基于電子鼻和分光測色儀技術(shù)的茶樹葉片氮營養(yǎng)診斷

傅嘉敏，耿 琦，王夢荷，張麗霞，黃曉琴，韓曉陽*

（l 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018；2 作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018）

茶樹是葉用型經(jīng)濟(jì)作物，耗氮量較高。缺氮茶樹不僅生長緩慢、葉片變黃、產(chǎn)量降低[1]，而且茶葉香氣低、不耐沖泡、滋味較苦澀[2]，因此缺氮會(huì)對茶樹生長及茶葉品質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響?？焖龠M(jìn)行茶樹氮營養(yǎng)診斷是茶樹科學(xué)施肥的重要前提。已有植物氮素營養(yǎng)診斷方法主要包括植株外部形態(tài)診斷、植株全氮診斷、植株硝酸鹽診斷[3-4]。這些方法操作過程復(fù)雜，消耗的人力物力多，且缺乏時(shí)效性。隨著檢測新技術(shù)的不斷出現(xiàn)，無損診斷技術(shù)逐漸被應(yīng)用到氮素診斷中，如葉綠素儀法、葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)[5]、遙感技術(shù)等[6]。

植物葉片內(nèi)均含有一定量的揮發(fā)性物質(zhì)，其產(chǎn)生與植物的種類和栽培管理有直接關(guān)聯(lián)。一般而言，茶樹鮮葉中含有的揮發(fā)性物質(zhì)種類較成品茶少，大多屬于低沸點(diǎn)、低分子量的烷烴、醇、醛及萜類化合物等物質(zhì)。在茶樹生長發(fā)育過程中，氮可直接或間接影響鮮葉內(nèi)游離香氣的組成和含量。因此，茶樹鮮葉的氣味物質(zhì)組分及含量，可反映茶樹的氮營養(yǎng)狀況。同時(shí)，茶樹在缺氮下葉片呈現(xiàn)不同程度的黃化現(xiàn)象，從而引起葉片表面顏色的變化，因此也可以利用顏色對茶樹葉片缺氮狀況進(jìn)行評價(jià)。電子鼻是一種模擬人類嗅覺系統(tǒng)的人工智能電子儀器，可以用來測量一種或多種物質(zhì)的氣體敏感系統(tǒng)，被廣泛應(yīng)用于肉類[7]、酒類[8]的品質(zhì)評價(jià)和蘋果[9]、梨[10]、茶葉[11]等農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)評價(jià)的研究。分光測色儀具有檢測速度快、精度高、適合在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境及生產(chǎn)環(huán)境中離線操作等優(yōu)點(diǎn)，利于實(shí)際應(yīng)用推廣。通過電子鼻與分光測色儀來檢測茶樹葉片的氣味和顏色，能夠更加全面快速地反映葉片的缺氮程度。但目前尚無將電子鼻與分光測色儀相結(jié)合來識別茶樹葉片氮含量的報(bào)道。

本文以電子鼻和分光測色儀檢測技術(shù)為基礎(chǔ)，研究氣味和顏色與茶樹葉片氮含量的關(guān)系，通過提取反映氣味與顏色的特征參數(shù)，建立基于氣味與顏色的氮含量預(yù)測模型，從而確立一種茶樹葉片氮含量簡便易行的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試茶樹葉片來自山東省泰安市東興農(nóng)業(yè)有限公司茶園。將茶樹葉片按葉色分為黃色 (Y)、黃綠色(YG)、綠色 (G)、深綠色 (DG) 四個(gè)等級 (圖 1)。試驗(yàn)所用樣品為茶樹頂芽向下第3～4片無損傷葉片。取樣后立即送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測定。

