基于對瓦布貝母核苷類成分貢獻率的鋅硼鉬最優(yōu)配施濃度

陳 雨，張亞琴，鄧秋林，楊正明，雷飛益，付羽萍，劉震東，陳興福*

（1 四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/農(nóng)業(yè)部西南作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室，成都 611130；2 四川新荷花川貝母生態(tài)藥材有限公司，四川松潘 623301）

川貝母是名貴中藥材，具有清熱潤肺、化痰止咳、散結(jié)消癰鎮(zhèn)痛等功能[1]。川貝止咳糖漿、川貝母枇杷露和止咳化痰丸等中藥方劑均是以川貝母水煎劑制備。川貝母的主要活性成分為生物堿、核苷、皂苷、甾體和萜類等[2-3]，核苷類成分大多為水溶性成分[4-5]。貝母水溶性成分具有抗炎、抑制血小板凝聚、降壓、松弛平滑肌等作用[6-7]。貝母中核苷類成分的含量影響著川貝母的藥效，是評價人工栽培藥用貝母品質(zhì)的重要指標。

施用化學肥料影響人工栽培藥用植物內(nèi)在成分的積累[8]。研究表明，微量元素肥料可以有效提高藥用植物的產(chǎn)量和質(zhì)量。竇明明等[9]研究發(fā)現(xiàn)微量元素和氮磷鉀配施能有效地提高澤瀉的產(chǎn)量。張亞琴等[10]研究結(jié)果表明葉面噴施鋅、硼、鉬有利于川白芷中香豆素類成分的積累和品質(zhì)的提高。伍燕華等[11]研究表明噴施微量元素肥料對川貝母 (Fritillaria cirrhosaD. Don) ?；ū９视酗@著的提高，有利于提高川貝母的掛果率。

瓦布貝母 (Fritillaria unibracteataHsiao et K. C.Hsia var.wabuensis) 為百合科貝母屬植物，是藥材川貝母重要的基源植物品種之一，主要分布在四川西北部海拔2500～3600 m的灌木林和草叢中[12-13]。目前，瓦布貝母的栽培研究還處于初步階段，微量元素肥料對瓦布貝母中內(nèi)在成分的影響尚無報道。本研究采用三因素五水平二次正交旋轉(zhuǎn)組合設計，研究了鋅、硼、鉬微肥的配施對瓦布貝母核苷類成分的影響，為提高人工栽培瓦布貝母藥用品質(zhì)提供養(yǎng)分管理的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為五年生瓦布貝母栽培品種，由四川省茂縣松坪溝鄉(xiāng)新荷花生態(tài)藥材有限公司川貝母標準化生產(chǎn)基地提供，供試材料經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學陳興福教授鑒定為百合科貝母屬植物瓦布貝母 (Fritillaria.unibracteataHsiao et K. C. Hsia var.wabuensis)。

1.2 供試試劑與設備

供試試劑：鋅肥為硫酸鋅 (優(yōu)級純，ZnSO4≥98.0%)，硼肥為硼砂 (優(yōu)級純，Na2B4O7·10H2O ≥95%)，鉬肥為鉬酸銨 (優(yōu)級純，H8MoN2O4≥98.0%)，甲醇 (HPLC級)，超純水等。尿嘧啶 (HPLC ≥98%，生產(chǎn)批號N-024-150730)，胞苷 (HPLC ≥98%，生產(chǎn)批號B-109-150715)，腺嘌呤 (HPLC ≥98%，生產(chǎn)批號X-060-150801)，肌苷 (HPLC ≥98%，生產(chǎn)批號 J-059-150730)，胸苷 (HPLC ≥98%，生產(chǎn)批號 X-074-150715)，腺苷 (HPLC ≥98%，生產(chǎn)批號X-022-151027) 購自成都瑞芬思生物科技有限公司；胸腺嘧啶 (HPLC ≥ 98%，生產(chǎn)批號PS161216-03)，尿嘧啶核苷 (HPLC ≥ 98%，生產(chǎn)批號PS1216-0100)，鳥嘌呤核苷 (HPLC ≥ 98%，生產(chǎn)批號 PS1215-0100)，2′-脫氧核苷 (HPLC ≥ 98%，生產(chǎn)批號PS161216-02) 購自成都普思生物科技股份有限公司。

