防風(fēng)色原酮類成分的近紅外光譜定量分析

薛雪　熊慧　劉夢楠　屈文佳　賈天穎　王海麗　辛潔萍　徐新房　李向日

摘要?目的：本文建立了能快速測定防風(fēng)中升麻素、4種色原酮含量之和的近紅外光譜定量模型。方法：用高效液相色譜法測定55批防風(fēng)飲片的4種色原酮的含量作為參考值，結(jié)合偏最小二乘回歸法（PLS）建立回歸模型。篩選了不同的光譜預(yù)處理方法、波段及最佳因子數(shù)，最終模型通過相關(guān)系數(shù)（R2）、預(yù)測均方根誤差（RMSEP）和校正均方差（RMSEC）來評估其穩(wěn)健性。結(jié)果：升麻素的最佳RMSEP值、RMSEC值、R2分別為0.025 0、0.024 0、0.949 9，4種色原酮含量總和的最佳RMSEP值、RMSEC值、R2分別為0.2460、0.1720、0.9110。結(jié)論：本研究建立的近紅外光譜定量模型較準(zhǔn)確，可用于對防風(fēng)質(zhì)量的快速檢測。

關(guān)鍵詞?防風(fēng);近紅外;質(zhì)量;色原酮;升麻苷;升麻素;5-O-甲基維斯阿米醇苷;亥茅酚苷

Quantitative Analysis of Chromones in Saposhnikoviae Radix by Near Infrared Spectroscopy

Xue Xue，Xiong Hui，Liu Mengnan，Qu Wenjia，Jia Tianying，Wang Haili，Xin Jieping，Xu Xinfang，Li Xiangri

（School of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 102488，China）

Abstract?Objective：To rapidly establish the detection method for cimifugin and the amounts of four chromones in Saposhnikoviae Radix by near infrared spectroscopy. Methods：The contents of four chromones of 55 batches of Saposhnikoviae Radix was determined by high performance liquid chromatography as reference value. Combined with partial least squares regression（PLS），the regression model was established. Different spectral pretreatment methods，wave ranges and optimal factors were selected. The stability of the models were evaluated by R2，RMSEP and RMSEC. Results：The optimum RMSEP values，RMSEC values and R2 values of cimifugin were 0.025 0，0.024 0 and 0.949 9，respectively. The optimum RMSEP values，RMSEC values and R2 values of the amounts of four chromones were 0.2460，0.1720 and 0.9110，respectively. Conclusion：The NIR quantitative models established in this study are accurate and can be used for rapid detection of quality of Saposhnikoviae Radix.

Key Words?Saposhnikoviae Radix; Near-infrared; Quality; Chromone; Prim-O-glucosyl-cinmifugin; Cimifugin; 4-O-β-D-glucosyl-5-O-methylvisamminol; Sec-O-glucosylhamaudol

中圖分類號：R284文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.03.011

防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikovia Divaricata（Turcz.）Schischk.的干燥根[1]，其藥性辛、甘，微溫;歸膀胱、肝、脾經(jīng)。具有祛風(fēng)解表，勝濕止痛，止痙的功效。防風(fēng)始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》并被列為上品，現(xiàn)主要產(chǎn)于黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北等省區(qū)，是臨床常用大品種，應(yīng)用廣泛。防風(fēng)化學(xué)成分復(fù)雜，主要有色原酮類、香豆素類、多糖類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油等成分，現(xiàn)代藥理實驗表明，色原酮類化合物具有良好的解熱、抗炎等活性[2]，升麻苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷（下文簡稱“4種色原酮”）是防風(fēng)中主要的色原酮類成分，常被作為指標(biāo)性成分評價防風(fēng)飲片的質(zhì)量[3]。其中升麻素是防風(fēng)的主要藥效成分及入血成分，也是升麻苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的苷元，二者在血中轉(zhuǎn)化為升麻素從而發(fā)揮藥效[4]，因此升麻素對于說明防風(fēng)飲片的品質(zhì)具有重要的意義。

《中華人民共和國藥典》（2015年版）中規(guī)定采用高效液相色譜法測定升麻苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量之和，該方法需要對樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，分析時間較長，成本較高，易造成污染，無法滿足對樣品快速測定和在線檢測的要求。近紅外光譜技術(shù)是近年來在中藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的新技術(shù)，它是將化學(xué)計量學(xué)技術(shù)、近紅外光譜檢測技術(shù)和基礎(chǔ)測量技術(shù)相結(jié)合的新方法，具有綠色、無損、快速、無需前處理等優(yōu)勢。因此本文利用近紅外光譜技術(shù)，結(jié)合偏最小二乘法，建立防風(fēng)飲片中升麻素、4種色原酮總和的定量分析模型，達(dá)到快速測定升麻素、4種色原酮之和的含量的目的，為防風(fēng)飲片的質(zhì)量檢測提供快捷簡便的新方法。

1?儀器與試藥

1.1?儀器

Waters 2695高效液相色譜儀;Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）;電子分析天平;FW100高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）;B-220電熱恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）;Antaris傅立葉變換近紅外光譜儀（Thermo Nicolet公司，光源：鹵鎢燈，軟件Result 3.0用于光譜采集，軟件TQ Analyst 7.2用于光譜分析），配備InGaAs檢測器，光纖附件。

