種苗根熒光反應(yīng)在多年生黑麥草與一年生黑麥草兩個(gè)種測(cè)定中可靠性驗(yàn)證

楊瀟逸 郭雪燕 孫 彥

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部牧草與草坪草種子質(zhì)量測(cè)試中心（北京），北京 100193）

黑麥草不僅是重要的牧草，同時(shí)在草坪上也廣泛應(yīng)用，主要有一年生黑麥草（Lolium multiflorum Lam.）和多年生黑麥草（Lolium perenne L.）兩個(gè)種最為常用。一年生和多年生黑麥草兩個(gè)草種在植株形態(tài)上有一定的差異，一般來(lái)說(shuō)，一年生黑麥草植株株高較高，葉較寬；穗長(zhǎng)，小穗多，小穗含花較多；穎片短，稃長(zhǎng)，外稃具有芒，而多年生黑麥草外稃無(wú)芒；與多年生黑麥草相比，一年生黑麥草幼苗具有較強(qiáng)活力；一年生黑麥草幼葉為卷包式，多年生黑麥草為折疊式。

一年生黑麥草與多年生黑麥草的商業(yè)種子非常相似，很難用肉眼鑒別，雖然說(shuō)一年生黑麥草種子有芒，而多年生黑麥草種子無(wú)芒，但是由于在收獲和加工過(guò)程中種子芒容易脫落，這給種子的鑒定帶來(lái)困難。由于價(jià)格上的差異，混雜后，對(duì)草種子的銷售與使用等帶來(lái)不必要的影響。所以如何區(qū)別一年生黑麥草與多年生黑麥草種子，防止商業(yè)銷售種的混雜尤為重要。

植株鑒定方法需要時(shí)間長(zhǎng)，往往在急需了解草種情況下無(wú)法滿足需求，所以種苗根的熒光反應(yīng)（SRF，Seedling Root Fluorescence）自1928 年Gentner[1]發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已作為國(guó)際和國(guó)內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)方法被用于一年生黑麥草和多年生黑麥草草種的鑒定[2-6]，此方法需時(shí)相對(duì)短，操作簡(jiǎn)單。通常情況下，發(fā)芽試驗(yàn)中濾紙上生長(zhǎng)的一年生黑麥草的幼苗根分泌生物堿annuloline[7]，在紫外線下發(fā)出熒光，多年生黑麥草幼苗不分泌生物堿因此無(wú)熒光反應(yīng)。然而，有研究表明存在有熒光多年生黑麥草和無(wú)熒光一年生黑麥草[3，8-11]。本試驗(yàn)旨在探究種苗根熒光測(cè)定對(duì)黑麥草種間鑒定的可靠性，以確保種子檢驗(yàn)的正確與準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料本試驗(yàn)所用種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草種子實(shí)驗(yàn)室提供，包括4 個(gè)一年生黑麥草品種（安格斯1 號(hào)、伯樂(lè)、牧謠、邦德）及4 個(gè)多年生黑麥草品種（天使、東景、綠神、大莊園）。采用直徑12cm濾紙，直徑12cm 培養(yǎng)皿；LRH-250-G Ⅱ光照培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；紫外儀（北京六一儀器廠）；花盆；Pindstrup substrate 營(yíng)養(yǎng)土。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子萌發(fā)從一年生黑麥草各品種經(jīng)過(guò)充分混合的種子中，取有明顯芒的種子150 粒。從多年生黑麥草各品種經(jīng)過(guò)充分混合的種子中，隨機(jī)取150 粒種子。以50 粒作為一個(gè)重復(fù)，每個(gè)品種設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)皿中放置3 層濾紙，并用預(yù)冷的KNO3潤(rùn)濕，避免濾紙與培養(yǎng)皿之間產(chǎn)生氣泡。將種子均勻地分布在濕潤(rùn)的發(fā)芽床上，每粒種子間保持適當(dāng)?shù)木嚯x，以減少相鄰種子對(duì)幼苗發(fā)育的影響，并且能減少后續(xù)紫外觀察種苗根的熒光的互相干擾。胚芽朝上，胚根朝下，方向一致，并留出1/3 的空白方便培養(yǎng)時(shí)添水。

蓋上培養(yǎng)皿蓋，用橡皮筋固定，傾斜置于5～10℃下預(yù)冷7d，解除種子的休眠。之后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱（12h黑暗20℃，8h 光照30℃）中進(jìn)行萌發(fā)，生長(zhǎng)2 周待根4～6cm 時(shí)進(jìn)行熒光鑒定。萌發(fā)期間經(jīng)常檢查水分、溫度和通氣狀況，及時(shí)補(bǔ)充蒸餾水保持濕潤(rùn)。

