接種紅色熒光蛋白標(biāo)記根瘤菌對(duì)苜蓿幼苗生長(zhǎng)及結(jié)瘤能力的影響

楊曉玫，師尚禮，姚 拓，呂丹彤，李 琦，李 東，楊芮淇，謝華山

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

紅色熒光蛋白(Red Fluorescent Protein,RFP)為一種發(fā)光蛋白，1999年首次被報(bào)道[1]，其發(fā)射波長(zhǎng)較長(zhǎng)，最大吸收波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)分別為558 nm和583 nm，在紫外線的照射下可直接發(fā)射紅色熒光，其靈敏度比綠色熒光蛋白(GFP)及青色熒光蛋白(CFP)高，是基于GFP和CFP的一種優(yōu)良穩(wěn)定的熒光蛋白[2]。利用大腸桿菌DH5a法和三親本雜交法成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)的RFP熒光標(biāo)記根瘤菌[3]，適度增加了熒光資源，可對(duì)不同顏色熒光質(zhì)粒蛋白同時(shí)多部位標(biāo)記[4-5]。豆科植物固氮效率的高低直接由豆科植物與根瘤菌兩者之間基因的相容性決定[6]，田間接種根瘤菌后，土著根瘤菌必然會(huì)與外源根瘤菌在生長(zhǎng)空間，土壤營(yíng)養(yǎng)及宿主植物等方面進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，其競(jìng)爭(zhēng)能力的大小直接影響接種的根瘤菌能否正常結(jié)瘤[7]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)RFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入苜蓿根瘤菌的研究鮮為報(bào)道，已有cfp基因成功導(dǎo)入苜蓿根瘤菌中，并有明顯的促生效果[8]。為檢測(cè)RFP質(zhì)粒標(biāo)記后的根瘤菌能否成功侵染苜蓿根系并結(jié)瘤，將含有RFP質(zhì)粒穩(wěn)定表達(dá)的熒光標(biāo)記根瘤菌接種于紫花苜蓿(Medicagosativa)，觀察導(dǎo)入的rfp質(zhì)粒在苜蓿植物體內(nèi)能否正常表達(dá)，并通過(guò)測(cè)定回接植株的生物量，結(jié)瘤特性和占瘤率探討優(yōu)良紅色熒光標(biāo)記株的熒光蛋白表達(dá)能力，為研究根瘤菌結(jié)瘤固氮能力及根瘤菌與土著菌消長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

盆栽試驗(yàn)種子發(fā)芽率90.6%、甘農(nóng)5號(hào)和WL3436HQ紫花苜蓿凈度為98.5%，均來(lái)自草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

試驗(yàn)培養(yǎng)基參照袁全等[9]的方法配制TY(Yeast Tryptone Agar)、參照殷愛華等[10]的方法配制YMA培養(yǎng)基，Hoagland無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液[11]。

出發(fā)菌為課題組篩選的高效根瘤菌RhizobiummelilotiGN5(S.LZgn5)、Sinorhizobiummeliloti343(S.LH3436)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物保藏中心的苜蓿中華根瘤菌標(biāo)準(zhǔn)菌Sinorhizobiummeliloti12531(S.12531)。

苜蓿幼苗接菌RFP基因質(zhì)粒熒光標(biāo)記根瘤菌菌株：S.LZgn5-rfp2，S.12531-rfp4、S.LH343-rfp3。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子表面滅菌 取出5粒滅菌甘農(nóng)5號(hào)和WL343HQ苜蓿種子，用無(wú)菌水在滅菌三角瓶中將種子洗滌2次，75%的乙醇浸泡3 min，并用無(wú)菌水清洗4次。0.1%的HgCl2浸泡3 min，清洗4次。為檢測(cè)種子表面是否徹底滅菌，將之前的滅菌種子放于YMA培養(yǎng)基，觀察有無(wú)菌長(zhǎng)出。

