波提取石榴皮中酚類化合物的研究結(jié)果[13]相似，超聲提取石榴皮中酚類化合物的提取時間縮短了90%，并且其抗氧化活性提高了24%。但溫度高于25 ℃的超聲條件下，草莓中酚類化合物會發(fā)生一定程度的降解。Sun Jianxia等[14]發(fā)現(xiàn)增加超聲功率（200～500 W）和延長提取時間（0～60 min）會促進(jìn)聲化學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生更多的羥自由基，導(dǎo)致花青素降解。因此，合理控制超聲波提取參數(shù)對酚類化合物的提取具有關(guān)鍵影響。Virot等[15]通過中心復(fù)合設(shè)計(jì)響應(yīng)面法對超聲參數(shù)（功率、溫度、時間）進(jìn)行優(yōu)化，并通過探索固液比、溶劑類型以及中試實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)超聲提取酚類化合物含量比傳統(tǒng)浸提法高20%，證明了規(guī)?；曁崛》宇惢衔锏目赡苄浴３曁崛≈饕蕾囉诳栈?yīng)，空化效應(yīng)作為超聲聲學(xué)效應(yīng)中最重要的效應(yīng)之一，已經(jīng)被廣泛研究報(bào)道。此外，超聲波還具有其他聲學(xué)效應(yīng)，包括毛細(xì)效應(yīng)、破碎效應(yīng)、湍動效應(yīng)等，這些效應(yīng)在提取過程中也發(fā)揮了一定作用，但是其作用機(jī)理尚不完全清楚，有待進(jìn)一步研究。

目前，在實(shí)驗(yàn)室層面開展了大量關(guān)于超聲提取技術(shù)的研究，已獲得的詳實(shí)數(shù)據(jù)表明超聲技術(shù)在未來有廣闊的應(yīng)用潛力和前景，而超聲聲學(xué)效應(yīng)在果蔬酚類化合物的提取中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，本文主要分析超聲聲學(xué)效應(yīng)在酚類化合物提取過程中可能產(chǎn)生的增強(qiáng)效果、降解反應(yīng)等，并探討超聲提取酚類化合物的規(guī)?；瘧?yīng)用以及未來的發(fā)展趨勢，從而為超聲波輔助提取的參數(shù)優(yōu)化、過程控制及其工業(yè)化應(yīng)用提供依據(jù)。

1 果蔬酚類化合物的分類及生物活性

酚類化合物廣泛分布于植物界，大約有8 000 種，作為植物的次級代謝物，其在植物體中承擔(dān)著防御及促進(jìn)生長發(fā)育的作用[16]。酚類化合物在果蔬中的存在形式有游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種，但以游離態(tài)酚類化合物的研究居多，結(jié)合態(tài)的酚類化合物經(jīng)常忽略不計(jì)，因此果蔬中總酚含量的實(shí)際值要高于測量值[17]。游離態(tài)酚類化合物具有一個或多個帶有羥基基團(tuán)的芳香環(huán)，主要分為黃酮類化合物、酚酸、單寧、芪類、木脂素等。其中，以黃酮類化合物種類繁多，迄今已鑒定分離出5 000多種黃酮類化合物[18]。黃酮類化合物主要分為黃酮、黃酮醇、黃烷酮、黃烷醇、異黃酮、花青素[19]，C6-C3-C6的三環(huán)骨架是黃酮類化合物的基本結(jié)構(gòu)[20-21]（圖1）。酚酸共有的化學(xué)結(jié)構(gòu)是苯環(huán)上連有的羧基官能團(tuán)，主要分為苯甲酸型酚酸（如對羥基苯甲酸和香草酸等）和苯乙烯型酚酸（如咖啡酸、芥子酸和阿魏酸等），其碳骨架的結(jié)構(gòu)特征為C6-C3和C6-C1[21-22]（圖2），咖啡酸是許多水果和蔬菜中含量最豐富的一種酚酸；另一種常見的酚酸是阿魏酸，它廣泛存在于谷物中[23]。酚類化合物主要來源于藍(lán)莓、葡萄、柑橘等果蔬，也可以從果蔬的副產(chǎn)物如葡萄酒中獲得[21-24]。果蔬中總酚含量取決于果蔬的成熟程度、氣候、土壤成分、貯藏條件等[25]。通常藍(lán)莓和葡萄中的酚類化合物的含量要高于香蕉、荔枝、芒果和柿子，如藍(lán)莓中總酚含量為261.95～929.62 mg/100 g[26]，而香蕉中的總酚含量為（90.4±3.2）mg/100 g[17]，芒果中的總酚含量則為（56.0±2.1）mg/100 g[27]。

圖1 常見的黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)[20-21]Fig. 1 Structures of common flavonoids[20-21]

