高溫脅迫對(duì)5種牧草生理生化特性的影響

李龍興，王志偉，陳 瑩

(1.貴州省草地技術(shù)試驗(yàn)推廣站，貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006)

高溫逆境脅迫使植物抵抗能力降低，生長(zhǎng)勢(shì)減弱，從而導(dǎo)致產(chǎn)量降低，品質(zhì)劣化[1]。鑒于高溫是制約牧草生長(zhǎng)的重要生態(tài)因子之一，不同牧草在高溫環(huán)境下都會(huì)表現(xiàn)出一定的適應(yīng)性，特別是通過(guò)一些內(nèi)在的生理和生化機(jī)制能夠抵御一定程度的高溫脅迫，如通過(guò)體內(nèi)細(xì)胞膜膜脂組分的變化、抗氧化系統(tǒng)對(duì)氧自由基的清除、熱激蛋白的合成以及滲透調(diào)節(jié)來(lái)減輕高溫對(duì)植物的傷害。

一年生黑麥草(Loliummultiflorum)適宜生長(zhǎng)在我國(guó)長(zhǎng)江流域以南地區(qū)，喜溫?zé)岷蜐駶?rùn)氣候，在晝夜溫度為27℃/12℃時(shí)，生長(zhǎng)最快，夏季炎熱則生長(zhǎng)不良，甚至枯死；高羊茅(Festucaelata)主要分布于廣西、四川、貴州，喜寒冷潮濕、溫暖的氣候，不耐高溫；鴨茅(Dactylisglomerata)原產(chǎn)歐、亞溫帶地區(qū)，在我國(guó)西南常見，喜溫暖、濕潤(rùn)的氣候，最適生長(zhǎng)溫度為10～28℃，30℃以上生長(zhǎng)緩慢；寬葉雀稗(Paspalumwetsfeteini)在我國(guó)西南、華南地區(qū)均有栽培，喜高溫多雨的氣候，在我國(guó)南亞熱帶地區(qū)四季常青，夏秋季節(jié)生長(zhǎng)最茂盛；百喜草(Paspalumnotatum)原產(chǎn)美洲，適宜于熱帶和亞熱帶地區(qū)，耐旱、耐熱性較好。

為了進(jìn)一步揭示貴州地區(qū)常見牧草對(duì)高溫脅迫的適應(yīng)性，選擇以上5種牧草品種，通過(guò)模擬高溫脅迫，測(cè)定、分析超氧化物岐化酶活性(SOD)、過(guò)氧化物酶活性(POD)、丙二醛含量(MDA)、可溶性蛋白含量(SP)、谷胱甘肽含量(GSH)和葉綠素相對(duì)含量(SPAD值)的變化規(guī)律。旨在探討高溫脅迫對(duì)不同牧草生理生化特性的影響，以期為貴州地區(qū)牧草種植及品種的選育提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用高羊茅、鴨茅、一年生黑麥草、寬葉雀稗、百喜草種子由貴州省草業(yè)研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

分別選取飽滿的5種牧草種子200粒種植在塑料盆內(nèi)，每個(gè)品種9盆，pH值5.32，有機(jī)質(zhì)21.3 g/kg，水解氮75.2 mg/kg，速效磷12.48 mg/kg、速效鉀126.1 mg/kg，置于室外培養(yǎng)2個(gè)月后，選擇長(zhǎng)勢(shì)良好、形態(tài)大小一致的植株移入生化培養(yǎng)箱，在23℃/20℃(7∶00～19∶00/19∶00～7∶00)條件下預(yù)處理一周，在處理期間保證適宜的光照強(qiáng)度和水分，空氣濕度76%～80%，預(yù)處理結(jié)束后，設(shè)置38℃/30℃(7∶00～19∶00/19∶00～7∶00)進(jìn)行高溫脅迫，分別在0、24、48、72 h選取形態(tài)均勻一致的完整葉片，測(cè)定SOD、POD活性，MDA、SP、GSH含量和葉綠素含量(SPAD值)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

SOD活性采用氮藍(lán)四唑光還原法[2]；POD活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚顯色法，加入反應(yīng)體系后以每分鐘吸光度變化(D470 nm)變化0.01為一個(gè)過(guò)氧化物酶活力單位[2]；MDA含量采用硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定[3]；SP的含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法；GSH含量測(cè)定參照劉萍的方法[4]；葉綠素含量用HM-YB葉綠素測(cè)定儀測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析并作圖，用SPSS軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫下不同牧草SOD活性的變化

隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，5種牧草SOD呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)(圖1)。脅迫48 h后，5種牧草SOD活性均達(dá)到最大值，之后開始下降。百喜草和寬葉雀稗SOD活性在高溫脅迫過(guò)程中明顯高于一年生黑麥草、鴨茅和高羊茅。

圖1 高溫脅迫下不同牧草的SOD活性Fig.1 Changes of SOD activity of different forages under high temperature stress

2.2 高溫脅迫下不同牧草POD活性的變化

高溫脅迫下，POD活性先增加后降低，呈現(xiàn)與SOD活性相似的變化趨勢(shì)(圖2)。高溫脅迫24 h，5種牧草POD活性均達(dá)到最大值，POD活性強(qiáng)弱順序?yàn)椋簩捜~雀稗(116.12 U/mL)>百喜草(115.0 U/mL)>高羊茅(104.3 U/mL)>一年生黑麥草(102.5 U/mL)>鴨茅(96.0 U/mL)，高溫脅迫24 h后，POD活性均迅速下降。

圖2 高溫脅迫下不同牧草的POD活性Fig.2 Changes of POD activity of different forages under high temperature stress

2.3 高溫脅迫下不同牧草MDA含量的變化

隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，5種牧草的MDA含量持續(xù)上升(圖3)，脅迫72 h后，高羊茅、鴨茅、一年生黑麥草、寬葉雀稗和百喜草MDA含量比對(duì)照組分別增加了93.6%、52.4%、52.7%、57.8%和58.8%。其中，寬葉雀稗和百喜草的MDA含量低于高羊茅、鴨茅和一年生黑麥草。

圖3 高溫脅迫下不同牧草的MDA含量Fig.3 Changes of MDA content in different forages under high temperature stress

2.4 高溫脅迫下不同牧草GSH含量的變化

不同牧草GSH含量在高溫脅迫下均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)(圖4)。脅迫24 h，5種牧草GSH含量均達(dá)到最大值，高羊茅、鴨茅、一年生黑麥草、寬葉雀稗和百喜草GSH含量分別為15.3、16.3、14.1、14.6和15.5 μg/g FW，脅迫24 h之后GSH含量開始下降。

圖4 高溫脅迫下不同牧草的GSH含量Fig.4 Changes of GSH content in different forages under high temperature stress

2.5 高溫脅迫下不同牧草SP含量的變化

隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，5種牧草SP含量呈先升高后降低趨勢(shì)(圖5)。高羊茅、鴨茅和一年生黑麥草SP含量在高溫脅迫24 h達(dá)到最大值，而百喜草和寬葉雀稗SP含量在高溫脅迫48 h后達(dá)到最大值，之后開始下降，且下降不明顯。在整個(gè)高溫脅迫過(guò)程中，寬葉雀稗和百喜草的SP含量高于鴨茅、高羊茅和一年生黑麥草。

圖5 高溫脅迫下不同牧草的SP含量Fig.5 Changes of soluble protein content in different forages under high temperature stress

2.6 高溫脅迫下不同牧草葉綠素含量的變化

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素，含量越高，其光合作用能力越強(qiáng)。在整個(gè)高溫脅迫過(guò)程中，5種不同牧草品種的葉綠素含量均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，在高溫脅迫72 h后，高羊茅、鴨茅、一年生黑麥草、寬葉雀稗和百喜草葉綠素含量分別下降了17.9%、17.3%、13.3%、14.8%和14.2%(圖6)。

圖6 高溫脅迫下不同牧草的葉綠素含量Fig.6 Changes of chlorophyll content in different forages under high temperature stress

3 討論

植物在正常的生長(zhǎng)條件下，體內(nèi)各項(xiàng)生理代謝活動(dòng)都處于穩(wěn)定平衡狀態(tài)，當(dāng)受到逆境脅迫時(shí)，植物體內(nèi)代謝活動(dòng)都會(huì)受到影響[5]。試驗(yàn)表明，逆境條件下植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，ROS的積累會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生有害作用，植物膜系統(tǒng)受損，造成膜脂過(guò)氧化[6-7]，MDA是膜脂過(guò)氧化作用的產(chǎn)物，MDA含量增加則是膜脂過(guò)氧化的表現(xiàn)，其含量高低是衡量細(xì)胞膜脂損傷程度的一個(gè)重要指標(biāo)，與植物的抗逆性成負(fù)相關(guān)[8]。但在一定程度上，植物活細(xì)胞可以通過(guò)啟動(dòng)抗氧化酶系統(tǒng)來(lái)防御這種毒害作用，其主要表現(xiàn)就是SOD、CAT和POD等的含量和活性會(huì)迅速增強(qiáng)?？寡趸缚梢詼p少羥基自由基，避免植物膜系統(tǒng)遭到破壞，從而保護(hù)細(xì)胞膜的完整性[9]。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，5種不同牧草品種的SOD和POD活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，MDA含量持續(xù)上升。說(shuō)明在高溫脅迫初期激發(fā)了SOD和POD的活性，阻止或減少膜脂過(guò)氧化作用，因此MDA的含量較低，增強(qiáng)了牧草對(duì)高溫的適應(yīng)能力。但是隨著高溫脅迫時(shí)間的持續(xù)，SOD和POD活性明顯下降，發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用，從而導(dǎo)致MDA含量大幅上升。

