白扁豆中派可林酸的定性定量研究

陳 丹1 李 柯* 侯 茜 吳梅青1 李若存

1.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭 411102；2.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410013

白扁豆系豆科植物扁豆DolichoslablabL.的干燥成熟種子，為常用的藥食兩用植物，分布廣泛，應(yīng)用歷史悠久，具有健脾化濕，和中消暑的功效。富含脂肪、多糖、蛋白質(zhì)、鈣、鐵、磷、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，臨床多用于脾胃虛弱，食欲不振，大便溏泄，白帶過多，暑濕吐瀉，胸悶腹脹[1-5]。2015年版《中國(guó)藥典》中白扁豆藥材的質(zhì)量控制主要包括性狀、橫切面鑒別、水分檢查，未有定性定量指標(biāo)來評(píng)價(jià)其質(zhì)量。關(guān)于白扁豆質(zhì)量分析方面的報(bào)道較少，僅有白扁豆中總磷脂的含量測(cè)定[6]。課題組通過對(duì)白扁豆的作用研究，發(fā)現(xiàn)其所含派可林酸具有明顯降低番瀉葉致小鼠腹瀉模型小腸運(yùn)動(dòng)的作用[7]。研究以派可林酸為指標(biāo)成分，對(duì)10個(gè)不同產(chǎn)地12批次白扁豆藥材進(jìn)行定性定量分析，以提高和完善白扁豆藥材現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以期作為白扁豆藥材的開發(fā)利用與臨床應(yīng)用的評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料 白扁豆來自河南(20170424、20170-325)、黑龍江(20160822)、江西(20160212)、云南(20160617)、湖南(20160618、20160824)、廣西(20161005、20160826)、貴州(20160524)、安徽(20160924、20161015)8個(gè)省份，共12批次，均由湖南省中醫(yī)藥研究院李若存研究員鑒定為豆科植物扁豆DolichoslablabL.的干燥成熟種子。對(duì)照品派可林酸(批號(hào)111751-200601)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其它試劑均為分析純。

1.2 儀器 LC-20AT 高效液相色譜儀(SPD-20A紫外-可見檢測(cè)器，SHIMADZU LabSolution數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，日本島津)；XPE-105十萬(wàn)分之一電子分析天平(瑞士Mettler Toledo)；HX-06型超聲波清洗器(武漢恒信世紀(jì)科技有限公司)；HH-S2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；ZN-200A高速中藥粉碎機(jī)；80-2離心沉淀器；101-2電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；硅膠G薄層色譜板(青島化工)；0.45 μm微孔濾膜(Hypersil)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別 取白扁豆樣品，每批適量，分別粉碎，過80目篩，每批取粉末各2 g，分別加水20 mL，加熱回流20 min，離心，取上清液，蒸干，殘?jiān)?0%乙醇5 mL使溶解，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取派可林酸對(duì)照品適量，加稀乙醇分別制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取供試品溶液10 μL，對(duì)照品溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(6∶2.2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，如圖1所示。

2.2 含量測(cè)定[8-12]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：390 nm；流動(dòng)相：乙腈-二甲基甲酰胺-0.025 mol/L醋酸鈉溶液(21∶0.5∶79)；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；理論板數(shù)按派可林酸峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取派可林酸對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 mL，置10 mL具塞試管中，加水1 mL，加0.8%2,4-二硝基氟苯乙腈溶液2 mL和0.5 mol/L碳酸氫鈉溶液2 mL，于60℃水浴中1 h，取出放冷，移至10 mL量瓶中，用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)分?jǐn)?shù)次洗滌溶器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取白扁豆藥材粉末(批號(hào)：20170424)約1.0 g，精密稱定，置10 mL具塞試管中，加水適量，充分振搖后，于60℃水浴中加熱30 min，取出，放冷，移至10 mL量瓶中，用水分?jǐn)?shù)次洗滌容器，洗液并入量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。離心(12000 r/min)10 min，精密量取上清液2 mL，置10 mL具塞試管中，加0.8%2,4-二硝基氟苯乙腈溶液2 mL和0.5 mol/L碳酸氫鈉溶液2 mL，于60℃水浴中1 h，取出放冷，移至10 mL量瓶中，用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)分?jǐn)?shù)次洗滌溶器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按2.2.1色譜條件測(cè)定，即得。結(jié)果如圖2所示。