圖2 苯甲酸型酚酸（A）和苯乙烯型酚酸（B）分子結(jié)構(gòu)[22-23]Fig. 2 Molecular structures of benzoic acid phenolic acids (A) and styrene phenolic acids (B)[22-23]

酚類化合物具有較強(qiáng)的生物活性，通過向自由基傳遞電子使其喪失氧化性，從而保護(hù)人體器官免受傷害，益于人體健康[28]。人體的炎癥是由于炎癥因子過度分泌造成的，從楊梅中提取分離的硫化酚類化合物可抑制腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6的分泌和脂多糖誘導(dǎo)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和環(huán)氧合酶-2蛋白的表達(dá)，對治療人體炎癥有一定的功效[29]。

酚類化合物的微生物代謝產(chǎn)物對人體也具有生物活性，可抑制泌尿致病性大腸桿菌ATCC?5350對T24上皮細(xì)胞的黏附能力[30]。利用超聲提取技術(shù)從甜菜中提取沒食子酸（gallic acid，GA）、氯化氰-3-葡萄糖苷（cyanide-3- glucoside，CGC）和表兒茶素，發(fā)現(xiàn)3 種物質(zhì)均具有較強(qiáng)的抗氧化性，GA的抗氧化活性最強(qiáng)，CGC對人體結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2、肝癌細(xì)胞HepG2和乳腺癌細(xì)胞MCF-7均有抑制作用，其抑制活性分別為94.86%、87.27%和67.13%[31]。柑橘中含有較為豐富的類黃酮，一定濃度的類黃酮對抑制A549人肺癌細(xì)胞的增殖具有關(guān)鍵作用，能顯著增加亞G1（凋亡細(xì)胞群）和G2/M期群體數(shù)量，造成細(xì)胞核凝聚和破碎，說明柑橘類黃酮在治療人類肺癌方面較為有效[32]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，不同柑橘品種中結(jié)合酚和游離酚對高血糖和高血壓相關(guān)酶的抑制作用不同，從檸檬中提取的酚類化合物對α-葡萄糖苷酶和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）的抑制活性為100%，但是，從柑橘中提取的結(jié)合酚的水解產(chǎn)物卻能誘導(dǎo)ACE和α-淀粉酶的活化，不利于人體健康[33]。黃海智[34]探究了楊梅酚類化合物對人鉑耐受型卵巢癌細(xì)胞A2780/CP70和OVCAR-3的抑制作用，發(fā)現(xiàn)GA、楊梅素和咖啡酸的抑制效果較好，有可能成為治療卵巢癌的天然活性物質(zhì)。除了以上所提到的生物活性外，最新研究結(jié)果表明酚類化合物還具有抗銀屑病[35]、抗乙酰膽堿酶活性[36]等。

2 超聲聲學(xué)效應(yīng)的作用機(jī)制

超聲提取技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于酚類化合物、色素、果膠等各種生物活性物質(zhì)的提取，其操作溫度低，避免了提取物的熱損傷，同時能較好地保持提取物的天然特性，適用于熱敏性物質(zhì)的提取。酚類化合物作為一種熱敏性物質(zhì)，超聲提取技術(shù)對其提取具有很好的應(yīng)用價值，提取過程中主要依靠超聲波在液體介質(zhì)中傳播所產(chǎn)生的極端理化條件。超聲波是一種振動波，在介質(zhì)中傳輸會產(chǎn)生一系列聲學(xué)效應(yīng)，包括物理效應(yīng)（振動、剪切力、壓力、微射流）和化學(xué)效應(yīng)（空化效應(yīng)、聲化學(xué)效應(yīng)），物理效應(yīng)具有破碎細(xì)胞壁和攪拌的作用，化學(xué)效應(yīng)具有加快反應(yīng)速率的作用。不同頻率的超聲波聲學(xué)效應(yīng)不同，20～100 kHz的超聲波中物理效應(yīng)占主導(dǎo)地位，100～1 000 kHz的超聲波中化學(xué)效應(yīng)占主導(dǎo)地位。

2.1 聲學(xué)效應(yīng)