GSH是植物中重要的抗氧化劑和還原緩沖劑，參與活性氧的鈍化代謝過(guò)程[11]。植物體內(nèi)谷胱甘肽水平的提高不僅與植物對(duì)環(huán)境脅迫的忍耐有關(guān)，而且谷胱甘肽合成的增強(qiáng)可能是植物對(duì)環(huán)境脅迫的內(nèi)在響應(yīng)之一[12]。植物在逆境脅迫下，谷胱甘肽還原酶活性(GR)升高，產(chǎn)生谷胱甘肽抗氧化物質(zhì)來(lái)清除活性氧和氧自由基，從而減緩和抵抗對(duì)細(xì)胞的傷害。研究中5種牧草谷胱甘肽含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，表明受到高溫脅迫時(shí)，谷胱甘肽還原酶活性升高，谷胱甘肽含量增加，植物通過(guò)提高自身的防御能力來(lái)應(yīng)對(duì)高溫脅迫。但是高溫脅迫增強(qiáng)到一定程度時(shí)，酶的活性降低，谷胱甘肽的合成受到抑制，谷胱甘肽水平降低，導(dǎo)致植物防御能力的減弱。

逆境脅迫下，植物細(xì)胞蛋白酶的活性受到抑制，蛋白質(zhì)合成受阻，但是植物通過(guò)應(yīng)激反應(yīng)可以誘導(dǎo)合成新的蛋白質(zhì)，即熱激蛋白(HSP)，這些熱激蛋白可以顯著提高植物的抗性[13]。試驗(yàn)在高溫脅迫中，5種牧草可溶性蛋白含量呈先升高后降低趨勢(shì)，表明隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，植物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)合成新的蛋白質(zhì)來(lái)抵御遭受的高溫脅迫傷害，表現(xiàn)出可溶性蛋白含量上升。其中，高羊茅、鴨茅和一年生黑麥草在高溫脅迫24 h達(dá)到最大值，百喜草和寬葉雀稗在48 h達(dá)到最大值，之后可溶性蛋白含量均開始下降。表明高羊茅、鴨茅和一年生黑麥草對(duì)高溫脅迫適應(yīng)能力較弱，脅迫24 h體內(nèi)酶的活性開始受到抑制，蛋白質(zhì)合成速率下降。高羊茅、鴨茅和一年生黑麥草高溫脅迫48 h后可溶性蛋白含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但是下降幅度較小，表明對(duì)高溫脅迫適應(yīng)能力相對(duì)較強(qiáng)，因此，在高溫脅迫下蛋白質(zhì)含量相對(duì)穩(wěn)定，在高溫下依然可以維持一定的正常代謝。

葉綠素含量的高低在一定程度上可以反映植物光合作用的能力[14]。研究中5種牧草葉綠素含量均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，表明高溫脅迫下，葉綠體結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致葉綠素含量顯著下降。在高溫脅迫下，寬葉雀稗和百喜草的SPAD值高于高羊茅、鴨茅和一年生黑麥草。葉片中葉綠素含量越高，表面光合作用能力越強(qiáng)，牧草生長(zhǎng)健康，抵抗力越強(qiáng)，所以寬葉雀稗和百喜草對(duì)高溫脅迫適應(yīng)能力較好[15]。研究結(jié)果表明，在高溫脅迫過(guò)程中，葉綠素含量持續(xù)減少，SPAD值顯著下降，高溫脅迫引起葉綠素分解，誘發(fā)葉片衰老，破壞植物光合作用[16-17]。

4 結(jié)論

高溫脅迫下，5種牧草的超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)活性、可溶性蛋白含量(SP)和谷胱甘肽含量(GSH)均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，丙二醛含量(MDA)持續(xù)上升，葉綠素含量(SPAD)呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)。百喜草和寬葉雀稗對(duì)高溫脅迫適應(yīng)能力明顯強(qiáng)于一年生黑麥草、鴨茅和高羊茅。