試驗儀器：Agilent Technologies 1260 InfinityⅡ高效液相色譜儀，JD300-3千分之一精密電子天平(沈陽龍騰電子有限公司)，101-3AB型電熱鼓風干燥箱 (天津市泰斯特儀器有限公司)，DZKW-4電子恒溫水浴鍋 (北京中興偉業(yè)儀器有限公司) 等。

1.3 試驗設計

試驗在四川省茂縣松坪溝鄉(xiāng)新荷花生態(tài)藥材有限公司川貝母標準化生產(chǎn)基地進行。試驗地土壤基本養(yǎng)分狀況：pH 5.7、有機質(zhì) 53.6 g/kg、堿解氮 (N)490 mg/kg、速效鉀 (K) 168 mg/kg、有效磷 (P) 105 mg/kg、速效鋅 (Zn) 0.63 mg/kg、速效硼 (B) 1.10 mg/kg、速效鉬 (Mo) 0.12 mg/kg。

2016年8月中旬按四年生瓦布貝母種莖大小約為12 mm的鱗莖進行栽種。每個試驗小區(qū)面積為3 m2(1 m × 3 m)，行距15 cm，株距10 cm，每小區(qū)種植鱗莖180顆，并稱重。在栽培前施用15000 kg/hm2的農(nóng)家肥作為底肥，齊苗時和初花期分別追施復合肥 (N∶P2O5∶K2O = 15∶15∶15) 225 kg/hm2和300 kg/hm2。其余栽培管理與基地生產(chǎn)管理措施一致。

試驗采用三因素五水平二次正交旋轉(zhuǎn)組合設計，設置鋅肥 (ZnSO4·7H2O)、硼肥 (硼砂)、鉬肥[(NH4)2Mo4O13] 3個因素，5個水平，共23個小區(qū)隨機排布。將每小區(qū)的微肥用量溶解于1000 mL水中，在川貝母現(xiàn)蕾期、初花期、盛花期、幼果期進行微肥噴施處理，分別施用各微量元素肥料總量的20%、30%、30%、20%，盡量避免掉液[14]。在瓦布貝母植株倒苗后進行采收，每個試驗小區(qū)按照五點法進行鱗莖采挖，每個點挖10顆，每個小區(qū)共采挖50顆。試驗各因素水平編碼見表1。具體試驗設計和實施方案見表2。

表1 因素水平編碼表（kg/hm2）Table 1 Factor level table

1.4 色譜條件

色譜柱為 Dlamonsil C18柱 (250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相為水 (A)-甲醇 (B)，梯度洗脫 (0～10 min，1%～5% B；10～15 min，5%～10% B；15～22 min，15%～17% B；22～26 min，17%～20% B)；流速1 mL/min；柱溫30℃；檢測波長260 nm；進樣量20 μL。

表2 試驗設計與實施方案Table 2 Experimental design and implementation plan

1.5 標準溶液制備及標準曲線線性范圍

分別精密稱取對照品尿嘧啶2.12 mg、胞苷2.42 mg、尿嘧啶核苷2.01 mg、胸腺嘧啶3.50 mg、腺嘌呤2.03 mg、肌苷2.01 mg、鳥嘌呤核苷2.02 mg、胸苷 2.08 mg、腺苷2.50 mg、2′-脫氧核苷 2.04 mg置于10 mL容量瓶中，用超純水分別配成質(zhì)量濃度為尿嘧啶0.212 mg/mL、胞苷0.242 mg/mL、胸苷0.208 mg/mL、尿嘧啶核苷0.201 mg/mL、肌苷0.201 mg/mL、胸腺嘧啶0.350 mg/mL、腺嘌呤0.203 mg/mL、鳥嘌呤核苷0.202 mg/mL、腺苷0.250 mg/mL、2′-脫氧核苷0.204 mg/mL的單一質(zhì)量濃度的儲備液。

