基于“有效成分—性狀”的關(guān)聯(lián)分析評價(jià)丹參品質(zhì)的研究＊

王 蕓，陳軍峰，張 磊，陳萬生＊＊

（1.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院 上海 200433；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與生物技術(shù)中心上海 201203；3.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院 上海 200433）

性狀鑒定是中藥鑒定的主體，“辨狀論質(zhì)”是傳統(tǒng)中藥鑒定的精髓與總結(jié)[1,2]?！氨鏍睢奔幢嫠幉牡耐庥^：形、色、氣、味、表面特征、質(zhì)地、斷面特征等，“論質(zhì)”則是由“狀”的差異來判斷藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣[2]。在中藥材質(zhì)量優(yōu)劣評價(jià)方面，市場流通過程中依舊遵循著“看貨評級，分檔議價(jià)”的古法，即依照中藥材商品規(guī)格對中藥材進(jìn)行定檔定價(jià)。我國自建國以后共頒布過三次中藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)，分別是1954 年頒布的《38 種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》，1964年頒布的《54種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》以及現(xiàn)行的由國家醫(yī)藥管理局和衛(wèi)生部于1984年聯(lián)合頒布的《76種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》[3,4]。

本研究以常用大宗藥材丹參為對象，以現(xiàn)代科學(xué)對中藥材“辨狀論質(zhì)”的科學(xué)內(nèi)涵進(jìn)行探索。丹參（Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma），作為臨床常用大宗藥材，在生產(chǎn)和市場流通過程中，其品質(zhì)評判主要依據(jù)兩類評價(jià)體系：一類是以“辨狀論質(zhì)”為核心的性狀鑒定，即依據(jù)性狀的差異建立“商品規(guī)格”從而對丹參的品質(zhì)進(jìn)行評價(jià)，該方法簡單易行、直觀明了，在產(chǎn)地、市場流通中廣泛應(yīng)用，但是主觀性強(qiáng)，缺乏可量化標(biāo)準(zhǔn)；另一類評判體系即國家標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)《中國藥典》（2015 版）要求，測定指征性活性成分的含量（丹酚酸B ＞3%，總丹參酮＞0.25%）來判定丹參是否合格，藥典標(biāo)準(zhǔn)科學(xué)、準(zhǔn)確，但是實(shí)施條件要求較高，難于在丹參藥材的生產(chǎn)和流通的各個(gè)環(huán)節(jié)普遍應(yīng)用。兩種評判體系與依據(jù)各具優(yōu)勢，然而，兩類體系是否一致，能否相互印證，并未有相關(guān)研究報(bào)道。此外，兩個(gè)評價(jià)體系一致或不一致的內(nèi)在機(jī)制為何，解釋以上問題，才能闡明丹參“辨狀論質(zhì)”理論的科學(xué)內(nèi)涵?；谝陨蠁栴}，本研究對兩種丹參品質(zhì)評判體系進(jìn)行進(jìn)一步深入解析，利用植物表型組研究策略，建立和補(bǔ)充，闡明丹參藥材“辨狀論質(zhì)”的科學(xué)內(nèi)涵，以此促進(jìn)中藥傳統(tǒng)性狀鑒定的持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 儀器

高分辨率透射掃描儀（UMAX PowerLook 2100XL，臺灣）；安捷倫1200A-6410A 型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（安捷倫，美國）；安捷倫1290A-6538A型四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（安捷倫，美國）；質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析使用MassHunter（Ver.B.01.04及B.07.00）；安捷倫ZORBAX SBC18色譜柱（2.1×100 mm，3.5 μm）（安捷倫，美國）；沃特世XSELECT CST-C18色譜柱（2.1×50 mm,2.5 μm），沃特世ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1×100 mm，1.8 μm）（沃特世，美國）；WinRHIZO rootscan（Ver2015）植物根系高分辨率掃描分析系統(tǒng)（WinRHIZO，加拿大）。