2.2.5 線性關(guān)系考察 取派可林酸對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；分別精密吸取0.2、 0.5、1、1.5、2 mL，置10 mL具塞試管中，分別加水1.8、1.5、1、0.5、0 mL，加0.8%2，4-二硝基氟苯乙腈溶液2 mL和0.5 mol/L碳酸氫鈉溶液2 mL，于60℃水浴中1h，取出放冷，移至10 mL量瓶中，用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)分?jǐn)?shù)次洗滌溶器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得。按2.2.1色譜條件測(cè)定其峰面積，以派可林酸濃度(μg/ mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：y=(5E+06)x+57506，r=0.9992。結(jié)果表明派可林酸在4.6～46 μg/ mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，派可林酸峰面積的RSD為1.50%，說明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)：20170424)，分別在0、4、8、12、24 h精密吸取10 μL，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算結(jié)果RSD為0.59%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品(批號(hào)：20170424)6份，分別制備供試品溶液，測(cè)定、計(jì)算。結(jié)果6份樣品平均含量為1.60 mg/g，RSD為1.28%，說明方法重復(fù)性良好。

2.2.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的白扁豆樣品(批號(hào)：20170424)粉末6份，每份約0.5 g，向各份樣品中精密加入派可林酸對(duì)照品溶液(每1 mL含派可林酸0.23 mg)3.5 mL，照供試品溶液的方法制備，按上述條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，平均值為101.15%，RSD為2.79%。結(jié)果見表1。

2.2.10 12批白扁豆測(cè)定數(shù)據(jù) 分別取12批白扁豆，按2.2.3供試品溶液制備方法制備供試品溶液，每批兩份，分別精密吸取各供試品溶液10 μL，進(jìn)樣，按2.2.1色譜條件，依法測(cè)定峰面積，計(jì)算各供試液中派可林酸的含量，結(jié)果見表2。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 白扁豆藥材派可林酸含量測(cè)定 (n=2)

3 討論

3.1 提取溶劑的考察 分別采用水、40%乙醇及乙醇對(duì)白扁豆進(jìn)行提取，提取液衍生后測(cè)定，結(jié)果用水作溶劑，派可林酸含量最高，但水作溶劑，提取后溶液較難過濾，因此須采用離心的方法。

3.2 衍生劑用量的考察 試驗(yàn)中比較了衍生劑的用量1 mL、2 mL、3 mL，結(jié)果加1 mL 0.8%2,4-二硝基氟苯乙腈溶液作衍生劑，雖然派可林酸含量與加2 mL或3 mL差不多，但由于峰面積對(duì)比可知，衍生劑用量為1.0 mL時(shí)并未反應(yīng)完全，說明衍生化不完全，加2 mL或3 mL 0.8%2,4-二硝基氟苯乙腈溶液作衍生劑，派可林酸含量與峰面積均相差不大，因此選擇2 mL。

3.3 衍生溫度的考察 比較了40 ℃、60 ℃、80 ℃水浴中各放置1 h，結(jié)果40 ℃下制備的供試液與對(duì)照品溶液派可林酸峰面積最小，說明衍生化不完全，置于60 ℃或80 ℃水浴中1 h，派可林酸峰面積與含量無(wú)差別，因此選擇60 ℃。

3.4 含量測(cè)定結(jié)果分析 應(yīng)用所建立的方法對(duì)12批白扁豆中派可林酸進(jìn)行含量測(cè)定，12批平均含量為0.13%，最高含量0.24%，最低含量為0.06%，其中含量大于0.08%的有10個(gè)樣品，占全部樣品的83.3%。

研究建立了派可林酸定性、定量測(cè)定方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，建議進(jìn)一步增加樣本量，制定合理的限度，同時(shí)對(duì)派可林酸的藥效深入研究，從而更加科學(xué)、全面地控制白扁豆的質(zhì)量。