依次準確吸取上述儲備液1.3 mL、1.0 mL、1.0 mL、0.5 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.0 mL、1.3 mL、1.0 mL、1.0 mL，在10 mL的容量瓶中定容，制成含10種核苷成分的標準溶液，其中尿嘧啶、胞苷、胸苷、尿嘧啶核苷、肌苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤核苷、腺苷、2′-脫氧核苷的含量分別為0.0265 mg/mL、0.0242 mg/mL、0.0201 mg/mL、0.0101 mg/mL、0.0101 mg/mL、0.0350 mg/mL、0.0203 mg/mL、0.0253 mg/mL、0.0250 mg/mL、0.0204 mg/mL。準確吸取該溶液0.5 mL，用超純水定容于1 mL容量瓶中，制成6個質(zhì)量濃度的標準混合系列溶液。

以標準混合溶液，采用“1.4”項下色譜條件進行測定，得到10種核苷的色譜圖 (圖1-A)。計算得到10種核苷含量。尿嘧啶、胞苷、胸苷、尿嘧啶核苷、肌苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤核苷、腺苷、2′-脫氧核苷的含量分別為0.265、0.242、0.201、0.101、0.101、0.350、0.203、0.253、0.0250、0.0204 mg/mL。

將標準系列溶液按照1.4條件進行分析，以各核苷成分的峰面積積分值 (Y) 與其相應的質(zhì)量濃度 (X)進行線性回歸，得到回歸方程、決定系數(shù)和線性范圍，結(jié)果見表3。

1.6 精密度試驗

圖 1 10種核苷混合對照品溶液 (A) 和瓦布貝母 (B) 供試品溶液的色譜圖Fig. 1 Chromatogram of 10 nucleoside mixed reference solution (A) and the sample of Fritillaria unibracteata wabuensis (B)

表3 10種核苷類成分回歸方程與線性范圍Table 3 Regression equations and linear ranges of 10 nucleoside components

取標準混合對照品溶液，在“1.4”的色譜條件下重復進樣6次，記錄峰面積，測得尿嘧啶、胞苷、尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鳥嘌呤核苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧核苷RSD分別為0.52%、0.78%、1.22%、1.53%、0.36%、0.87%、0.36%、1.33%、0.56%、0.66%，表明精密度良好。

1.7 重復性試驗

選取1號小區(qū)瓦布貝母樣品，準確稱取貝母樣品粉末0.3000 g，稱取6份，置于10 mL離心管中，精密加水3 mL，混勻，室溫 (200 W，40 kHz) 超聲提取45 min，4000 r/min離心10 min，上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。按“1.4”項色譜條件進行分析，10個核苷成分色譜圖見圖1-B。6份溶液中尿嘧啶、胞苷、尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鳥嘌呤核苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧核苷峰面積的RSD分別為2.32%、1.13%、2.45%、0.99%、2.01%、1.68%、1.88%、2.56%、2.76%、2.33%，表明方法重復性良好。

1.8 穩(wěn)定性試驗

取同一小區(qū) (1號小區(qū)) 瓦布貝母供試品溶液，分別于 0、4、8、12、16、20、24 h 進樣測定，尿嘧啶、胞苷、尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鳥嘌呤核苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧核苷峰面積RSD 分別為1.82%、2.44%、3.08%、1.15%、1.99%、2.45%、2.98%、1.67%、2.63%、1.35%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