1.2 試藥

丹參酮ⅡB、紫丹參甲素、丹參二醇B、紫丹參萜醚標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：云南西力生物技術(shù)有限公司；丹參素鈉、迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、二氫丹參酮和華法林標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：上海源葉生物有限公司。

1.3 植物材料

研究所用丹參樣品均為陜西商洛丹參GAP 基地的栽培丹參。

1.4 丹參樣品處理

采挖新鮮丹參后在不破壞根系表面結(jié)構(gòu)的情況下簡單迅速處理掉表面泥沙等雜質(zhì)后，統(tǒng)一以主根（或母根）與莖相交處上方（形態(tài)學(xué)）1-3 cm 處作為檢測材料。按長度比將材料均分為兩部分，選擇靠近根尖的部分置于固定液中進(jìn)行保存后續(xù)用于制作石蠟切片；另一部分的厚片沿橫切面直徑均分作2 份，一份不做處理，另一份則拆分為周皮，皮層+韌皮部、木質(zhì)部用作有效成分含量測定。

將已完成上述處理的丹參樣品自然干燥；將干燥后的樣品，以游標(biāo)卡尺測定主根中上部直徑，以高分辨掃描儀采集根表面圖像，Image J獲取丹參全區(qū)域內(nèi)表面顏色的色度值。

1.5 丹參藥材的定檔分級

目前在市場中使用的中藥材商品規(guī)格依舊是1984年頒布的《76種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》，以其中所收錄的“家種川丹參的標(biāo)準(zhǔn)”作為丹參樣品的定檔標(biāo)準(zhǔn)，以采收自陜西商洛的102株丹參樣品作為測試材料進(jìn)行定檔分級。

1.6 丹參主要活性成分的含量測定

以LC-MS/MS 技術(shù)完成酚酸類成分—丹酚酸B、丹參素鈉、迷迭香酸、丹酚酸A，丹參酮類成分—丹參酮IIA、丹參酮I、隱丹參酮、二氫丹參酮（TSN IIA，TSN I，CTSN，DHTSN）的含量測定，同時(shí)以UHPLC-Q-TOF/MS的方法實(shí)現(xiàn)25類丹參酮類成分的相對定量分析[5,6]。

1.6.1 LC-MS/MS技術(shù)定量測定主要酚酸類成分

色譜條件：色譜柱為安捷倫ZORBAX SB-C18 色譜柱（2.1×100 mm,3.5 μm）；流動(dòng)相為2 mmol·L-1醋酸銨-0.1%甲酸-乙腈，梯度洗脫：7%乙腈（0-2 min），7%-95%乙腈（2-3 min），95%乙腈（3.5-8 min），后運(yùn)行時(shí)間6.5 min；流速0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 L；柱溫35℃。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源；離子化模式為負(fù)離子模式；離子源溫度105℃；干燥氣和霧化氣為氮?dú)?，干燥氣溫?50℃，流速10 L·min-1；霧化壓力40 psi；離子噴霧電壓4000 V；碰撞氣為高純氮?dú)?，壓?.1 MPa。目標(biāo)化合物檢測采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（Multiple reactions monitoring mode，MRM）。

對照品和供試品溶液的配制：對照品分取1 mg配成終濃度1 mg·mL-1的母液，用甲醇稀釋各儲(chǔ)備液配制成酚酸類成分標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。供試品材料適量磨粉過100 目篩，分取0.1 mg 粉末置于10 mL 容量瓶，加入甲醇至刻度線，稱重，超聲30 min，冷卻后補(bǔ)足失重。取100 L提取液于35℃，2000 rpm轉(zhuǎn)速下?lián)]干，10倍體積復(fù)溶，復(fù)溶液于4℃離心30 min后分取上清作為供試品溶液。

1.6.2 LC-MS/MS技術(shù)定量測定主要丹參酮類成分含量

色譜條件：色譜柱為沃特世XSELECT CST-C18色譜柱（2.1×50 mm,2.5 μm）；流動(dòng)相為2 mmol·L-1醋酸銨-0.1%甲酸-乙腈，60%乙腈等度洗脫，洗脫時(shí)間5 min；流速0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 L；柱溫35℃。