1.2?試藥

防風(fēng)樣品有49批分布于黑龍江佳木斯市湯原縣、吉林省洮南市軍馬場、內(nèi)蒙古阿榮旗、河北安國市婁營村等4個省、10個地區(qū)，另有6批樣品分布于蒙古國、俄羅斯2個國家，共計55批，均為課題組人員親自采集，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)李向日教授鑒定為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk.的干燥根。將以上55批飲片樣品粉碎，過六號篩。

甲醇（色譜純，F(xiàn)isher公司），娃哈哈純凈水，甲醇等其他試劑均為分析純。對照品升麻苷（批號0083-0025），升麻素（批號0084-0020）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號0081-0025）、亥茅酚苷（批號0969-0025），購自成都普思生物科技股份有限公司。

2?方法

2.1?NIR光譜采集

光譜采集范圍為10 000～4 000 cm-1，分辨率8 cm-1，掃描次數(shù)64次，波長間隔為2 cm-1。以儀器內(nèi)置背景為參比，對55批防風(fēng)飲片的粉末進(jìn)行光譜采集，為減小實驗誤差，每份樣品重復(fù)測定兩次，取平均光譜。55批防風(fēng)飲片樣品的近紅外光譜疊加圖見圖1。

2.2?防風(fēng)中4種色原酮含量的HPLC測定

2.2.1?色譜條件

采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），檢測波長254 nm，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流動相為甲醇（A）-水（B）梯度洗脫（0～5 min，15～35%A;5～15 min，35%A;15～20 min，35～45%A;20～29 min，45%A;29～35 min，45～55%A;35～40 min，55～63%A）。

2.2.2?供試品溶液的制備

取細(xì)粉約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱定重量，水浴回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3?對照品溶液的制備

取升麻苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷對照品各適量，加甲醇分別配制成濃度為0.201 0 mg/mL、0.078 0 mg/mL、0.277 2 mg/mL、0.033 0 mg/mL的對照品溶液，即得。

2.2.4?方法學(xué)考察

2.2.4.1?標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取各對照品溶液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分別用甲醇稀釋于10 mL容量瓶中，即得各系列濃度對照品溶液。不同濃度的4種對照品溶液分別進(jìn)樣10 μL，以濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算回歸方程。見表1。

2.2.4.2?精密度試驗

取升麻苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷對照品各適量，加甲醇分別配制成濃度為0.016 1 mg/mL、0.006 2 mg/mL、0.015 8 mg/mL、0.013 2 mg/mL的對照品溶液。精密吸取對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，各對照品峰面積RSD均<1%，符合要求，表明儀器精密度良好。

2.2.4.3?穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，所測4種成分的色譜峰的峰面積RSD均小于2%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4.4?重復(fù)性試驗

取同一批樣品細(xì)粉6份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，所測4種成分的色譜峰的峰面積RSD均小于3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.4.5?加樣回收率

精密稱定已知含量的防風(fēng)樣品0.125 g，精密加入各對照品適量，按供試品溶液制備及測定法操作，進(jìn)行色譜分析。結(jié)果所測4種成分的平均回收率（n=6）分別為95.22%、96.78%、95.55%、98.53%，RSD都在2%以內(nèi)。

2.2.5?樣品的測定

精密吸取供試品溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄40 min色譜圖。見圖2。

2.3?光譜預(yù)處理

光譜采集的過程會受多種因素的影響，除樣品信息外，還有噪聲、基線漂移和無用信息。在建立近紅外定量模型之前，需要對近紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理，同時提取光譜特征。常用的預(yù)處理方法有多元散射校正法（MSC）、標(biāo)準(zhǔn)歸一化法（SNV），一階導(dǎo)數(shù)法（First Derivative），二階導(dǎo)數(shù)法（Second Derivative），SG濾波平滑（Savitzky-Golay Filter Smoothing），Norris導(dǎo)數(shù)濾波平滑（Norris Derivative Filter Smoothing）等。

2.4?模型的建立

本研究采用偏最小二乘回歸法（PLS）建立定量模型。以校正均方差（RMSEC）、交叉驗證均方差（RMSECV）、預(yù)測均方差（RMSEP）和R2等來評價最終PLSR模型的性能。

3?結(jié)果

3.1?防風(fēng)中4種色原酮成分的含量測定?見圖1。

3.2?近紅外定量模型的建立

3.2.1?校正集和驗證集樣品的選擇

為了確?；貧w模型的穩(wěn)健和精度，以3∶1的比例將55批樣品劃分為校正集和驗證集，包括校正集41批，驗證集14批。用校正集建立近紅外模型后，再將驗證集對模型進(jìn)行驗證。校正集與驗證集選擇時，需要保證驗證集樣品的含量范圍在校正集樣品的含量范圍之內(nèi)。樣品劃分結(jié)果及含量的分布范圍。見表2。