1.9 加樣回收率

精密稱取已知含量的瓦布貝母樣品共6份，每份約0.5 g，分別精密加入尿嘧啶159.76 μg、胞苷28.55 μg、尿嘧啶核苷 93.90 μg、胸腺嘧啶 10.84 μg、腺嘌呤 5.33 μg、肌苷 105.62 μg、鳥嘌呤核苷18.22 μg、胸苷 34.67 μg、腺苷 26.87 μg、2′-脫氧核苷2.53 μg的對照品，按“1. 7”項下方法制備供試品溶液，按照“1.4”項色譜條件下測定含量，計算平均加樣回收率。結(jié)果表明，尿嘧啶、胞苷、尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鳥嘌呤核苷、胸苷、腺苷、2′-脫氧核苷峰面積平均加樣回收率分別為：99.58%、98.21%、102.44%、101.23%、97.48%、103.21%、99.75%、103.74%、98.33%、101.11%，RSD值均分別為2.34%、3.53%、2.06%、1.89%、3.22%、2.61%、1.49%、3.61%、2.87%、1.51%。

1.10 樣品含量測定

取23個試驗小區(qū)樣品粉末，分別按“1.7”項下方法制備供試品溶液，按照“1.4”項色譜條件測定10個核苷類成分含量的峰面積，分別計算10個成分的含量，結(jié)果表明，尿嘧啶、胞苷、尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶、肌苷、鳥嘌呤核苷、胸苷全部小區(qū)都能檢測出來；腺嘌呤在6、7、9、11和13小區(qū)能檢測出來；腺苷在1、3、6、10和12小區(qū)不能檢測出來，2′-脫氧核苷在1～2和10～12小區(qū)不能檢測出來，具體測定結(jié)果見表4。

2 結(jié)果與分析

2.1 模型的建立與檢驗

根據(jù)試驗小區(qū)核苷測定情況，建立尿嘧啶 (Y1)、胞苷 (Y2)、尿嘧啶核苷 (Y3)、胸腺嘧啶 (Y4)、肌苷(Y5)、鳥嘌呤核苷 (Y6)、胸苷 (Y7) 與鋅 (X1)、硼(X2)、鉬 (X3) 的回歸模型。用F檢驗法分別檢驗方程各項回歸系數(shù)、方程總回歸系數(shù)和失擬度，得到方差分析表 (表5)。

通過方差分析發(fā)現(xiàn)，方程Y1、Y3、Y7的總回歸系數(shù)均達到了顯著水平，方程Y2、Y6的總回歸系數(shù)均達到了極顯著水平，方程Y1、Y2、Y3、Y6的失擬度未達到顯著水平 (表5)，這說明方程Y1、Y2、Y4、Y6的模型成立，表明回歸方程擬合度合理可靠。經(jīng)上述檢驗，剔除顯著水平 ＜ 0.10不顯著的項后得到優(yōu)化的回歸方程 Y1′、Y2′、Y3′和 Y6′。

2.2 因子主效應分析

根據(jù)表5中各項回歸系數(shù)的F值計算各因素對因變量的貢獻率，可得到各個因素對實驗結(jié)果的影響效果，得到各因素對7種核苷的貢獻率見表6。

鋅、硼、鉬對7種核苷的貢獻率影響不同 (表6)。按貢獻率從大到小排列得到各因素對尿嘧啶核苷影響為鋅 ＞ 硼 ＞ 鉬，對胸腺嘧啶和肌苷的影響為鋅 ＞ 鉬 ＞硼，對胞苷的影響為硼 ＞ 鉬 ＞ 鋅，對鳥嘌呤核苷的影響為硼 ＞ 鋅 ＞ 鉬，對尿嘧啶的影響為鉬 ＞ 鋅 ＞硼，對胸苷的影響為鉬 ＞ 硼 ＞ 鋅。以上可以看出，鋅、硼、鉬對不同的核苷的影響效果不同，這可能與核苷合成時微肥對其的調(diào)控作用有關。

2.3 單因素效應分析

使用降維法研究鋅、硼、鉬對瓦布貝母核苷的影響，固定其它因子為零水平，可分析出單因素對瓦布貝母核苷的影響。鋅肥對尿嘧啶有顯著影響，鋅肥和硼肥對胞苷有顯著影響，鉬肥對胸苷有顯著影響 (表5)。由此可以算出鋅、硼、鉬肥對瓦布貝母尿嘧啶、胞苷和胸苷的單因素效應方程，由方程可得單因素效應圖 (圖2)。