質(zhì)譜條件：離子化模式為正離子模式；其余同上。對照品和供試品溶液的配制同上。

1.6.3 UHPLC-Q-TOF/MS 技術(shù)相對定量測定丹參酮類成分

色譜條件：色譜柱為沃特世ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 X 100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸-乙腈，梯度洗脫，流動(dòng)相為0.2%甲酸-乙腈，梯度洗脫：5%-95%乙腈（0-20 min），后運(yùn)行時(shí)間3 min；流速0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：3 L；柱溫30℃。

質(zhì)譜條件：采用雙噴流電噴霧離子源，正離子模式掃描，以高純氮?dú)庾鳛殪F化電離氣，設(shè)置干燥氣溫度350℃，流速11 L·min-1，霧化氣壓45 psi，鞘氣溫度、流速設(shè)置與干燥氣相同，毛細(xì)管電壓4 kV，碎片電壓120 V，錐孔電壓60 V，采集范圍為100-1700 m·z-1。儀器使用前以調(diào)諧液對儀器進(jìn)行校正，使用過程中不間斷加入?yún)⒈纫哼M(jìn)行質(zhì)量校準(zhǔn)。

對照品和供試品溶液的配制：精密稱取內(nèi)標(biāo)化合物華法林標(biāo)準(zhǔn)品1 mg 置1 mL 容量瓶內(nèi)加入甲醇配制成濃度為1 mg·mL-1溶液作標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。用甲醇稀釋儲(chǔ)備液至終濃度為20 ng·mL-1作內(nèi)標(biāo)溶液；其余標(biāo)準(zhǔn)品溶液處理同上。

1.7 丹參商品規(guī)格等級同活性成分的關(guān)聯(lián)分析

丹參定級后，分別以藥典中規(guī)定的指征性活性成分：丹酚酸B 和總丹參酮含量為統(tǒng)計(jì)參數(shù)，以SPSS 21.0軟件對不同等級樣品中的活性成分含量進(jìn)行正態(tài)性分布檢驗(yàn)，，將符合正態(tài)性分布的活性成分含量以完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。同時(shí)將測定的活性成分含量結(jié)果以log10 算法進(jìn)行歸一化處理，以SIMCA-P V11.5.0 Demo對均一化的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析考察群體樣本間的離散情況。

表1 丹酚酸和丹參酮類成分MRM參數(shù)。

表2 相對定量測定的丹參酮類成分列表。

1.8 丹參樣品的重新分級

嚴(yán)格按照《中國藥典》（2015 版）中丹參指征性活性成分的含量限度要求，對已完成含量測定的丹參樣品進(jìn)行重新分組。本批樣品中丹酚酸B的含量遠(yuǎn)高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，故最后僅以總丹參酮的含量作為分組標(biāo)準(zhǔn)。按照藥典規(guī)定的總丹參酮含量不得低于0.25%的限度要求將現(xiàn)有丹參材料分為合格組和不合格組，合格組總丹參酮含量不低于0.25%，不合格組總丹參酮含量低于0.25%。

1.9 丹參根系結(jié)構(gòu)特征的研究分析

根系在不破壞整體結(jié)構(gòu)的條件下，清洗去除泥沙等雜質(zhì)后經(jīng)WinRHIZO系統(tǒng)配備高分辨率掃描儀進(jìn)行掃描獲得高分辨率圖像（300 dpi），然后圖像經(jīng)WinRHIZO和ImageJ軟件獲得丹參根系結(jié)構(gòu)特征參數(shù)[7-10]。

將保存在固定液中的丹參厚片制作成石蠟切片并經(jīng)番紅固綠染色，染色切片經(jīng)高通量快速切片掃描儀掃描后，使用Pannoramic Viewer對切片進(jìn)行圖片獲取，根據(jù)統(tǒng)一比例尺(2000 M)調(diào)整切片圖像尺寸，然后圖像經(jīng)RootScan軟件依次識別皮層組織、木質(zhì)部結(jié)構(gòu)，完成各類細(xì)胞識別計(jì)數(shù)，獲得丹參根系組織分布特征數(shù)據(jù)[8]。