聲學(xué)效應(yīng)是對超聲波提取機(jī)制的總稱，其中空化效應(yīng)被認(rèn)為是提取機(jī)制中的主要效應(yīng)。超聲波在液體中傳輸時會產(chǎn)生壓力起伏，壓力的變化被稱為超聲波的聲壓，聲壓分為正壓和負(fù)壓，當(dāng)負(fù)壓減小到某個閾值會產(chǎn)生空穴氣泡，空穴氣泡經(jīng)過形成、成長到最后崩塌的周期循環(huán)的動態(tài)變化，產(chǎn)生空化效應(yīng)（圖3）[37]?？栈?yīng)可分為穩(wěn)態(tài)空化和瞬態(tài)空化，穩(wěn)態(tài)空化中，穩(wěn)態(tài)氣泡在多個聲周期內(nèi)均衡振蕩，相對穩(wěn)定，產(chǎn)生微射流等物理現(xiàn)象；瞬態(tài)空化中，瞬態(tài)氣泡在整流擴(kuò)散或者聚結(jié)過程中生長達(dá)到共振尺寸，在單個或者更短的聲周期內(nèi)劇烈坍塌產(chǎn)生更多的子氣泡，這些子氣泡再次迅速崩塌，從而使原始?xì)馀萃耆螠?，在作用于提取液和固體基質(zhì)的交界處時會形成高溫（5 000 K）和高壓（100 MPa）環(huán)境，由此產(chǎn)生極端的物理化學(xué)環(huán)境[37-38]。高溫環(huán)境有助于提取物的溶解和擴(kuò)散，高壓環(huán)境有助于提取液的滲透和物質(zhì)轉(zhuǎn)移[39]。同時，超聲波在液體中給予質(zhì)點(diǎn)不同的加速度產(chǎn)生機(jī)械效應(yīng)，如振動波、微射流（速率可達(dá)400 km/h）、湍流等，也可促進(jìn)物質(zhì)的轉(zhuǎn)移[40]。

圖3 超聲聲學(xué)效應(yīng)的形成過程[37]Fig. 3 Formation process of ultrasonic acoustic effect[37]

但是，超聲波在提取過程中并非只有空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)。Toma等[41]用顯微鏡觀察超聲波對蔬菜組織的影響，發(fā)現(xiàn)其對蔬菜組織具有明顯的破碎作用。Tzanakis等[42]通過熔鋁實(shí)驗(yàn)證實(shí)了超聲波的毛細(xì)效應(yīng)。毛細(xì)效應(yīng)會促進(jìn)溶劑在物料組織中的擴(kuò)散及可溶性成分的溶解[43-45]。最近，有研究人員綜述了超聲聲學(xué)效應(yīng)對提取物料表現(xiàn)出的腐蝕效應(yīng)、聲孔效應(yīng)、剪切效應(yīng)、破碎效應(yīng)、聲毛細(xì)效應(yīng)等方面的研究[46]。腐蝕效應(yīng)會隨著自由基的產(chǎn)生對物料結(jié)構(gòu)造成腐蝕性的破壞；聲孔效應(yīng)可促進(jìn)細(xì)胞膜表面的微孔張大，使內(nèi)容物釋放；剪切效應(yīng)是空穴氣泡崩塌引發(fā)微射流產(chǎn)生的，可破壞物料組織表面的油腺結(jié)構(gòu)。其他如湍動效應(yīng)、界面效應(yīng)、微擾效應(yīng)等也發(fā)揮了一定作用[47]。上述各聲學(xué)效應(yīng)不僅單獨(dú)作用，在提取過程中也可能產(chǎn)生各種互作效應(yīng)。盡管各類報(bào)道中具體闡述了上述超聲提取效應(yīng)，但是，對于超聲提取效應(yīng)的概念界定、效應(yīng)區(qū)分（是物理效應(yīng)還是化學(xué)效應(yīng)）以及具體應(yīng)用方面的相關(guān)研究報(bào)道仍比較少，因此，探究超聲提取機(jī)理仍然是研究重點(diǎn)。

2.2 聲化學(xué)效應(yīng)

聲化學(xué)效應(yīng)是超聲波在介質(zhì)中傳輸時由氣泡崩塌引起的化學(xué)效應(yīng)。氣泡崩塌時溫度達(dá)5 000 K，可以破壞分子鍵，導(dǎo)致水分子分解形成H?和?OH，引發(fā)一系列的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)?，F(xiàn)已開發(fā)出多種方法量化聲化學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生的初級自由基的數(shù)量，包括對苯二酸法和碘化物法等，其中碘化物法常用于評估自由基的數(shù)量[48]。聲化學(xué)效應(yīng)可以通過聲化學(xué)反應(yīng)速率公式R＝KRM[R?]衡量，其中R表示聲化學(xué)反應(yīng)速率/（mol/（L·s）），M表示反應(yīng)物的濃度/（mol/L），[R?]表示空化效應(yīng)產(chǎn)生自由基的濃度/（mol/L），KR表示速率常數(shù)/（（mol/L）1－n/s）。因此控制聲化學(xué)反應(yīng)速率可以通過控制反應(yīng)物的濃度或者自由基的生成來實(shí)現(xiàn)[49]。自由基的生成依賴于空化效應(yīng)，減少介質(zhì)中溶解的氣體會顯著增強(qiáng)空化效應(yīng)[50]。Liu Liyan等[51]通過對比自來水和排氣水在超聲條件下的空化現(xiàn)象、能量波譜以及空化區(qū)域的具體分布，評估了溶液中氣體含量對空化強(qiáng)度的影響，結(jié)果表明，排氣水中空化區(qū)域分布更廣泛，且強(qiáng)度和廣度被顯著提高，溶液中氧氣質(zhì)量濃度在3.17～5.02 mg/L時有助于空化氣泡的產(chǎn)生。而且，在脫氣介質(zhì)中，超聲波衰減較小，氣泡的平衡尺寸由于整流擴(kuò)散而收縮，使得氣泡崩塌得更劇烈，從而產(chǎn)生更多的自由基；但是，增加初始反應(yīng)物濃度會降低自由基的產(chǎn)率[49]。