3.2.2?光譜預(yù)處理方法的選擇

使用不同光譜預(yù)處理方法后，比較校正集內(nèi)部的交叉驗證相關(guān)系數(shù)R2、校正均方差（RMSEC）及驗證集預(yù)測均方差（RMSEP）。由表3可以看出，采用PLS法建立近紅外定量分析模型，升麻素的最佳預(yù)處理方法為SNV+一階導(dǎo)數(shù)+Norris平滑，定量分析模型參數(shù)為R2為0.942 2，RMSEP為0.030 9，RMSEC為0.025 7;4種色原酮含量之和的最佳預(yù)處理方法為SNV+二階導(dǎo)數(shù)+SG平滑，定量分析模型參數(shù)為R2為0.911 0，RMSEP為0.246 0，RMSEC為0.172 0。此時，RMSEP和RMSEC均較小且接近[5]，R2>0.9，模型的預(yù)測結(jié)果較準(zhǔn)確。

3.2.3&nbsp;波段的優(yōu)選

在建立模型時，為了剔除近紅外光譜中的譜帶冗余信息，調(diào)整模型的準(zhǔn)確性，需要對建模波段進(jìn)行優(yōu)選。以RMSEP、RMSEC和R2為指標(biāo)，對不同波段進(jìn)行優(yōu)化比較。見表4。最終確定，升麻素的最佳建模波段為5 727.55～7 251.03 cm-1，4種色原酮含量之和的最佳建模波段為4 000～10 000 cm-1。

3.2.4?最佳因子數(shù)的選擇

采用PLS建立定量分析模型，選擇的主成分?jǐn)?shù)對模型的預(yù)測能力有很大的影響。主成分?jǐn)?shù)過少，信息缺失導(dǎo)致“欠擬合”現(xiàn)象;主成分?jǐn)?shù)過多，會出現(xiàn)“過擬合”現(xiàn)象而影響結(jié)果[6]。最佳因子數(shù)由交叉驗證均方差（RMSECV）決定。由圖4可知，升麻素、4種色原酮含量之和的最佳因子數(shù)分別為8和11，RMSECV分別為0.047 6和0.280 1。

3.2.5?近紅外定量模型的建立

經(jīng)過光譜預(yù)處理、波段的優(yōu)選、最佳因子數(shù)篩選，建立的最佳近紅外定量模型的參數(shù)如表5所示，2種模型的真實值與NIR預(yù)測值之間的相關(guān)圖。見圖5?？梢杂^察到2種模型的相關(guān)系數(shù)都在0.9以上，顯示出近紅外模型計算值和真實值之間良好的相關(guān)性。

4?討論

升麻苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷常被作為指標(biāo)性成分評價防風(fēng)飲片的質(zhì)量，4種色原酮含量之和能間接地反映防風(fēng)中色原酮類成分的含量高低，同時能更多反應(yīng)藥材的成分信息。此外，升麻素作為防風(fēng)的主要藥效成分、入血成分以及藥典2種色原酮的苷元，與防風(fēng)飲片療效發(fā)揮具有很強(qiáng)的相關(guān)性，也是區(qū)分防風(fēng)的野生與家種的重要指標(biāo)。因此本研究建立的2個近紅外定量模型對于快速評價防風(fēng)飲片質(zhì)量提供了依據(jù)。

近紅外主要由C-H、O-H、N-H等含氧基團(tuán)的倍頻和合頻吸收譜組成，本文測定的4種色原酮只由C、H、O組成，在近紅外譜區(qū)均有吸收，雖然2種測定的指標(biāo)都是由色原酮類化合物組成，但由于結(jié)構(gòu)不同，2種模型的具體參數(shù)如波段、預(yù)處理方法、最佳因子數(shù)有所差異。根據(jù)TQ Analyst 7.2光譜分析軟件中的算法程序篩選光譜范圍，得到4 069.06～6 371.65 cm-1、6 645.50～7 443.88 cm-1、4 350.62～5 947.39 cm-1等光譜區(qū)間。優(yōu)化以上波段，在RMSEP、RMSEC較低且接近，R2趨近于1時，模型的性能最優(yōu)，由此確定了2個模型的最佳波段。本研究表明近紅外光譜法分別在5 727.55～7 251.03 cm-1、4 000～10 000 cm-1波段范圍內(nèi)，以偏最小二乘算法，分別采用SNV+一階導(dǎo)數(shù)+Norris平滑、SNV+二階導(dǎo)數(shù)+SG平滑的預(yù)處理方法可同時實現(xiàn)對防風(fēng)中升麻素、4種色原酮之和的含量的快速測定。

2種模型的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.9，RMSEP、RMSEC都較小且接近，表明模型準(zhǔn)確、強(qiáng)壯，可以準(zhǔn)確地預(yù)測升麻素、4種色原酮之和的含量。相比高效液相色譜法、薄層色譜法等傳統(tǒng)方法，近紅外光譜法擁有無損、快速、環(huán)保的優(yōu)點，可以實現(xiàn)多種目的的快速檢測，對于種植、生產(chǎn)、使用單位快速了解防風(fēng)質(zhì)量具有重要意義。

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