1.2 電子鼻系統(tǒng)及檢測參數(shù)優(yōu)化

圖 1 不同等級茶樹葉片F(xiàn)ig. 1 Color of tea leaf in different grades

試驗(yàn)以綠色 (G) 等級的茶樹鮮葉為研究對象進(jìn)行電子鼻參數(shù)優(yōu)化。20片葉為一個(gè)試驗(yàn)樣本 (課題組前期預(yù)備試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，20片葉所得結(jié)果最佳，過多過少都會(huì)降低檢測的準(zhǔn)確性)，樣本質(zhì)量控制在 (5.0 ± 1.0) g。采摘后立刻將茶葉樣品放入盛有吸水紙和Na2CO3(烘干后使用) 的三角瓶中用錫箔紙封口，采用頂空吸氣法利用PEN3型便攜式仿生電子鼻系統(tǒng) (PEN3，Airsense Analytics GmbH，Germany) 進(jìn)行氣體檢測分析，PEN3具有十個(gè)金屬氧化物傳感器，如表1所示。

本試驗(yàn)主要優(yōu)化因子為氣體收集器體積、頂空預(yù)熱溫度、頂空時(shí)間。氣體收集瓶體積試驗(yàn)設(shè)50、100、150 mL 3個(gè)處理；頂空預(yù)熱溫度試驗(yàn)設(shè)30、40、50、60、70、80℃ 6個(gè)處理；頂空時(shí)間試驗(yàn)設(shè)5、10、15、20、25、30 min 6個(gè)處理。每組有20次重復(fù)。

電子鼻檢測參數(shù)為傳感器清洗時(shí)間100 s，自動(dòng)調(diào)零時(shí)間10 s，樣品準(zhǔn)備時(shí)間5 s，樣品測定間隔時(shí)間1 s，內(nèi)部流量300 mL/min，進(jìn)樣流量300 mL/min，將80～83 s處的信號作為傳感器信號分析的時(shí)間點(diǎn)。每次測量前后，傳感器進(jìn)行清洗和標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 茶樹葉片色度檢測

本試驗(yàn)使用美能達(dá)CM-5分光色差儀對茶樹葉片色度值進(jìn)行測定。樣品的測量部位是葉肉區(qū)，每組20次重復(fù)。色度值主要包括L、a、b值。L表示黑白或者亮暗，+為偏白或亮，-為偏黑或暗；a表示紅綠，+為偏紅，-為偏綠；b表示黃藍(lán)，+為偏黃，-為偏藍(lán)。

1.4 茶葉葉片總氮含量測定

用凱氏定氮法[12]測定茶葉總氮含量。稱磨細(xì)烘干的茶葉樣品 (過0.25～0.50 mm篩) 0.4 g。然后加入濃硫酸，置于消化爐上進(jìn)行消化，最后得到消化液。取消化液5 mL，置于50 mL容量瓶中，加入5 mL 40% NaOH溶液和5 mL含有混合指示劑的硼酸溶液進(jìn)行蒸餾。用0.025 mol/L H2SO4標(biāo)準(zhǔn)液對蒸餾液進(jìn)行測定。

1.5 數(shù)據(jù)的提取、處理及模型建立

1.5.1 電子鼻傳感器數(shù)據(jù)特征值的提取 電子鼻傳感器響應(yīng)值表示方法：Ri= G/G0。式中，Ri為第i個(gè)傳感器輸入的信號比值；G為傳感器接觸到樣品揮發(fā)物后的電阻量 (Ω)；G0為傳感器在零氣 (經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)活性碳過濾后的氣體) 中的電阻量 (Ω)。

1.5.2 數(shù)據(jù)處理 采用電子鼻自帶Winmuster軟件將經(jīng)過優(yōu)化后的傳感器響應(yīng)特征值進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)、線性判別法分析 (linear discriminant analysis，LDA) 和負(fù)荷加載分析 (loadings analysis，LA)。采用Origin 8.0軟件對測色儀L、a、b值分別進(jìn)行一元線性回歸分析 (one variant linear regression analysis)。利用SPSS 16.0軟件采用LSD法進(jìn)行單因素方差分析 (one-way Anova)，并進(jìn)行t檢驗(yàn)。