顆粒尺寸、表面粗糙程度和固體濃度對聲化學(xué)效應(yīng)的影響也至關(guān)重要，聲化學(xué)效應(yīng)的強(qiáng)度隨著固體濃度的增加先減少再逐漸增加，隨著顆粒尺寸和表面粗糙度的增加而增加[52]。另外，反應(yīng)物與氣泡崩塌所產(chǎn)生的自由基的碰撞概率可以通過影響反應(yīng)速率常數(shù)來影響聲化學(xué)效應(yīng)[49]。除上面所提到的因素外，液體高度[53]、換能器類型[54]、pH值[55]等因素也會影響聲化學(xué)效應(yīng)。聲化學(xué)效應(yīng)在一定程度上有利于活性物質(zhì)的提取，例如在芒果苷的提取中，聲化學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生的自由基在25 kHz頻率下要高于40 kHz，使得在25 kHz頻率下芒果苷的得率較高[56]。但是也需要在一定程度上抑制聲化學(xué)效應(yīng)，避免酚類化合物在超聲處理?xiàng)l件下羥基化，導(dǎo)致其抗氧化活性發(fā)生變化，一般建議在溶液中加入抗壞血酸或醇類物質(zhì)來猝滅?OH[57]。目前，大部分的研究集中在對所提取酚類化合物的生物活性物質(zhì)的鑒定以及針對不同提取物料優(yōu)化提取條件，有關(guān)聲化學(xué)效應(yīng)在酚類化合物提取中的研究較少，尤其是聲化學(xué)效應(yīng)對酚類化合物的增強(qiáng)效應(yīng)和降解效應(yīng)。

3 超聲聲學(xué)效應(yīng)對提取果蔬酚類化合物的影響

3.1 超聲增強(qiáng)作用

溶劑提取活性物質(zhì)通常包括兩個階段[58]：洗滌階段（快速提取階段）和擴(kuò)散階段（緩慢提取階段）（圖4）。在洗滌階段，提取速率恒定，溶劑滲透進(jìn)物料，使細(xì)胞質(zhì)直接暴露于溶劑，促進(jìn)活性物質(zhì)向溶劑中擴(kuò)散；在擴(kuò)散階段，植物活性成分直接從物料內(nèi)部擴(kuò)散并溶解在溶劑中，這一階段的提取速率取決于快速提取階段后細(xì)胞的完整性，細(xì)胞破碎程度越高，提取速率越快[59]。超聲波的機(jī)械效應(yīng)有助于洗滌階段溶劑的滲透，化學(xué)效應(yīng)有助于提高擴(kuò)散階段活性成分的轉(zhuǎn)移速率[60]。Chen Chao等[61]發(fā)現(xiàn)，超過90%的酚類化合物在前5 min被提取，10 min后其提取量逐漸趨于平穩(wěn)，表明提取過程主要在洗滌階段完成。另外，溶劑會在植物組織表面形成不動層，阻礙洗滌階段活性成分向溶劑中擴(kuò)散[58]。超聲波可提高細(xì)胞的破碎程度并打破物料表面的溶劑不動層，從而達(dá)到超聲增強(qiáng)提取的效果。相比傳統(tǒng)提取法，運(yùn)用超聲提取法從橙皮中提取酚類化合物的產(chǎn)量提升30%[62]。González-Centeno等[63]發(fā)現(xiàn)用傳統(tǒng)提取法在30～50 ℃下提取產(chǎn)量和超聲提取在20～35 ℃的提取產(chǎn)量無顯著差異（P＞0.05），結(jié)果表明，超聲提取可以在較低溫度下進(jìn)行，同時不降低提取速率。

圖4 提取過程中的洗滌階段和擴(kuò)散階段[58]Fig. 4 Washing and diffusion stages in the process of extraction[58]