1.10 構(gòu)建丹參根系“表型-化學(xué)特征”關(guān)聯(lián)性分析

首先對數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。對于數(shù)據(jù)嚴(yán)重缺失的參數(shù)可以采用手動(dòng)去除，對于無法判斷的參數(shù)本研究采用格拉布斯（Grubbs'test）檢驗(yàn)進(jìn)行異常值的篩選，將組內(nèi)單一植物樣品的每個(gè)性狀參數(shù)進(jìn)行假定正態(tài)分布分析（Assumption of normal distribution），將離群值所指征的表型特征刪除，并進(jìn)行迭代測試直到無異常值存在。而后基于皮爾斯相關(guān)系數(shù)（Pearson Correlation Coefficient）構(gòu)建有效參數(shù)的“表型-化學(xué)特征”相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)。

1.11 擬合丹參品質(zhì)評價(jià)模型

隨機(jī)篩選合格組和不合格組內(nèi)各2/3的樣本設(shè)為測試集，以二元Logistic回歸統(tǒng)計(jì)分析的方法建立品質(zhì)評價(jià)模型，以驗(yàn)證集驗(yàn)證該模型。

1.12 丹參活性成分組織分布特異性研究

以LC-MS/MS的方法測定拆分后丹參各組織結(jié)構(gòu)中的主要活性成分含量，用log10 算法對丹參樣品中主要活性成分的含量進(jìn)行歸一化處理，經(jīng)主成分分析和層次聚類分析后獲得丹參根系主要活性成分的分布差異情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 丹參藥材的定檔分級結(jié)果

嚴(yán)格按照商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)將丹參樣品材料分為一等品、二等品和等外三個(gè)規(guī)格，其中一等品39 個(gè)，占比38.24%，二等品59 個(gè)，占比57.84%，等外4 個(gè)，占比3.92%。

2.2 丹參商品規(guī)格等級同活性成分的關(guān)聯(lián)分析

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示一等品中丹酚酸B和總丹參酮含量均略高其他等級，但不同等級間樣品并不存在顯著性差異（圖1-A，B）。主成分分析結(jié)果顯示對于丹參酮類成分，無論是以藥典中規(guī)定的丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ和隱丹參酮作為分析指標(biāo)，抑或是增加分析指標(biāo)，以相對定量測定的25種丹參酮類成分作為分析指標(biāo)，不同等級間樣品均無法實(shí)現(xiàn)聚類（圖1-C，D，E）。與上述結(jié)果相似，以丹酚酸類成分—丹酚酸B、丹酚酸A、迷迭香酸、丹參素鈉作為分析指標(biāo)，不同等級間樣品同樣無法實(shí)現(xiàn)聚類（圖1-F）。

上述研究結(jié)果表明現(xiàn)行的商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)存在一定的局限性和不合理性。為了對現(xiàn)行商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行補(bǔ)充，我們以藥典中所規(guī)定的指征性活性成分含量作為分級標(biāo)準(zhǔn)對丹參樣品進(jìn)行重新分級，然后以單一性狀特征或多個(gè)性狀特征連鎖分型同活性成分構(gòu)建相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)真正具有品質(zhì)指征作用的關(guān)鍵性狀，最后通過擬合評價(jià)模型驗(yàn)證性狀的品質(zhì)指征作用。

圖1 不同商品規(guī)格等級丹參樣品的活性成分含量差異情況

2.3 丹參樣品的重新分級結(jié)果

圖2顯示丹參樣品中丹酚酸B的含量遠(yuǎn)高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，故僅以總丹參酮的含量作為分組標(biāo)準(zhǔn)。重新分組標(biāo)準(zhǔn)為合格組總丹參酮含量不低于0.25%，不合格組總丹參酮含量低于0.25%。重新分組結(jié)果為合格組共計(jì)90 個(gè)，占比88.24%，合格組共計(jì)12 個(gè)，占比11.76%。