1.2.2 熒光鑒定 將發(fā)芽后的種子置于紫外線檢測(cè)器下用302nm 紫外光照射，分別計(jì)數(shù)各材料根的熒光強(qiáng)度，用強(qiáng)、弱、無(wú)表示。

發(fā)芽率=X/150×100%，X 為發(fā)芽種子數(shù)。

熒光率=（X-Z）/X×100%，Z 為正常發(fā)芽但不發(fā)光的種子。

1.2.3 種鑒定依據(jù)將種苗根熒光檢驗(yàn)過(guò)的幼苗從濾紙上取下，并按照熒光強(qiáng)度分類移栽到花盆中培養(yǎng)，置于溫室。一年生黑麥草共550 株熒光苗和1 株無(wú)熒光苗移栽置花盆，多年生黑麥草共23 株熒光苗和539 株無(wú)熒光苗移栽置花盆?；ㄅ杌|(zhì)為蛭石∶營(yíng)養(yǎng)土=1∶2。培養(yǎng)一段時(shí)間后，通過(guò)植株形態(tài)的觀察，以幼葉卷疊方式來(lái)鑒定黑麥草的種類：卷包式為一年生黑麥草，折疊式為多年生黑麥草。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光測(cè)定統(tǒng)計(jì)分析利用上述方法，對(duì)多年生黑麥草以及一年生黑麥草各品種進(jìn)行了熒光檢驗(yàn)，結(jié)果見表1。由試驗(yàn)結(jié)果可得知，除伯樂(lè)外一年生黑麥草熒光率均為100%，伯樂(lè)的熒光率為99.26%，無(wú)熒光率為0.74%；各品種多年生黑麥草均有少量熒光，熒光率隨品種而有所差異，本試驗(yàn)測(cè)定的4 個(gè)品種中熒光率在2.13%～7.97%之間波動(dòng)。從本試驗(yàn)可看出存在有熒光多年生黑麥草及無(wú)熒光一年生黑麥草。

表1 兩種黑麥草草種的熒光檢驗(yàn)結(jié)果

2.2 植株鑒定驗(yàn)證熒光反應(yīng)將發(fā)芽的黑麥草幼苗根據(jù)不同的熒光情況從培養(yǎng)皿分別移入盆栽培養(yǎng)一段時(shí)間后，通過(guò)植株形態(tài)觀察，以幼葉卷疊方式來(lái)鑒定兩種黑麥草。由表2 得知，樣品中一年生黑麥草幼葉全部為卷包式幼葉，說(shuō)明樣品全部為一年生黑麥草；而多年生黑麥草中出現(xiàn)兩個(gè)卷包式的幼葉（冬景1 個(gè)，綠神1 個(gè)），說(shuō)明多年生黑麥草中摻雜少量一年生黑麥草種子。多年生黑麥草（折疊式幼葉）具熒光反應(yīng)的種子數(shù)總共為19 個(gè)，其中強(qiáng)熒光種子數(shù)11 個(gè)（分別為冬景2 個(gè)、大莊園4 個(gè)、天使5 個(gè)），而弱熒光種子數(shù)8 個(gè)（大莊園2 個(gè)、綠神1 個(gè)、天使5 個(gè)）；一年生黑麥草（卷包式幼葉）的無(wú)熒光種子數(shù)為1（伯樂(lè)1 個(gè)）。由此進(jìn)一步證實(shí)了存在一年生無(wú)熒光的黑麥草，也存在多年生有熒光的黑麥草。

表2 兩種黑麥草形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

國(guó)際上從1940 年開始采用種苗根的熒光反應(yīng)方法進(jìn)行黑麥草的種間鑒定，并被國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)（ISTA）認(rèn)可[5]。我國(guó)2017 年發(fā)布的國(guó)標(biāo)《草種子檢驗(yàn)規(guī)程》也采用的是黑麥草屬熒光測(cè)定[6]?；谇叭说难芯拷Y(jié)果和本試驗(yàn)觀察到的現(xiàn)象，可以認(rèn)為一年生和多年生黑麥草種苗根中都有可能出現(xiàn)熒光。種苗根的熒光測(cè)定方法不能作為區(qū)分一年生與多年生黑麥草種子的唯一指標(biāo)，已成為國(guó)際社會(huì)的共識(shí)[3，4，9，12，13]，而國(guó)內(nèi)卻鮮見報(bào)道。

通過(guò)本試驗(yàn)得出一年生黑麥草熒光率除伯樂(lè)為99.26%以外，其余3 種均為100%，多年生黑麥草熒光率2.13%～7.97%。綜合上述分析，認(rèn)為黑麥草種苗根的熒光存在一定數(shù)量的與典型特征相悖的情況，在不同品種中這一值有所不同，種苗根熒光測(cè)定可以作為測(cè)定一年生和多年生黑麥草的參考，而不能作為其種及品種鑒定的唯一指標(biāo)。