表1 PEN3型電子鼻傳感器性能Table 1 Sensor sensitivities of the PEN3 e-nose

1.5.3 模型的建立及驗(yàn)證 每個(gè)等級葉片選擇50個(gè)樣本用于建立模型。另外隨機(jī)選擇30個(gè)樣本對所建模型進(jìn)行驗(yàn)證測試。采用SPSS 16.0軟件建立氣味—氮含量、顏色—氮含量、氣味顏色—氮含量線性回歸模型。通過模型的預(yù)測值與實(shí)際測定值對比，驗(yàn)證預(yù)測模型的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻傳感器優(yōu)化

由于10個(gè)傳感器所側(cè)重檢測的氣體成分不同，因此電子鼻傳感器對茶樹葉片氣味物質(zhì)的響應(yīng)存在差異。由圖2-a、b、c可見，在頂空時(shí)間、氣體收集器的容積、頂空預(yù)熱溫度三個(gè)優(yōu)化參數(shù)中，S2、S6、S7、S8、S9五個(gè)傳感器的響應(yīng)值發(fā)生了較大的變化。在頂空時(shí)間參數(shù)中，傳感器S2、S6、S7、S8、S9的響應(yīng)值變化范圍分別為2.84～8.40、2.29～3.33、3.48～9.34、1.42～1.87、2.64～5.85。在氣體收集器容積參數(shù)中，傳感器S2、S6、S7、S8、S9的響應(yīng)值變化范圍分別為2.74～2.94、2.31～2.64、3.20～3.49、1.47～1.56、2.67～2.80。在頂空溫度參數(shù)中，傳感器S2、S6、S7、S8、S9的響應(yīng)值變化范圍分別為2.94～12.15、2.51～6.23、3.48～13.35、1.56～2.92、2.78～8.76。從三個(gè)參數(shù)中的響應(yīng)值來看，S2、S7、S9大于S6、S8。此外，S1、S3、S4、S5、S10 五個(gè)傳感器響應(yīng)值均在1.0左右，表明這些傳感器對氣體物質(zhì)的響應(yīng)不敏感。

過載分析通常用來考察傳感器對模型PCA數(shù)據(jù)空間分布的影響，據(jù)此可判定模型中傳感器區(qū)分能力的大小。通常傳感器坐標(biāo)值離原點(diǎn) (0，0) 越遠(yuǎn)，傳感器區(qū)分樣品的能力越大。由圖2d可知，對葉片氣味識別能力最大的傳感器為S6，其次為S9、S7、S2、S8，其他傳感器沒有明顯的識別能力。葉片揮發(fā)物氣體的主要成分為甲烷、有機(jī)硫化物、無機(jī)硫化物、氮氧化合物和醇類、醛類、酮類。依據(jù)表1中各傳感器的敏感成分，選擇S2、S6、S7、S8、S9為后續(xù)試驗(yàn)主要傳感器。

2.2 前處理優(yōu)化

電子鼻傳感器響應(yīng)信號除受到外界環(huán)境及自身特性的影響外，還受到氣體收集容器內(nèi)壓強(qiáng)及揮發(fā)性物質(zhì)濃度的影響，因此，收集容器的大小直接影響傳感器的信號識別。PCA分析可見，50、100、150 mL氣體收集容器的氣味位點(diǎn)兩兩重疊 (圖3 a-1)，LDA分析發(fā)現(xiàn)，容器體積為100 mL和150 mL處理的氣味位點(diǎn)有重疊，而50 mL處理的氣味位點(diǎn)較為集中，區(qū)分明顯 (圖3 a-2)。因此，試驗(yàn)選取50 mL為最終氣體收集器體積。