超聲提取能顯著提高提取產(chǎn)量并縮短提取時間，但是，在提取過程中受到多重因素的影響，主要分為以下3 個方面：1）提取設(shè)備的影響，包括超聲功率、超聲頻率、超聲振幅、超聲時間等；2）提取介質(zhì)的影響，包括溫度、溶劑、固液比等；3）提取物料的影響，如微粒尺寸。

超聲功率誘導(dǎo)的剪切力可以改變物質(zhì)結(jié)構(gòu)從而提升提取效率，從橙皮中提取酚類化合物時，超聲功率對多酚的提取效率影響顯著，所優(yōu)化得到的超聲功率為150 W[64]；低頻率超聲波有利于打破細(xì)胞壁從而促進(jìn)可溶物的釋放，同時也有利于溶劑滲透進(jìn)細(xì)胞內(nèi)部，提高活性成分的轉(zhuǎn)移，通過比較不同頻率下從馬鈴薯中提取多酚的效率，發(fā)現(xiàn)較低的頻率（33 kHz）更有利于多酚的提取[65]。超聲波的振幅越高，細(xì)胞壁會被打碎得更加充分，用響應(yīng)面法從馬郁蘭中提取酚類化合物，結(jié)果表明超聲振幅對酚類化合物的提取影響最顯著，較高的超聲振幅會破壞細(xì)胞壁釋放酚類化合物進(jìn)入溶液，優(yōu)化的超聲振幅為58～61 μm[66]。超聲時間過長引發(fā)的熱效應(yīng)會造成酚類化合物的配糖鍵斷裂，從葡萄渣中提取總酚和總黃酮，提取時間顯著影響總酚含量，但對總黃酮含量影響不顯著，表明酚酸的結(jié)構(gòu)更易受到超聲時間的影響，優(yōu)化的提取時間為25 min[67]。

酚類化合物對高溫較為敏感，因此，選擇合適的溫度范圍就顯得尤為重要[60]，用Box-Behnken響應(yīng)面法從橘皮中提取酚類化合物，溫度在實(shí)驗(yàn)中作為獨(dú)立變量影響橙皮苷的提取，過高溫度會造成酚類化合物的降解，優(yōu)化的提取溫度為48 ℃[68]。提取溶劑的選擇作為影響提取效率的一個重要因素，需要全面考慮溶劑的特性（例如溶劑的極性、黏性、表面張力、蒸汽壓力）、目標(biāo)提取物的溶解性、極性、提取溶劑的安全性等。乙醇是較為安全的溶劑，但是過高的乙醇體積分?jǐn)?shù)對酚類化合物的提取有負(fù)面影響，因此選擇較低的乙醇體積分?jǐn)?shù)（61%）作為提取溶劑[69]。當(dāng)固液比較高時會形成較大的濃度差，有利于物質(zhì)的轉(zhuǎn)移[70]。從藍(lán)莓酒渣中提取酚類化合物和花青素，固液比極顯著影響花青素的產(chǎn)量（P＜0.01），優(yōu)化的固液比為21.70∶1[71]。

一般來說，較小的微粒尺寸有助于提高提取效率，這是因?yàn)槠淇梢蕴岣呶镔|(zhì)的轉(zhuǎn)移速率；然而，過小的微粒尺寸會使微粒漂浮在溶液表面，不利于超聲輻射，影響提取效率。Papoutsis等[72]從橘渣中提取橙皮苷和酚酸，微粒尺寸明顯影響咖啡酸和對香豆酸的含量，隨著微粒尺寸的減小（2.80～1.40 mm），咖啡酸、對香豆酸和橙皮苷的產(chǎn)率顯著增加（P＜0.05）；然而，微粒尺寸對綠原酸的產(chǎn)率影響不顯著。

以上著重介紹了超聲提取的增強(qiáng)優(yōu)勢以及影響超聲提取的因素，其中，超聲溫度、超聲時間、超聲功率和超聲頻率是最重要的影響因素，但這幾種超聲參數(shù)針對不同提取對象的重要性有所差異，即使同一超聲提取方法處理幾種酚酸，每種酚酸的最佳超聲條件也不同，這可能與物料特性、超聲波設(shè)備類型及超聲條件有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。部分超聲因素對酚類化合物的增強(qiáng)提取結(jié)果見表1，綜合比較得出超聲提取酚類物質(zhì)的最適工藝條件為：超聲溫度40 ℃、超聲時間30 min、超聲功率150 W、超聲頻率20 kHz。超聲提取能明顯提高提取效率，但是受內(nèi)外部因素的影響較大，各因素既可以獨(dú)立影響酚類化合物的提取效率，也可能會產(chǎn)生交互作用，這就需要對超聲因素進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面法是一種廣泛用于實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化的數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)工具，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中常用響應(yīng)面法對提取過程中各因素進(jìn)行分析[73]。超聲提取相比傳統(tǒng)提取法具有更多優(yōu)勢，但是在提取過程中，由于物料組織以及物料中酚類化合物種類的差異性，限制了超聲提取向規(guī)?；a(chǎn)的轉(zhuǎn)變。探索同性質(zhì)物料的規(guī)?；a(chǎn)以及模塊化超聲提取設(shè)備是未來超聲提取的發(fā)展趨勢。