2.4 構(gòu)建丹參根系“表型-化學(xué)特征”關(guān)聯(lián)性分析

圖2 丹參樣品中丹酚酸B（LAB）（A）和總丹參酮（B）含量分布散點(diǎn)圖

圖3 丹參根系表型與代謝物累積相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)

圖4 擬合評價(jià)模型的ROC曲線

表4 驗(yàn)證集內(nèi)丹參樣品重新分組結(jié)果

通過數(shù)據(jù)預(yù)處理共剔除異常參數(shù)31項(xiàng)，所剔除參數(shù)均為表型參數(shù)。而后構(gòu)建有效參數(shù)的“表型-化學(xué)特征”相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)。構(gòu)建的“表型-化學(xué)特征”相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)（圖3）顯示共有49個(gè)參數(shù)間具有顯著相關(guān)性（P ＜0.05），其中表型參數(shù)33個(gè)，化學(xué)參數(shù)16個(gè)，共呈現(xiàn)390組關(guān)聯(lián)，343 組關(guān)聯(lián)為正相關(guān)，47 組為負(fù)相關(guān)，其中極顯著關(guān)聯(lián)（P ＜0.01）188組，多發(fā)生在表型特征參數(shù)之間。利用Cytoscape 軟件對關(guān)聯(lián)性進(jìn)行關(guān)聯(lián)性網(wǎng)絡(luò)可視化構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)整個(gè)網(wǎng)絡(luò)可以明顯分為兩個(gè)聚類，表型參數(shù)可分為一類，化學(xué)特征參數(shù)可分為一類。其中個(gè)別表型參數(shù)，不僅與其他表型參數(shù)具有顯著關(guān)聯(lián)性，同時(shí)也與化學(xué)特征參數(shù)之間具有顯著關(guān)聯(lián)性，表明該表型特征與活性成分含量水平具有一定的關(guān)聯(lián)性，可以作為具有品質(zhì)指征性作用的候選性狀。與活性成分具有極顯著差異的表型特征有6 個(gè)，分別是與丹參酮I、丹參酮IIA、和隱丹參酮的含量具有正相關(guān)性的紅色色度值（Red），與丹參酮I的含量具有正相關(guān)性的綠色色度值（Green），與丹參酮I、二氫丹參酮的含量具有正相關(guān)的平均色度值（（R+G+B）/3）；與丹參酮I、丹參酮IIA和迷迭香酸的含量具有負(fù)相關(guān)的主根最大直徑（Maximum Diamater of MR，MD）；與丹酚酸B含量具有負(fù)相關(guān)，但與丹參酮IIA、的含量具有正相關(guān)的形成層外區(qū)域占比（RatioCtoXS）以及與丹酚酸B 含量具有負(fù)相關(guān)，但與丹參酮I、隱丹參酮的含量具有正相關(guān)的形成層外內(nèi)面積比（RatioCtoS）。其中形成層外內(nèi)面積比以及形成層外區(qū)域占比在生物學(xué)意義上具有重復(fù)性，故僅只以最大直徑、色度值（Red、Green、R+G+B）/3）、切面形成層外內(nèi)面積比作為具有品質(zhì)指征性作用的候選性狀。

2.5 丹參品質(zhì)評價(jià)模型

以最大直徑、色度值（Red、Green、R+G+B）/3）、切面形成層外內(nèi)面積比作為模型參數(shù)以二元Logistic回歸統(tǒng)計(jì)分析的方法建立品質(zhì)評價(jià)模型，獲得經(jīng)過logit轉(zhuǎn)換的公式如下：

利用得到的預(yù)測概率P 值進(jìn)行ROC 曲線分析（圖4），其曲線下面積為0.703，P ＜0.05，敏感度87.5%，特異性55.0%，表明該模型具有一定的準(zhǔn)確性。以驗(yàn)證集驗(yàn)證該模型，將驗(yàn)證集內(nèi)樣品按上述評價(jià)模型重新分組（表4），其中原合格組內(nèi)樣品重新分組后的合格率為69.2%，原不合格組內(nèi)樣品重新分組后的不合格率為66.7%，即該模型驗(yàn)證后對于合格組和不合格組而言其匹配度分別為69.2%和66.7%。上述匹配結(jié)果表明該模型具有一定的準(zhǔn)確性，所挑選的關(guān)鍵性狀具有品質(zhì)指征作用。