表4 試驗小區(qū)樣品中10種核苷類成分含量 (μg/g)Table 4 The content of 10 nucleoside compounds in the sample of the test plot

不同因素水平對瓦布貝母核苷影響不同 (圖2)。隨著鋅肥濃度的增加尿嘧啶含量逐漸增加，胞苷含量逐漸降低，說明鋅肥增加時尿嘧啶含量上升，胞苷含量下降，這就需要一個合適的施肥量來達到兩種核苷的平衡。隨鉬肥的施用量增加胸苷含量逐漸上升，合理增施鉬肥有利于胸苷含量的增加，當硼肥和鋅肥施用量增加胞苷含量降低，說明硼肥和鋅肥的施用量增加會抑制胞苷含量的增加。

2.4 互作效應分析

交互項中存在著顯著的互作，鋅-硼、鋅-鉬和硼-鉬交互作用都會對核苷產(chǎn)生顯著影響 (表5)。利用降維法得到鋅、硼、鉬與核苷的互作效應方程，由方程得到互作效應圖 (圖3～圖5)。

在鋅肥和硼肥均處于高含量時，尿嘧啶的含量最高。在鋅肥處較高含量時，隨著硼肥的增加，尿嘧啶的含量越來越高；在硼處于較高含量時，隨著鋅肥的增加，尿嘧啶的含量越來越高。鋅 - 硼互作對尿嘧啶的含量有協(xié)同作用。在鋅肥處于較高含量時，隨著硼肥的增加，尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶和胸苷的含量越來越低；在硼肥處于較高含量時，隨著鋅肥的增加，尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶和胸苷的含量開始降低，在鋅和硼均處于高含量時，尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶和胸苷的含量最低。說明鋅 - 硼互作對尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶和胸苷含量有拮抗作用 (圖3)。

表5 瓦布貝母核苷與微肥的方差分析 (F值)Table 5 Analysis of variance of Fritillaria unibracteata var. wabuensis and micronutrient fertilizers (F-values)

表6 單因素貢獻率 (%)Table 6 Single factor contribution rate

圖 2 單因素效應Fig. 2 Single factor effects

當鋅肥和鉬肥處于高含量時，尿嘧啶、肌苷和尿嘧啶核苷的含量最高。在鋅肥處于較高含量時，隨著鉬肥的增加，尿嘧啶、肌苷和尿嘧啶核苷的含量越來越高；在鉬肥處于較高含量時，隨著鋅肥的增加，尿嘧啶、肌苷和尿嘧啶核苷的含量越來越高。說明鋅-鉬互作對尿嘧啶、尿嘧啶核苷和肌苷的含量有協(xié)同作用 (圖4)。

圖 3 Zn和B互作效應分析圖Fig. 3 Diagrams of Zn and B interaction analysis

當鉬肥處于低含量，硼肥處于高含量時或者鉬肥處于高含量，硼肥處于低含量時，胞苷、尿嘧啶核苷和鳥嘌呤核苷的含量最高。在鉬肥處于較高含量時，隨著硼肥的增加，胞苷、尿嘧啶核苷和鳥嘌呤核苷的含量越來越低；在硼肥處于較高含量時，隨著鉬肥的增加，胞苷、尿嘧啶核苷和鳥嘌呤核苷的含量越來越低。在鉬肥和硼肥處于高含量時，胸苷的含量最高。在鉬肥處于較高含量時，隨著硼肥的增加，胸苷的含量先降低后增加；在硼肥處于較高含量時，隨著鉬肥的增加，胸苷的含量越來越低。在硼和鉬均處于高含量時胸苷含量最高。說明硼-鉬互作對胞苷、鳥嘌呤核苷、胸苷和尿嘧啶核苷產(chǎn)生拮抗作用 (圖5)。