表1 超聲對果蔬酚類化合物的增強(qiáng)提取Table 1 Summary of published studies on ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds from fruits and vegetables

3.2 超聲降解作用

圖5 咖啡酸在超聲條件下可能產(chǎn)生的降解產(chǎn)物[76]Fig. 5 Deduced degradation products of caffeic acid under ultrasonic conditions[76]

超聲在增強(qiáng)提取效果的同時，已有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過高溫或長時間的超聲處理酚類化合物的結(jié)構(gòu)易遭受自由基的破壞，引起酚類化合物的降解。超聲處理草莓汁后其花色苷含量和抗壞血酸含量分別降低3.2%和11%[74]，這可能是由于其結(jié)構(gòu)遭受自由基的攻擊所致。酚類化合物的結(jié)構(gòu)與其穩(wěn)定性密切相關(guān)，其芳香環(huán)上羥基的取代數(shù)量越多、甲氧基的取代數(shù)量越少，酚類化合物就越穩(wěn)定。在40 ℃、20 min的條件下超聲處理柑橘皮渣中的多酚，對香豆酸、對羥基苯甲酸以及咖啡酸均發(fā)生降解，對香豆酸和對羥基苯甲酸有一個羥基取代基，而咖啡酸有一個甲氧基取代基，這可能是酚類化合物之間發(fā)生多聚反應(yīng)的結(jié)果[75]。隨后，Qiao Liping等[76]對酚酸的降解展開進(jìn)一步探究，在模擬體系中，分析了超聲處理5 種酚酸的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)咖啡酸在－5 ℃時的降解速率是25 ℃時的7 倍，咖啡酸和芥子酸在－5～25 ℃下的降解動力學(xué)都符合零級動力學(xué)，通過傅里葉變換紅外光譜和電噴霧質(zhì)譜檢測法分析降解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)咖啡酸和芥子酸確實(shí)發(fā)生了分解反應(yīng)和多聚反應(yīng)（圖5、6）。最新的研究發(fā)現(xiàn)，咖啡酸和芥子酸在25～50 ℃條件下的降解仍然符合零級動力學(xué)，而且超聲對芥子酸具有更強(qiáng)的聲化學(xué)效應(yīng)[77]。

圖6 芥子酸在超聲條件下可能產(chǎn)生的降解產(chǎn)物[76]Fig. 6 Deduced degradation products of sinapic acid under ultrasonic conditions[76]

為進(jìn)一步分析黃酮類化合物在超聲條件下的穩(wěn)定性，選擇柑橘中具有代表性的14 種黃酮類化合物（圣草枸櫞酸苷、柚皮素蕓香苷、新橙皮苷、槲皮苷、圣草酚、香蜂草苷、柚皮素、木犀草素、橙黃酮、川陳皮素、橘皮素、柚皮苷、橙皮苷、槲皮素），經(jīng)過超聲處理后發(fā)現(xiàn)有13 種穩(wěn)定性良好，只有槲皮素在超聲處理中同時發(fā)生4 種反應(yīng)：氧化反應(yīng)、加成反應(yīng)、聚合反應(yīng)和分解反應(yīng)，初步鑒定8 種降解產(chǎn)物是以二聚體、醇加成物、氧化產(chǎn)物和分解產(chǎn)物形式存在的（圖7）[78]，這可能是自由基誘導(dǎo)產(chǎn)生的降解。

為探明聲學(xué)效應(yīng)的自由基對酚類化合物降解產(chǎn)生的影響，在低于21 ℃下對花青素單體矢車菊素-3-葡糖基蕓香苷進(jìn)行超聲處理，發(fā)現(xiàn)超聲明顯引起了矢車菊素-3-葡糖基蕓香苷降解，并導(dǎo)致其紫外-可見光譜、視覺顏色和抗氧化能力的變化；同時，矢車菊素-3-葡糖基蕓香苷的濃度與自由基的產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)，降解動力學(xué)符合一級動力學(xué)[79]。由表2可知，酚類化合物在超聲環(huán)境下易降解與介質(zhì)溫度和自由基關(guān)系密切，較低溫度如－5 ℃下，咖啡酸和芥子酸降解15%～20%，槲皮素降解約59%，這可能是低溫產(chǎn)生大量的自由基所致。雖然較高溫度不利于空化效應(yīng)的發(fā)生，減少了自由基的生成量，但是會引起酚類化合物的熱降解。因此，明確自由基與酚類化合物的劑量-效應(yīng)關(guān)系，對優(yōu)化評估超聲提取條件以及工業(yè)化生產(chǎn)具有一定意義。