1.2.2 種子發(fā)芽處理 取表面滅菌的供試品種種子均勻置于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙上，加入5 mL無(wú)菌水28℃避光培養(yǎng)，適時(shí)補(bǔ)充水分，待其發(fā)芽后選取發(fā)芽狀況一致的種子備用。實(shí)驗(yàn)塑料杯(6 cm×7.5 cm)用75%乙醇處理后杯底扎眼，供給后期苜蓿的生長(zhǎng)從下而上的營(yíng)養(yǎng)液。高溫滅菌沙培沙子3 h，150℃高溫持續(xù)烘干6 h，冷卻后分別裝于塑料杯中，每標(biāo)250 g，分別取20粒發(fā)芽種子均勻放于每杯中并覆沙20 g。

1.2.3 制備及接種菌液 分別用接種環(huán)轉(zhuǎn)接苜蓿根瘤菌及熒光標(biāo)記菌至100 mL YMA液體培養(yǎng)基中，28℃、120 r/min培養(yǎng)，定期檢測(cè)其D600 nm值，待值達(dá)到0.5～0.8時(shí)結(jié)束培養(yǎng)備用。

采用每菌株4次重復(fù)隨機(jī)區(qū)組[12]進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，并設(shè)置不接菌處理作為對(duì)照。幼苗長(zhǎng)出第一片真葉時(shí)，開始在白色培養(yǎng)盤中加入Hoagland無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液。轉(zhuǎn)移已培養(yǎng)好的菌液至離心管離心，去上清留沉淀，加入等體積的無(wú)菌水，混合震蕩，每個(gè)盆栽表面分別澆灌20 mL。水分和營(yíng)養(yǎng)液需在幼苗生長(zhǎng)的整個(gè)過(guò)程中補(bǔ)充及時(shí)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.3.1 苜蓿幼苗生長(zhǎng)指標(biāo) 苜蓿幼苗生長(zhǎng)至第46 d，從杯中取出苜蓿幼苗及沙，沖洗干凈至根系完整分開，濾紙及時(shí)吸干表面水分。

(1)直尺測(cè)量苜蓿苗的株高和根長(zhǎng)；(2)計(jì)數(shù)不同處理苜蓿葉片數(shù)；(3)采用描形稱重法[13]測(cè)定苜蓿葉片葉面積，選取植株從下往上第二個(gè)分枝中間的葉片3次重復(fù)；(4)分析天平分別稱量不同處理苜蓿幼苗地上鮮重和根鮮重，3次重復(fù)并記數(shù)；稱鮮重后放于烘箱110℃處理20 min，隨后立即80℃連續(xù)烘干12 h后稱其干重。

1.3.2 苜蓿固氮能力指標(biāo)測(cè)定 (1)測(cè)定苜蓿幼苗單株結(jié)瘤數(shù)；(2)參照李劍峰等[14]5分制的方法劃分根瘤等級(jí)；(3)測(cè)定苜蓿幼苗根瘤固氮酶活性，采用乙炔還原法[15]；切下根系兩端0.5 cm處根瘤，并稱0.1 g鮮重，放于17 mL西林瓶中，并放入濕潤(rùn)的濾紙片，蓋瓶塞并密封，3次重復(fù)處理，用微量2 mL無(wú)菌注射器抽出1.7 mL瓶?jī)?nèi)空氣，并注入1.7 mL乙炔氣體，使其終濃度為10%。室溫下反應(yīng)1 h后，以100 μL進(jìn)樣器抽取西林瓶?jī)?nèi)氣體50 μL，用GC-7890F氣相色譜儀測(cè)定各處理在1 h內(nèi)生成的乙烯氣體含量(μmol)，參照譚志遠(yuǎn)等[16]的方法計(jì)算植株根瘤的固氮酶活性(μmol/(h·g)；(4)苜蓿幼苗單株根瘤占瘤率的檢測(cè)。常規(guī)方法用滅菌培養(yǎng)皿收集所有根瘤，用熒光顯微鏡觀察表面滅菌的處理的苜蓿幼苗根瘤，熒光標(biāo)記株侵染產(chǎn)生紅色熒光[17]。篩選出固氮酶活性高、占瘤率高且熒光蛋白表達(dá)能力高，同時(shí)增加苜蓿植株生物量的熒光標(biāo)記菌株苜蓿幼苗。