2.5 配方肥優(yōu)化分析

通過已建立的產(chǎn)量的回歸模型，可計算出各核苷在最高含量下各微肥因素的最適施用配方的理論值?？紤]到實際生產(chǎn)時存在溫度、光照等環(huán)境的差異影響，通過使用統(tǒng)計頻數(shù)法進行分析可以得到一個合適的范圍 (表7)。

不同核苷的最佳施肥范圍不同，但是大部分集中在0水平左右 (表7)。綜合表4中有些小區(qū)未檢測出的三個核苷的結(jié)果，和表7取交集的結(jié)果，確定最優(yōu)的施肥范圍為鋅肥 (ZnSO4) 8.05～11.85 kg/hm2、硼肥 (Na2B4O7·10H2O) 11.70～16.47 kg/hm2、鉬肥(H8MoN2O4) 0.36～0.51 kg/hm2。

圖 4 Zn和Mo互作效應分析圖Fig. 4 Diagrams of Zn and B interaction analysis

圖 5 B和Mo互作效應分析圖Fig. 5 Diagrams of B and Mo interaction analysis

表7 各核苷含量最優(yōu)的微量元素用量Table 7 Optimal micronutrient fertilizer rates for highest concentration of each nucleoside

2.6 基于灰色關聯(lián)度和DTOPSIS法綜合評價試驗小區(qū)瓦布貝母核苷含量

為了能夠綜合對瓦布貝母的10種核苷做出一個客觀綜合評價，本文綜合了所測定的10種核苷成分，使用灰色關聯(lián)度法計算出10種核苷的權重值和灰關聯(lián)度 (表8)，從而計算出灰關聯(lián)評價指標 (表9)，并使用灰關聯(lián)權重值進行了DTOPSIS法處理，得到DTOPSIS法的相對接近度值Ci及其排序，同時計算出待評材料與理想材料的關聯(lián)度。

采用灰色關聯(lián)度法和DTOPSIS法的綜合評價結(jié)果幾乎一致 (表9)。兩種方法所得綜合表現(xiàn)最優(yōu)的處理是3號，即當使用鋅肥 (ZnSO4) 15.71 kg/hm2、硼肥 (Na2B4O7·10H2O) 5.53 kg/hm2、鉬肥 (H8MoN2O4)0.65 kg/hm2時瓦布貝母10種核苷的含量綜合最優(yōu)，在實際生產(chǎn)過程中可以根據(jù)所需核苷品種進行相關的微肥施用。

3 討論

微量元素是作物生長發(fā)育不可缺少和不可相互代替的營養(yǎng)物質(zhì)。植物在生長發(fā)育的過程中，微量元素是植物體內(nèi)酶或輔酶的組成部分，微量元素的缺失會影響植物次生代謝產(chǎn)物的合成與積累[15-16]。孟杰等[17]研究發(fā)現(xiàn)配施微量元素能有效地提高北柴胡皂苷a、d的影響；張亞琴等[10]的研究發(fā)現(xiàn)鋅硼鉬配施能顯著提高白芷中香豆素含量。本研究結(jié)果表明，在試驗因素范圍內(nèi)鋅、硼和鉬都有利于瓦布貝母核苷類含量的增加。在測得的10種核苷中，不同核苷對微量元素的需求不同，三種肥料對單一核苷的貢獻率不盡相同。核苷的合成過程中需要的微量元素不同。

表8 10種核苷的關聯(lián)度 (γi) 和變異系數(shù)確定的權重值 (ωk)Table 8 The correlation degree (γi) of 10 nucleosides and the weight value (ωk) dependent of the coefficient of variation

表9 瓦布貝母10種核苷的加權關聯(lián)度γi與Ci排序值Table 9 Ranking of weighted correlation degrees γi and Ci of 10 nucleosides of F. unibracteata wabuensis