圖7 槲皮素在超聲條件下可能產(chǎn)生的降解產(chǎn)物[78]Fig. 7 Deduced degradation products of quercetin under ultrasonic conditions[78]

表2 超聲對酚類化合物的降解作用Table 2 Degradation of phenolic compounds under ultrasonic conditions

4 超聲提取果蔬酚類化合物的工業(yè)化應(yīng)用

超聲應(yīng)用于食品加工輔助技術(shù)，具有高效率、低投資和綠色環(huán)保等特點(diǎn)，商業(yè)應(yīng)用前景廣泛，研制大型超聲提取設(shè)備是實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。超聲輔助提取設(shè)備主要有超聲浴設(shè)備（圖8A、B）和超聲探針設(shè)備（圖8C）兩類[80]，其中換能器（壓電類型和磁致伸縮類型）是超聲波工作的核心部件，換能器的位置、類型、功率強(qiáng)度影響提取效率和能量利用。超聲浴設(shè)備的換能器通常安置在超聲浴底部或者側(cè)部，優(yōu)點(diǎn)是避免直接接觸樣液，物料無污染；但缺點(diǎn)是超聲能量損耗多，降低了有效超聲功率[80]。超聲探針設(shè)備的探針直徑在5 mm～1.5 cm之間，一般由金屬鈦制成，可產(chǎn)生高強(qiáng)度的空化效應(yīng)，但是探針設(shè)備與樣液直接接觸易發(fā)生腐蝕和金屬粒脫落，引起物料污染。綜合考慮提取效率和能量損失，超聲探針設(shè)備優(yōu)于超聲浴設(shè)備[61]。

圖8 超聲浴設(shè)備（A、B）和超聲探針設(shè)備（C）[80]Fig. 8 Ultrasonic bath equipment (A and B) and ultrasonic probe equipment (C)[80]

超聲場會隨著傳播距離增長迅速衰減，并且?guī)缀醮蟛糠帜芰吭趽Q能器附近被消耗，很大程度上限制了超聲提取從實(shí)驗(yàn)室向工業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)變。Zhai Wei等[81]在液體中應(yīng)用正交超聲的方法，通過求解亥姆霍茲方程，發(fā)現(xiàn)3 束超聲的交互作用是可以實(shí)現(xiàn)的，且在三維超聲中，其最大聲壓是一維的6.4 倍，平均聲能密度是一維的15 倍，空化體積從一維的18%擴(kuò)大到三維的67%。目前，德國Hielscher公司、法國REUS公司和我國濟(jì)寧雙和超聲設(shè)備有限公司主要研制大型超聲提取設(shè)備。使用法國REUS公司生產(chǎn)的PEX3超聲浴設(shè)備進(jìn)行多酚的中試實(shí)驗(yàn)（圖9），提取容量為30 L，配備4 個超聲頻率25 kHz的超聲換能器，超聲功率為200 W，中試結(jié)果得到多酚產(chǎn)量比傳統(tǒng)浸提法高20%[15]。Pingret等[82]以水為提取溶劑，探究了超聲輔助水提取多酚的工業(yè)化應(yīng)用，結(jié)果表明多酚提取量（560 mg/100 g）比傳統(tǒng)浸提法提高了15%。Alexandru等[83]應(yīng)用一種多重超聲連續(xù)提取設(shè)備從干丁香花蕾中提取丁香油，使用乙醇溶液作為提取溶劑，功率強(qiáng)度為700 W/L，流動模式分別選擇450、900、1 350 mL/min，結(jié)果表明在1 350 mL/min流動模式下得到較高的總酚含量和抗氧化活性。超聲提取設(shè)備的不斷改進(jìn)提高了超聲能量的利用率，加速了超聲提取的工業(yè)化應(yīng)用。但是，超聲提取的過程較為復(fù)雜，在實(shí)驗(yàn)室中探索的條件與工業(yè)化應(yīng)用的條件呈非線性關(guān)系，仍然存在諸多問題，例如實(shí)驗(yàn)室與工業(yè)化應(yīng)用中超聲聲場的差異性、大規(guī)模生產(chǎn)中空化區(qū)域的分布、高強(qiáng)度超聲條件下超聲探針的腐蝕問題等，均尚待解決。

圖9 30 L PEX3超聲浴設(shè)備[15]Fig. 9 Thirty-liter ultrasonic bath equipment (PEX3)[15]