1.3.3 測(cè)定苜蓿幼苗葉綠素含量 苜蓿幼苗葉片葉綠素含量的測(cè)定參照鄒琦等[18]的方法，為取苜蓿幼苗各處理長(zhǎng)勢(shì)甚微從上往下第2個(gè)分枝的苜蓿葉片，并稱取0.1 g剪碎，放于離心管中按方法步驟測(cè)定并計(jì)算葉綠素含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果單因素方差用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析[19]，數(shù)據(jù)的多重性用Duncan法比較，圖表均用Excel 2007制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 RFP熒光標(biāo)記菌對(duì)2個(gè)苜蓿品種幼苗生物量的影響

生物量的大小通過(guò)其積累物質(zhì)能力強(qiáng)弱充分反映，甘農(nóng)5號(hào)苜蓿幼苗接種根瘤菌和接種紅色熒光標(biāo)記根瘤菌后苜蓿幼苗根鮮重及干重、地上部分鮮重及干重均高于未接種的處理。其中，接種S.LH3436、S.12531、S.LZgn5、S.LH3436-rfp3、S.12531-rfp4和S.LZgn5-rfp2的苜蓿幼苗根鮮重高出對(duì)照15%～77%，根干重高出對(duì)照92%～66%，地上鮮重高出對(duì)照23%～58%，地上干重高出對(duì)照18%～78%，均具有顯著差異(P<0.05),表明S.LH3436、S.12531、S.LZgn5及其紅色熒光標(biāo)記根瘤菌具有一定的促生作用(表1)。

接種S.LH3436-rfp3，S.12531-rfp4和S.LZgn5-rfp2的甘農(nóng)5號(hào)苜蓿幼苗根鮮重、根干重、地上鮮重和地上干重分別比接種對(duì)應(yīng)根瘤菌S.LH3436，S.12531和S.LZgn5高出2.6%～12.4%，3.2%～13.5%、1.4%～10.2%和1.8%～5.7%，差異均不顯著(P<0.05)，表明接種紅色熒光標(biāo)記菌與接種對(duì)應(yīng)根瘤菌相比無(wú)顯著影響，而與未接種對(duì)照相比生物量的增加有明顯促進(jìn)效果，其中S.12531- rfp4表現(xiàn)較好。

表1 甘農(nóng)5號(hào)苜蓿幼苗接種根瘤菌及紅色熒光標(biāo)記根瘤菌的生物量

注：CK表示未進(jìn)行接種處理，同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).下同

苜蓿幼苗WL343HQ在接種紅色熒光標(biāo)記根瘤菌后生物量均明顯提高。其中，苜蓿幼苗根鮮重及干重、地上鮮重及干重分別高出對(duì)照33%～73%、92.5%～98.2%、40%～73.4%和53.2%～90.1%，差異均顯著(P<0.05)。與接種對(duì)應(yīng)根瘤菌相比，苜蓿幼苗接種S.12531-rfp4后的根鮮重及干重、地上鮮重及干重分別增加了0.42%、9.2%、2%和12%，而接種S.LH3436-rfp3和S.LZgn5-rfp2后的苜蓿幼苗根干鮮重和地上干鮮重有甚微減少，但無(wú)顯著差異，表明苜蓿幼苗WL343HQ接種紅色熒光標(biāo)記根瘤菌后，不同標(biāo)記根瘤菌的表現(xiàn)均無(wú)顯著差異，其中S.LH3436-rfp3表現(xiàn)較好(表2)。

表2 WL343HQ苜蓿幼苗接種根瘤菌及紅色熒光標(biāo)記根瘤菌的生物量

2.2 熒光標(biāo)記菌及對(duì)應(yīng)出發(fā)菌株對(duì)兩品種苜蓿幼苗根長(zhǎng)、株高等的影響

根長(zhǎng)、株高、葉片數(shù)和葉面積直接影響著植株的生物量高低。甘農(nóng)5號(hào)苜蓿幼苗接種紅色熒光標(biāo)記菌后，增加了苜蓿幼苗根長(zhǎng)、株高、葉片數(shù)及葉面積的大小，并有顯著差異(P<0.05)，其分別高出未接種對(duì)照的24.9%～50.4%、30.3%～57.7%、26.5%～44.6%和12%～14.5%。