由不同PCA分析來看，頂空預(yù)熱溫度為30℃的氣味位點(diǎn)比較集中，而50、60、70、80℃處理氣味位點(diǎn)群內(nèi)離散程度大 (圖3 b-1)。LDA數(shù)據(jù)分析可見，30℃和40℃的氣味位點(diǎn)可以清楚區(qū)分開。但當(dāng)溫度升高后處理間出現(xiàn)重疊區(qū)域 (圖3 b-2)?？傮w來看，溫度較低時(shí)，樣品氣味位點(diǎn)較為集中，無重疊區(qū)域，且區(qū)分明顯。因此，基于PCA和LDA數(shù)據(jù)分析，頂空預(yù)熱溫度最終選擇為30℃。

由圖3 c-1和c-2數(shù)據(jù)分析來看，30 min處理樣品點(diǎn)數(shù)據(jù)離散程度小，并且與其他處理無重疊，其它幾組處理都有重疊區(qū)域。因此，試驗(yàn)最終選取頂空時(shí)間為30 min。

2.3 茶樹鮮葉的電子鼻檢測

取80～83s時(shí)間點(diǎn)的氣味響應(yīng)值數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA和LDA分析 (圖4)。在PCA分析中第1主成分和第2主成分總的貢獻(xiàn)率為99.37%。黃綠色葉片 (YG) 分析結(jié)果與黃色 (Y)、綠色 (G) 和深綠色 (DG) 葉片有小部分重疊，說明在一定程度上利用PCA分析法可將不同氮素含量的茶樹葉片用電子鼻進(jìn)行區(qū)分。由LDA分析可知，2個(gè)判別因子累計(jì)貢獻(xiàn)率82.89%，DG能夠與其它處理區(qū)分開，但距離較近，表明不同氮素含量的茶樹葉片所揮發(fā)的氣體組分存在一定的相似性。

2.4 茶樹葉片色度檢測

隨氮素缺乏程度的加重，茶樹葉片表面顏色從綠色逐漸變成黃色。圖5表明，色度值參數(shù)的選擇影響色度值與葉片氮含量的相關(guān)性。在Lab表色系統(tǒng)中，+b表示黃色，+b值越大表示所測樣品黃色程度越重。本試驗(yàn)中b值 (表示黃藍(lán)) 均大于0，與總氮含量呈現(xiàn)線性相關(guān)，且其決定系數(shù)為0.9204，說明b值與葉片黃化有極顯著的相關(guān)性。L值 (黑白)與葉片總氮含量的線性相關(guān)性最低，a值 (紅綠) 雖然呈現(xiàn)出一定的線性，但決定系數(shù)低于b值。因此，b值可以作為判斷葉片氮含量的一個(gè)標(biāo)志 (圖5)。

2.5 葉片氮含量預(yù)測模型的建立

2.5.1 建模因子的單因素方差分析 優(yōu)化后的電子鼻傳感器S2、S6、S7、S8、S9和測色儀b值與茶樹葉片氮含量的P值均小于0.05，表明各因子與氮含量存在極顯著的相關(guān)性，可以利用表2中因子進(jìn)行建模。

圖 2 10個(gè)傳感器對不同優(yōu)化條件下樣品的響應(yīng)值曲線及過載分析Fig. 2 Response curve and loading analysis of 10 different sensors for samples under different optimized conditions

圖 3 電子鼻80～83 s時(shí)間點(diǎn)氣味數(shù)據(jù)的主成分分析 (PCA) 及線性判別分析 (LDA)Fig. 3 PCA and LDA analysis of odor intensity data by electronic nose at 80-83 s

圖 4 PCA和LDA方法分析的四類顏色葉片電子鼻氣味響應(yīng)值的分布Fig. 4 Odor intensity distribution of the four colors of fresh tea leaves by electric nose based on PCA and LDA

圖 5 茶樹葉片氮素含量與L、a、b值線性回歸Fig. 5 Linear regression of nitrogen contents of tea leaves with L, a and b values