進(jìn)一步分析篩選出來的關(guān)鍵性狀特征，發(fā)現(xiàn)最大直徑、根系表面色度值、切面形成層外內(nèi)面積比均為切面特征或切面相關(guān)特征。切面特征是中藥傳統(tǒng)鑒定中的一個(gè)重要指標(biāo)，是傳統(tǒng)性狀鑒定的重要判斷依據(jù)。在已有的中藥材性狀研究中發(fā)現(xiàn)主要有效成分多分布在薄壁細(xì)胞中，薄壁細(xì)胞較多的結(jié)構(gòu)所占比例越大，相應(yīng)的有效成分量越高，甚至可以表現(xiàn)出某些質(zhì)地特征[3]。所以通過解析活性成分的組織分布特異性可以實(shí)現(xiàn)對關(guān)鍵性狀特征形成機(jī)制的探索。

2.6 丹參活性成分組織分布特異性

丹參樣品中主要活性成分的含量歸一化處理后經(jīng)主成分分析和層次聚類分析獲得丹參根中主要活性成分的組織分布差異情況。結(jié)果（圖5）顯示，不同組織結(jié)構(gòu)樣本表現(xiàn)出較明顯的聚類和分離，無論是酚酸類成分或是丹參酮類成分，總體均可以分為兩個(gè)集合簇，其中周皮樣本（圖中以綠色表示）聚類在一起，而木質(zhì)部和韌皮部樣本（圖中藍(lán)色表示木質(zhì)部樣本，紅色為韌皮部+皮層樣本）混合聚類在一起。結(jié)果提示我們造成上述聚類結(jié)果的原因可能是丹參不同組織中活性成分種類和含量有所差異。故進(jìn)一步以層次聚類分析的方法來解釋上述結(jié)果。熱圖（圖6）顯示不同種類的活性成分的組織分布特異性，結(jié)果表明丹參酮類和酚酸類兩類化合物具有明顯區(qū)別的組織分布規(guī)律：以丹酚酸B 為代表的酚酸類在根的各組織結(jié)構(gòu)中均有分布，但在木質(zhì)部和韌皮部中的含量遠(yuǎn)高于周皮層內(nèi)，與之不同的是丹參酮類成分則主要分布在周皮層。

同時(shí)，根據(jù)已發(fā)表丹參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（Accession：SRX753381，SRR1640458，SRP028388，SRP051564），分析丹參各組織結(jié)構(gòu)中參與丹參酚酸類途徑和丹參酮類途徑的關(guān)鍵通路基因的轉(zhuǎn)錄變化情況，發(fā)現(xiàn)參與MEP 途徑的關(guān)鍵酶基因SmDXSs、SmDXR、SmMCT、SmCMK、SmMDS、SmHDS、SmHDRs、SmIPI 和SmGGPPSs，參與MVA 途徑的關(guān)鍵酶基因SmAACTs、SmHMGSs、SmHMGRs、SmMK、SmPMK、SmMDCs、SmIPI、和SmGGPPSs以及丹參酮合成途徑的關(guān)鍵酶基因SmCPS1、SmKSL1 和CYP76AH1 主要在周皮層富集表達(dá)，而參與酚酸類途徑的關(guān)鍵酶基因SmPALs、SmC4Hs、Sm4CLs、SmTATs、SmHPPRs、SmRASs 和SmCYP98A78 在周皮層中的表達(dá)量相對較低，而主要于木質(zhì)部和韌皮部內(nèi)相對高表達(dá)[11,12]?；蜣D(zhuǎn)錄表達(dá)結(jié)果與代謝檢測結(jié)果具有一致性，證明了丹參酮類和酚酸類兩類化合物的組織特異性形成主要是由于活性成分合成部位具有組織特異性而非轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的參與。