5 超聲技術(shù)提取果蔬酚類化合物的新趨勢

在酚類化合物的超聲提取中，一般要涉及到有機(jī)溶劑的使用，由于有機(jī)溶劑的安全性、污染性等問題，使得開發(fā)以水為溶劑的超聲提取方法引起廣泛關(guān)注[84]。水作為最環(huán)保的提取介質(zhì)，具有良好的理化性質(zhì)，在超聲波提取中已被研究[63,85]。為證明水作為提取溶劑的可靠性，Goldsmith等[86]運(yùn)用超聲波輔助提取法從橄欖渣中提取酚類化合物，利用響應(yīng)面法對超聲功率、提取時間和固液比3 因素進(jìn)行了優(yōu)化，得到最優(yōu)的提取條件為：超聲功率為250 W、提取時間75 min、固液比為1∶50，其總酚含量為19.71 mg/g、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼清除能力為31.23 mg/g，比傳統(tǒng)提取法總酚含量高20%。Papoutsis等[72]采用超聲輔助水提法從柑橘渣中提取橙皮苷和酚酸（對香豆酸、咖啡酸、綠原酸），分析了微粒尺寸、提取時間、提取溫度和超聲功率4 個參數(shù)對橙皮苷和3 種酚酸提取率的影響，發(fā)現(xiàn)微粒尺寸顯著影響對香豆酸、咖啡酸和橙皮苷的提取率，微粒尺寸為1.40 mm時，對香豆酸和咖啡酸的回收率最高（分別為0.25、0.58 mg/g）；微粒尺寸為2.00 mm和1.40 mm時，橙皮苷的提取率最高（分別為6.44、6.27 mg/g）；提取溫度對3 種酚酸的提取率無顯著影響，提取時間和超聲功率對酚類化合物的提取和抗氧化活性均無影響。除了超聲輔助水提法，還有一些新型提取方法，包括超聲負(fù)壓提取法[87]、超聲輔助水酶提取法[84]、超聲輔助離子液體提取法[88]。綜上可知，優(yōu)化以水為提取溶劑從果蔬中提取酚類化合物的參數(shù)不僅能提高提取率，更重要的是能保證提取物的安全性，因此，優(yōu)化以水為提取溶劑的超聲參數(shù)非常必要。

6 結(jié) 語

超聲輔助提取作為一種具有應(yīng)用前景的技術(shù)，已被國內(nèi)外廣泛報(bào)道。超聲波的聲學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)能夠引起植物細(xì)胞壁破碎，通過超聲清洗作用加快釋放內(nèi)含物，增強(qiáng)了提取效率。超聲輔助提取作為一種環(huán)境友好型技術(shù)，在提取過程中有助于降低能耗、減少污染，已對動物、植物、微生物等開展各類生物活性物質(zhì)提取的研究。酚類化合物作為植物的次級代謝物，具有各種生物活性，有益人體健康。利用超聲提取可使產(chǎn)率提高2～3 倍，有效縮短提取時間至30 min，很大程度上克服了傳統(tǒng)提取技術(shù)的缺點(diǎn)。但是酚類化合物具有熱不穩(wěn)定性，在提取過程中易發(fā)生降解，可通過優(yōu)化超聲參數(shù)有效控制降解，得到目標(biāo)酚類物質(zhì)。此外，超聲波的聲化學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生的自由基對酚類化合物的提取具有雙重作用，自由基過多會導(dǎo)致酚類化合物的降解，過少不利于酚類化合物的提取，超聲溫度、超聲時間、超聲頻率是影響自由基產(chǎn)量的重要參數(shù)，提取時可根據(jù)物料特性、設(shè)備類型、超聲參數(shù)有效范圍等全面考慮。此外，對自由基與酚類化合物之間的劑量-效應(yīng)關(guān)系的研究仍然較少，因此，關(guān)注超聲參數(shù)對自由基和酚類化合物產(chǎn)量的影響，探究選擇合適抗氧化劑消除自由基對酚類化合物的影響將是本領(lǐng)域的研究的難點(diǎn)和重點(diǎn)。近幾年，由于科技的發(fā)展、人們對健康的關(guān)注以及對交叉學(xué)科的重視，推進(jìn)了超聲提取技術(shù)聯(lián)合其他技術(shù)優(yōu)化提取效果的新趨勢如超聲負(fù)壓提取、超聲輔助水提取、超聲-微波或超聲-高壓聯(lián)合提取等的發(fā)展，這是對超聲輔助提取技術(shù)的升華和創(chuàng)新，也是研究人員追求最優(yōu)提取工藝、提高提取效率的體現(xiàn)。安全、優(yōu)質(zhì)、高效、環(huán)保必將是該領(lǐng)域未來的研究趨勢，也是實(shí)現(xiàn)超聲提取工業(yè)化的關(guān)鍵。