甘農(nóng)5號(hào)苜蓿幼苗接種S.LH3436-rfp3，S.12531-rfp4和S.LZgn5-rfp2后相比接種對(duì)應(yīng)出發(fā)菌，接種熒光紅色熒光標(biāo)記根瘤菌苜蓿幼苗的根長(zhǎng)、株高、葉片數(shù)和葉面積分別高出3%、7.2%、3.66%和4.6%，無(wú)顯著差異，但接種紅色熒光標(biāo)記苜蓿幼苗的根長(zhǎng)高出未接種幼苗的19.7%，差異顯著(P<0.05)。其中，S.12531-rfp3表現(xiàn)較好(表3)。

苜蓿幼苗WL343HQ在接種紅色熒光標(biāo)記菌后，幼苗根長(zhǎng)、株高、葉片數(shù)和葉面積均有增加(表4)，分別高出未接種處理9.2%～48.7%、43.3%～69.9%、18.2%～28.6%和16.1%～24%，有顯著差異(P<0.05)。甘農(nóng)5號(hào)苜蓿幼苗接種S.LH3436-rfp3，S.12531-rfp4和S.LZgn5-rfp2后的幼苗根長(zhǎng)、株高、葉片數(shù)和葉面積分別比接種對(duì)應(yīng)根瘤菌的出發(fā)菌高出13%、15.1%、11.1%和2.1%，但接種紅色熒光質(zhì)粒的苜蓿幼苗根長(zhǎng)高出對(duì)照的12.5%，差異顯著(P<0.05)。其中，以S.LH3436-rfp3表現(xiàn)較好(表4)。

2.3 熒光標(biāo)記菌及其出發(fā)菌株對(duì)兩品種苜蓿幼苗固氮能力的影響

測(cè)定苜蓿根瘤固氮酶活性的高低是確認(rèn)有效根瘤菌的傳統(tǒng)方法，直接反映苜蓿幼苗根瘤中根瘤菌固氮的能力強(qiáng)弱。甘農(nóng)5號(hào)苜蓿幼苗接種紅色熒光標(biāo)記根瘤菌S.LH3436-rfp3，S.12531-rfp4和S.LZgn5-rfp2和接種對(duì)應(yīng)根瘤菌的苜蓿幼苗單株結(jié)瘤數(shù)、根瘤固氮酶活性和根瘤等級(jí)均與未接種對(duì)照差異顯著(P<0.05)，其中，幼苗根瘤固氮酶活性是未接種處理的9.1～12.2倍，表明接種紅色熒光標(biāo)記根瘤菌能增加根瘤的固氮酶活性，并和接種對(duì)應(yīng)根瘤菌無(wú)顯著影響，以S.LZgn5-rfp2表現(xiàn)較好(表5)。

表3 甘農(nóng)5號(hào)苜蓿幼苗接種紅色熒光標(biāo)記菌后的根長(zhǎng)、株高、葉片數(shù)和葉面積

表4 WL343HQ苜蓿幼苗接種紅色熒光標(biāo)記菌后的根長(zhǎng)、株高、葉片數(shù)和葉面積

表5 甘農(nóng)5號(hào)苜蓿幼苗接種紅色熒光標(biāo)記菌的的單株結(jié)瘤數(shù)、固氮酶活性、根瘤等級(jí)和標(biāo)記菌占瘤率

注：占瘤率參照文獻(xiàn)[24]方法與50%進(jìn)行比較，即50%為對(duì)照，對(duì)照的顯著水平為50%a

苜蓿幼苗WL343HQ接種紅色熒光標(biāo)記根瘤菌和接種對(duì)應(yīng)根瘤菌后，幼苗WL343HQ相應(yīng)的單株結(jié)瘤數(shù)、根瘤固氮酶活性和根瘤等級(jí)均與未接種處理差異顯著(P<0.05)，其中，根瘤固氮酶活性是未接種的5.1～12倍，試驗(yàn)表明苜蓿幼苗接種紅色熒光標(biāo)記根瘤菌能顯著提高根瘤的固氮酶活性，并與接種對(duì)應(yīng)根瘤菌無(wú)顯著差異。其中，以S.LH3436-rfp3固氮酶活性最高的表現(xiàn)好。