2.5.2 三種葉片氮含量預(yù)測模型的建立 1) 基于氣味的葉片氮含量預(yù)測模型，即選取響應(yīng)值較大的S2、S6、S7、S8、S9號傳感器響應(yīng)值 (R2、R6、R7、R8、R9) 對不同氮含量葉片建立預(yù)測模型?；跉馕兜牟铇淙~片氮含量 (Y) 預(yù)測模型為：Y =216.496 - 109.843R2 - 41.831R6 + 0.205R7 -17.857R8 - 43.696R9。由表3模型Ⅰ可見，P值小于0.05，表明該模型線性相關(guān)顯著。

2) 基于顏色的葉片氮含量預(yù)測模型，即將b值與葉片氮含量相結(jié)合建立預(yù)測模型。基于顏色的不同氮素含量葉片判別模型為：Y = 5.052 - 0.058b。將b值帶入上式，得出的Y值即判為該葉片氮素含量。由表3中模型Ⅱ可見，P值小于0.05，說明該模型具有顯著性。

3) 基于氣味、顏色的葉片氮含量預(yù)測模型，即基于氣味結(jié)合顏色兩個(gè)測定值的茶樹葉片氮素含量預(yù)測模型為：Y = 29.663 - 17.207R2 + 7.843R6 -9.117R7 + 1.853R8 - 7.894R9 - 0.061b。將響應(yīng)值R2、R6、R7、R8、R9、b值帶入上式，得出的Y值即判為該葉片氮素含量。由表3中模型Ⅲ可見，P值小于0.05，說明該模型具有顯著性。

表2 傳感器及色差值對茶樹葉片氮含量的方差分析Table 2 Anova analysis of nitrogen contents of tea leaves by sensors and chromatic aberration value

表3 三種預(yù)測模型的方差分析Table 3 Anova analysis of three prediction models

2.5.3 預(yù)測模型驗(yàn)證 三種模型分別利用30個(gè)樣本氮素含量的預(yù)測值和實(shí)測值的差異驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確率 (表4)。模型Ⅰ和模型Ⅱ中各有6個(gè)樣本的預(yù)測值與測定值相差較大，模型準(zhǔn)確率均為80%。模型Ⅲ中有3個(gè)樣本的預(yù)測值與測定值相差較大，模型準(zhǔn)確率為90%。通過比較以上3種葉片氮素含量預(yù)測模型的準(zhǔn)確率可以看出，氣味結(jié)合顏色建立的模型準(zhǔn)確率最高。因此，氣味結(jié)合顏色的預(yù)測模型較優(yōu)。

3 討論

電子鼻作為一種非常有潛力的鑒別工具，在食品、農(nóng)產(chǎn)品檢測領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。電子鼻中不同傳感器對樣品的識別貢獻(xiàn)率存在著較大的差異。殷勇等[13]基于響應(yīng)信號的積分值、平均微分值、相對穩(wěn)態(tài)平均值的表征變量對傳感器進(jìn)行了篩選，從而減少了信息冗余及計(jì)算復(fù)雜度，最終對霉變玉米最低鑒別正確率均在96%以上。唐琳等[14]確定了反映脊尾白蝦新鮮度變化的5個(gè)氣敏傳感器，通過傳感器數(shù)據(jù)建立的預(yù)測模型準(zhǔn)確率可達(dá)92%以上?？梢妭鞲衅鞯暮Y選對于電子鼻對樣品的識別度有極為重要的意義。本試驗(yàn)首先優(yōu)化了電子鼻的10個(gè)傳感器，確定了S2、S6、S7、S8、S9 作為最終的傳感器，以此建立了可以預(yù)測茶樹葉片氮含量的模型，預(yù)測準(zhǔn)確率可達(dá)到80%。