圖5 丹參主要酚酸類成分（A）和丹參酮類成分（B）的組織分布差異

圖6 丹參不同組織結(jié)構(gòu)中主要活性成分的分布差異熱圖

以活性成分組織特異性的規(guī)律來探索關(guān)聯(lián)性的內(nèi)在機(jī)制：丹參酮類化合物多呈橘紅色，大量積累在周皮結(jié)構(gòu)，使根呈現(xiàn)紅色，所以“色越紅”表明該原藥材中含有的丹參酮類成分含量越高；根越粗，相應(yīng)的根比表面積值會(huì)減小，周皮結(jié)構(gòu)相對體積減小，導(dǎo)致丹參酮類成分的含量水平降低；形成層內(nèi)外面積比影響的各組織結(jié)構(gòu)的相對比例，從而影響丹參酮的含量。

3 總結(jié)與討論

傳統(tǒng)中藥的“辨狀論質(zhì)”是在上千年中藥材使用過程中得出的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，合理性與局限性并存，利用現(xiàn)代科學(xué)闡明其科學(xué)內(nèi)涵并進(jìn)行修正，是科學(xué)合理地傳承“辨狀論質(zhì)”的必由之路?！氨鏍钫撡|(zhì)”的科學(xué)內(nèi)涵即利用科學(xué)手段解釋中藥“狀”與“質(zhì)”直接的關(guān)聯(lián)。鑒于中藥的品種、性狀特征、應(yīng)用部位等存在復(fù)雜的多樣性，長期以來并未形成系統(tǒng)性的研究體系，主要問題在于難以將性狀特征進(jìn)行高效準(zhǔn)確的量化和分析，同時(shí)無法有效地構(gòu)建性狀特征與有效成分累積之間的關(guān)聯(lián)[3]。本研究針對丹參根系為藥用部位的特點(diǎn)，利用植物表型組學(xué)的概念，嘗試探究丹參藥材品質(zhì)的內(nèi)涵，為建立合理可行的丹參商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

首先，我們以活性成分為評判標(biāo)準(zhǔn)，比較現(xiàn)行丹參藥材的“商品規(guī)格”和《中國藥典》（2015 版）規(guī)定的丹參藥材標(biāo)準(zhǔn)是一致。結(jié)果顯示，簡單的依據(jù)尺寸、形態(tài)來分級的“商品規(guī)格”并不能完全準(zhǔn)確地反映出藥材的活性成分水平，從而難以準(zhǔn)確反映其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，不難想象，除了丹參，這種商品規(guī)格與藥材真實(shí)品質(zhì)不一致的狀況必然在其他藥材中普遍存在?？梢?，有必要找尋出性狀特征與活性成分，與藥效的相關(guān)性。

為了發(fā)現(xiàn)能夠明確指征丹參品質(zhì)的形態(tài)特征，針對丹參藥材的特性，本研究整合了多種植物根系形態(tài)分析的軟件，經(jīng)過篩選，可以快速獲取丹參藥材的形態(tài)特征參數(shù)。利用高通量的圖像分析可以獲得多種形態(tài)特征參數(shù)，極大地提高參數(shù)獲得的速度和準(zhǔn)確度，同時(shí)，還可以獲得許多通過手工測量或者直接觀察無法獲得的數(shù)據(jù)，比如預(yù)測根系的總表面積、組織分布比例、根系結(jié)構(gòu)等參數(shù)。結(jié)合代謝分析，構(gòu)建形態(tài)參數(shù)—活性成分的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而篩選出關(guān)鍵特征，用以擬合丹參品質(zhì)評價(jià)模型。雖然該模型尚待通過大量樣本的糾正以及驗(yàn)證，且從理論到實(shí)際應(yīng)用尚存在很長的距離，但本研究依然為中藥材“辨狀論質(zhì)”科學(xué)內(nèi)涵研究提供了研究新思路和新方法，以多科學(xué)手段討論藥材的質(zhì)量，更可進(jìn)一步對藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或是商品規(guī)格的指定提供參考。