2.4 熒光標(biāo)記菌及其出發(fā)菌株對(duì)兩品種苜蓿幼苗葉綠素的含量

葉綠素含量的高低反應(yīng)了光合作用的強(qiáng)弱，也體現(xiàn)了植株利用氮素能力的強(qiáng)弱，RFP熒光標(biāo)記菌分別接種的甘農(nóng)5號(hào)紫花苜蓿的葉片葉綠素含量比對(duì)照高出40.2%～51.2%，差異顯著(P<0.05)，苜蓿幼苗接種紅色熒光標(biāo)記根瘤菌及接種對(duì)應(yīng)根瘤菌的葉綠素含量顯著高于未接種處理苜蓿(圖1)，但接種熒光標(biāo)記根瘤菌與接種對(duì)應(yīng)根瘤菌的苜蓿幼苗之間葉綠素含量無(wú)顯著差異。

表6 WL343HQ苜蓿幼苗接種紅色熒光標(biāo)記菌的的單株結(jié)瘤數(shù)、固氮酶活性、根瘤等級(jí)和標(biāo)記菌占瘤率

圖1 紅色熒光標(biāo)記菌接種甘農(nóng)5號(hào)苜蓿幼苗后的葉片葉綠素含量Fig.1 Red fluorescent tags bacteria after inoculation of gannongno.5 after seedling leaf chlorophyll content

RFP熒光標(biāo)記菌分別接種的紫花苜蓿S.12531的葉片葉綠素含量比對(duì)照高出38.2%～47.6%，差異顯著(P<0.05)。出發(fā)菌和熒光標(biāo)記根瘤菌的葉綠素含量顯著高于未接種苜蓿，而出發(fā)菌和熒光標(biāo)記根瘤菌之間葉綠素含量無(wú)顯著影響(圖2)。

3 討論

3.1 兩個(gè)苜蓿品種接種根瘤菌及紅色熒光標(biāo)記根瘤菌生物量及生長(zhǎng)指標(biāo)

苜蓿的生物量和生長(zhǎng)指標(biāo)是直觀評(píng)價(jià)苜蓿品質(zhì)的最重要因素，眾多學(xué)者研究結(jié)果報(bào)道，豆科植物產(chǎn)量可通過(guò)接種根瘤菌來(lái)增加[20]。目前，國(guó)內(nèi)外都很重視根瘤菌的接種，多個(gè)國(guó)家在播種苜蓿前均先要進(jìn)行根瘤菌接種處理，苜蓿在我國(guó)農(nóng)業(yè)中有著不可替代的作用，從1981年開始一直篩選苜蓿根瘤菌優(yōu)良菌株，本研究中，3株根瘤菌與其紅色熒光標(biāo)記菌接種的苜蓿幼苗地上鮮重和干重、根鮮重和干重、根長(zhǎng)、株高等均顯著(P<0.05)高于未接種苜蓿幼苗，這也符合多位研究學(xué)者的成果，得出苜蓿幼苗接種紅色熒光標(biāo)記菌和根瘤菌均對(duì)幼苗有明顯的促生作用，且紅色熒光標(biāo)記根瘤菌對(duì)苜蓿幼苗根系無(wú)影響。

圖2 紅色熒光標(biāo)記菌接種WL343HQ苜蓿幼苗后的葉片葉綠素含量Fig.2 Red fluorescent tags bacteria after inoculation of WL343HQ after seedling leaf chlorophyll content

苜蓿根長(zhǎng)、株高、葉片數(shù)和葉面積直接決定苜蓿的質(zhì)量與產(chǎn)量，而熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)入不影響苜蓿的正常生長(zhǎng)[21]，檢測(cè)熒光標(biāo)記菌的占瘤率均不能達(dá)到100%，說(shuō)明存在其他根瘤菌，可能是苜蓿種子里攜帶的根瘤菌，伴隨種子萌發(fā)進(jìn)入土壤根際，成為種子內(nèi)生根瘤菌。熒光標(biāo)記根瘤菌侵染苜蓿根系主要取決于根瘤菌細(xì)胞和質(zhì)粒間的適當(dāng)關(guān)系，兩者對(duì)生存空間和養(yǎng)分供給的不斷競(jìng)爭(zhēng)的能力決定了熒光標(biāo)記根瘤菌能否在植物根系形成有效根瘤[22-23]。紅色熒光蛋白質(zhì)粒根瘤菌的接種對(duì)2種苜蓿的生長(zhǎng)均無(wú)減緩影響，反而增加了苜蓿各生長(zhǎng)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)苜蓿品種的差別未有特異性，并有一定的促生效果，這也符合陳力玉等[8]的研究結(jié)果，熒光蛋白質(zhì)粒標(biāo)記根瘤菌不僅能直觀的觀測(cè)示蹤，還可提升苜蓿品質(zhì)，是一種研究固氮機(jī)理等很有效直接的方法，為后期深入研究奠定基礎(chǔ)。