氣敏傳感器的響應(yīng)受到揮發(fā)性物質(zhì)的成分、濃度和壓強(qiáng)的影響，其中濃度和壓強(qiáng)則在電子鼻取樣的過程中，是可能隨時(shí)間變化的。本試驗(yàn)50 mL處理相對于100 mL、150 mL處理樣點(diǎn)能夠清晰區(qū)分，其原因可能是容器容積越大，頂空生成時(shí)間內(nèi)所形成的頂空氣體濃度越低，電子鼻傳感器對氣味的敏感度降低。而50 mL容器體積能夠在頂空時(shí)間內(nèi)聚集濃度較高的氣體揮發(fā)物，瓶內(nèi)壓強(qiáng)較大，有利于傳感器對氣體揮發(fā)物的捕捉檢測。其次，在試驗(yàn)中頂空預(yù)熱溫度的不同，電子鼻傳感器靈敏度也存在差異。傳感器對30℃和40℃的樣品區(qū)分效果較好。雖然預(yù)熱溫度較低，收集器中揮發(fā)性物質(zhì)成分的濃度降低，但同時(shí)水汽含量減少，削弱了水汽對傳感器敏感性的影響。當(dāng)樣品溫度升高 (50℃～80℃)，水汽成分增大，雖然試驗(yàn)中添加了吸收水分的設(shè)置，但在一定程度上掩蓋了不同組分間在揮發(fā)性物質(zhì)成分上的差異，極大地影響了某些傳感器的敏感性，造成樣品的組內(nèi)離差變大，組間離差變小。此外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)頂空生成時(shí)間較長的樣品 (頂空30 min)，其區(qū)分度較高，這也與頂空生成時(shí)間的增加使樣品氣體揮發(fā)物的濃度增高，有利于電子鼻傳感器對揮發(fā)物的區(qū)分識別有關(guān)。

茶樹鮮葉中揮發(fā)性芳香物質(zhì)的種類及含量對于成品茶香氣的最后形成意義重大。一般而言，茶樹鮮葉中揮發(fā)性香氣物質(zhì)較成品茶少，大約有80余種[15]，大多屬于低沸點(diǎn)、低分子量的香氣物質(zhì)，如反-2-庚烯醛、順-3-己烯-1-醇、己醇等[16-17]。這些化合物為植物葉片提供“綠葉”、“青草”或“新鮮植物”味[18]。氮素不僅可以影響茶葉的產(chǎn)量和質(zhì)量，還可影響揮發(fā)性化合物關(guān)鍵前體的合成[19-20]。因此，合理的施氮量均有利于香氣成分的合成[21]。過少或不施氮?jiǎng)t影響前體物向芳香成分的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致芳香物質(zhì)含量低[16,22-23]。因此，通過對氣體揮發(fā)物的測定來預(yù)測氮素含量是可行的。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)一定缺氮程度的葉片不能被電子鼻顯著區(qū)分開，其原因可能是葉片的主要揮發(fā)性物質(zhì)比較相近，傳感器無法識別Y、YG、G處理三者共有香氣組分的差異，從而導(dǎo)致LDA分析中有部分重合。因此，下一步我們將用多特征融合模式更有效地表征電子鼻對茶樹葉片的響應(yīng)信息，有利于提高鑒別的正確率。

表4 基于不同預(yù)測模型的葉片氮含量預(yù)測值及測定值 (%)Table 4 N content of tea leaves by the three model prediction and measurement

4 結(jié)論

1) 采用電子鼻測定葉片氮素含量時(shí)，鮮葉樣品前處理的適宜條件為氣體收集器體積為50 mL、頂空預(yù)熱溫度為30℃、頂空時(shí)間為30 min；傳感器型號以S2、S6、S7、S8、S9較為適宜；以表征黃藍(lán)的b值作為分光測色儀檢測茶樹葉片氮含量的指標(biāo)較為敏感。

2) 基于氣味、顏色以及二者結(jié)合建立的葉片氮含量預(yù)測模型中，以氣味與顏色相結(jié)合的氮含量預(yù)測模型的準(zhǔn)確率最高，達(dá)到90%。因此，進(jìn)行茶葉氮素營養(yǎng)診斷時(shí)，建議采用氣味和顏色兩個(gè)指標(biāo)，以提高檢測的準(zhǔn)確率。