根據(jù)互作效應得到兩因素互作對核苷含量產(chǎn)生的影響。根據(jù)試驗結(jié)果鋅-硼互作對尿嘧啶產(chǎn)生協(xié)同作用，對胸腺嘧啶、尿嘧啶核苷和胸苷產(chǎn)生拮抗作用；鋅-鉬互作對尿嘧啶、尿嘧啶核苷和肌苷產(chǎn)生協(xié)同作用；硼-鉬互作對胞苷、胸苷、鳥嘌呤核苷和尿嘧啶核苷產(chǎn)生拮抗作用。這與小麥[18]、玉米[19]、花生[20]等作物的微量元素互作效應研究結(jié)果相似。綜合以上原因，可能是鋅在參與葉綠素生成、防止葉綠素的降解和形成碳水化合物等光合作用過程中具有重要作用[21-22]；硼對植物的具體作用主要表現(xiàn)為參與作物體內(nèi)碳水化合物的代謝和植物的固氮作用[22]；含鉬元素的蛋白參與硝酸還原作用和固氮作用，提高蛋白質(zhì)質(zhì)量[24-25]，這些生理生化過程都會影響瓦布貝母核苷含量的增加。不同微量元素肥料對藥用植物的相關影響還處于探索階段，微量元素肥料對藥用植物產(chǎn)量和有效成分含量的積累機制還需進一步研究。

本研究建立了微量元素肥料鋅硼鉬肥與瓦布貝母7種核苷之間的回歸方程。試驗模型結(jié)果表明，鋅、硼、鉬配施能促進瓦布貝母核苷含量的增加。該試驗得到的瓦布貝母單一核苷類成分量高于馬鵬等[4]、游靜等[26]對太白貝母和暗紫貝母的核苷成分量，一方面說明鋅、硼、鉬配施能顯著提高核苷的含量，另一方面也說明瓦布貝母具有較高的內(nèi)在成分，可以作為川貝母人工栽培的發(fā)展方向。Pan 等[5]對瓦布貝母的研究結(jié)果也表明鋅硼鉬配施能夠顯著提高尿嘧啶和肌苷的含量。綜合7種核苷的優(yōu)化配方施肥方案，得出最優(yōu)的施肥范圍為鋅肥 (ZnSO4)8.05～11.85 kg/hm2、硼肥 (Na2B4O7·10H2O)11.70～16.47 kg/hm2、鉬肥 (H8MoN2O4) 0.36～0.51 kg/hm2時，能夠顯著提高瓦布貝母的7種核苷含量的增加。運用灰色關聯(lián)度和DTOPSIS法對檢測出的10種核苷進行試驗小區(qū)處理結(jié)果優(yōu)劣情況比較，灰色關聯(lián)度法所得關聯(lián)度最大差異為31.98%，DTOPSIS法所得Ci值最大差異可達63.86%，說明根據(jù)DTOPSIS法可以使樣品之間的差異更加明顯，能夠更好區(qū)分試驗材料的優(yōu)異。根據(jù)結(jié)果可得，施用鋅肥 (ZnSO4) 15.71 kg/hm2、硼肥 (Na2B4O7·10H2O)5.53 kg/hm2、鉬肥 (H8MoN2O4) 0.65 kg/hm2時瓦布貝母10種核苷的含量綜合最優(yōu)，這與頻數(shù)分析法中最優(yōu)施肥范圍有一定差異，可能是有些小區(qū)未檢測出相關成分造成了這種差異。

4 結(jié)論

葉面噴施鋅、硼、鉬對瓦布貝母的核苷成分的含量具有一定影響。施用鋅肥 (ZnSO4) 8.05～11.85 kg/hm2、硼肥 (Na2B4O7·10H2O) 11.70～16.47 kg/hm2、鉬肥 (H8MoN2O4) 0.36～0.51 kg/hm2時檢測的8種核苷成分含量綜合最佳。通過灰色關聯(lián)度和DTOPSIS法進行分析，施用鋅肥 (ZnSO4) 15.71 kg/hm2、硼肥(Na2B4O7·10H2O) 5.53 kg/hm2、鉬肥 (H8MoN2O4) 0.65 kg/hm2時瓦布貝母10種核苷的含量綜合最優(yōu)。