3.2 兩個(gè)苜蓿品種接種根瘤菌及紅色熒光標(biāo)記根瘤菌固氮能力及葉綠素含量

固氮能力和植物葉綠素含量是對(duì)苜蓿的品質(zhì)檢測(cè)，測(cè)定固氮能力等指標(biāo)對(duì)比接種根瘤菌，方可得知紅色熒光蛋白質(zhì)粒對(duì)苜蓿幼苗根瘤固氮能力有無(wú)影響，是否能繼續(xù)運(yùn)用其進(jìn)行深入研究。試驗(yàn)中，設(shè)置表面滅菌且未接種紅色熒光的種子盆栽自生根系結(jié)瘤為對(duì)照組，接種紅色熒光蛋白的苜蓿盆栽根系結(jié)瘤為實(shí)驗(yàn)組，均能在回接紅色熒光標(biāo)記根瘤菌的苜蓿幼苗的根瘤中檢測(cè)出紅色熒光，篩選后的紅色熒光標(biāo)記根瘤菌相比標(biāo)準(zhǔn)無(wú)顯著差異[24]，紅色熒光質(zhì)粒導(dǎo)入根瘤菌并接種不同品種苜蓿幼苗不影響根瘤菌的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力，并無(wú)負(fù)面影響。羅明云等[25]把luxAB基因?qū)牖ㄉ鼍校瑱z測(cè)遺傳穩(wěn)定性及回接測(cè)定，并得出經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析luxAB基因不影響花生根瘤菌的正常生長(zhǎng)及功能，試驗(yàn)測(cè)定不同品種苜蓿幼苗接種紅色熒光標(biāo)記根瘤菌固氮能力指標(biāo)及葉綠素含量，可知紅色熒光質(zhì)粒的根瘤菌能成功侵染苜蓿根系并結(jié)瘤，能在苜蓿幼苗體內(nèi)正常表達(dá)，并對(duì)標(biāo)記菌的結(jié)瘤無(wú)影響。

根瘤菌固氮作用固定的氮素提供苜蓿幼苗生長(zhǎng)的氮源，而結(jié)瘤固氮的前提是共生的有效性，苜蓿幼苗葉片葉綠素含量的多少能表征根瘤菌的共生有效性[26]。S.LH3436，S.12531和S.LZgn5及其紅色熒光標(biāo)記根瘤菌接種的苜蓿葉片葉綠素含量與未接種處理相比有顯著差異(P<0.05),且與其對(duì)應(yīng)的根瘤菌葉綠素含量無(wú)顯著差異，表明紅色熒光標(biāo)記根瘤菌接種不同品種苜蓿后共生有效性良好，并無(wú)品種特異性。

4 結(jié)論

通過(guò)接種紅色熒光標(biāo)記根瘤菌及其對(duì)應(yīng)根瘤菌至甘農(nóng)5號(hào)和WL3436HQ紫花苜蓿，研究其根瘤菌接種苜蓿幼苗的生物量及生長(zhǎng)指標(biāo)，結(jié)果表明接種紅色熒光標(biāo)記根瘤菌對(duì)苜蓿幼苗的各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)不利影響，而表現(xiàn)出一定的促生效果，可促進(jìn)苜蓿生物量的積累。研究S.LH3436，S.12531和S.LZgn5及其對(duì)應(yīng)紅色熒光標(biāo)記根瘤菌接種苜蓿幼苗與未接種苜蓿幼苗的固氮能力表現(xiàn)，結(jié)果表明接種根瘤菌與紅色熒光標(biāo)記根瘤菌均能明顯提高苜蓿幼苗的固氮能力，和對(duì)應(yīng)根瘤菌之間無(wú)顯著差異，以S.LH3436-rfp2和S.LH3436-rfp1較為突出。