基于形態(tài)與分子技術相結合的葉螨鑒定法探究

華展義 湯國謙

[摘要]葉螨是一種危害蔬果和植物的重要農業(yè)害蟲，其個體微小，同種類葉螨形態(tài)特征相似度高，外形可變性強，明顯的鑒別特征少，給傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定帶來了一定的困難。主要通過雄蟲外生殖器陽具端錘的性狀對葉螨進行鑒定，但存在一定的局限性，限于某個特定的發(fā)育階段，使得較近的物種區(qū)分困難，給葉螨科內個別種類的鑒定和描述帶來爭議，鑒于此，分子生物學技術被逐漸應用于葉螨的準確鑒定。本研究通過形態(tài)學和分子生物學相結合的鑒定手段，探索葉螨的準確鑒定方法。

[關鍵詞]葉螨;形態(tài)鑒定;分子鑒定

葉螨種類多、食性雜、危害重，以破壞寄主植物的營養(yǎng)器官葉子為主，取食葉片組織內柵欄層細胞的葉綠體和細胞液，導致葉片受傷脫落，嚴重時能導致整株植物死亡，一定程度上威脅農作物的質量和產量，給農業(yè)生產造成一定經濟損失。由于葉螨體型微小，伴隨寄主植物或者生長發(fā)育的條件改變而存在體色的差異，喜歡躲在植物葉背面取食，且受害植物初期的受害狀不明顯，導致因忽視沒有在初期及時做好防治，蟲口增多，對農作物造成嚴重的危害。

近些年來，農藥不合理使用導致農業(yè)害螨已經上升為主要害蟲，如何有效地對農業(yè)害螨進行防治，是推進農業(yè)發(fā)展需要重點考慮的問題。目前依據形態(tài)學的特征對葉螨屬物種進行鑒定，在昆蟲鑒定中存在主導作用。由于部分葉螨之間形狀相似，形態(tài)特征鑒定方法容易受到生物性別和發(fā)育階段的限制，單純依據形態(tài)學鑒定很容易造成鑒定錯誤，要求研究者須有分類學經驗才能較好地利用形態(tài)之間的差異進行物種鑒定，這些都一定程度上限制了對葉螨的快速、準確鑒定。隨著分子生物學技術的發(fā)展，分子鑒定技術也得到了發(fā)展，成為準確鑒定葉螨的另一種有效技術手段?；贒NA序列的分子生物學鑒定具有不受個體發(fā)育階段的影響和相對穩(wěn)定的特點，但是葉螨個體較小，不易從單個個體中提取基因組DNA，同時不同地理種群間由于長期的地理隔離和有限的基因漂流也會造成序列之間的變異，導致無法進行PCR擴增或序列比對失敗，無法準確地進行葉螨種類的鑒定，存在一定的局限性，因此PCR擴增前處理和擴增引物的選取則尤為關鍵[l-3]。針對以上單一鑒定手段難以準確對葉螨進行鑒定的現象，本文主要探討在傳統(tǒng)鑒定方法的基礎上結合分子生物學鑒定技術，對葉螨物種進行鑒定，旨在探索準確的鑒定方法。

1 形態(tài)學技術在葉螨鑒定中的應用

在我國形態(tài)學鑒定作為現階段最傳統(tǒng)、最簡單可行的方法，在葉螨鑒定中仍然起著重要的主導作用。形態(tài)學鑒定中所選取的表型性狀主要為多基因決定的數量性狀和符合孟德爾遺傳規(guī)律的單基因性狀，如體色、剛毛、觸角等顯示生物遺傳多態(tài)性的外觀性狀。

1.1 形態(tài)學在葉螨鑒定中的優(yōu)點

在檢驗檢疫工作中，需要準確、快速地鑒定植物檢疫中截獲的病蟲。形態(tài)學在葉螨鑒定中的主要優(yōu)點如下：

（1）鑒定過程簡便。鑒定過程中所需的鑒定儀器少，僅需要放大鏡和顯微鏡，操作相對簡易，通過放在放大鏡下面觀察，能直觀簡便找到主要的形態(tài)特征。

（2）鑒定時間短。對于有經驗的檢驗工作者，能在短時間內鑒定具有明顯形態(tài)鑒別特征的昆蟲，得m鑒定結果，這些都大大優(yōu)于分子鑒定技術。

（3）分類鑒定誤差小。在確保昆蟲標本完整性的前提下，可多次進行觀察試驗，方便不同類型的研究者進行重復試驗，將試驗結果與昆蟲模式標本比對，有助于減少鑒定錯誤。同時，形態(tài)學鑒定中間環(huán)節(jié)少，造成人為誤差概率低。

1.2 形態(tài)學在葉螨鑒定中的不足

葉螨屬種類多、體型微小，同時葉螨種間的性狀具有高度近似性，隨著調查的深入，形態(tài)學鑒定對于有細微差異的種類，往往找不到好的形態(tài)鑒別特征，滿足不了新發(fā)現的復合體及親緣種的鑒別需要，對形態(tài)學鑒定提出了挑戰(zhàn)，尤其是對于鑒定經驗不夠豐富的鑒定者而言，更加困難。由于葉螨在自然條件下具有性比偏雌的特性，雄性葉螨難以采集，為了獲得雄性個體，需要消耗一定的時間培養(yǎng)葉螨下一代，耗時較長，下面對形態(tài)學分類中的不足進行分析概括：

（1）葉螨性別不同、處于的發(fā)育階段不同等影響了形態(tài)學分類。

（2）葉螨遺傳可變性高，形態(tài)特征易受環(huán)境因素影響，形態(tài)鑒定存在一定難度。

（3）形態(tài)學方法無法準確地對隱種葉螨群體進行鑒定。

（4）進行形態(tài)學鑒定，對操作者的經驗和專業(yè)技術水平要求高，因此，在葉螨形態(tài)學發(fā)展中需要逐步培養(yǎng)一批專業(yè)知識人才。

（5）葉螨個體微小且在制作玻片時容易破裂或在膠液中錯位或滾動，導致標本不完整，影響葉螨形態(tài)學鑒定。

（6）由于受圖像景深及光鏡分辨率等因素的影響，高倍顯微鏡下雄螨陽具端鏈邊緣模糊。

1.3當前葉螨形態(tài)學特征鑒定的幾種常用方法

1.3.1 經典的形態(tài)特征鑒定法

在我國，傳統(tǒng)的形態(tài)特征鑒定法因外部形態(tài)較為直觀應用廣泛，研究者通過使用顯微鏡等顯微技術對葉螨的假頭、軀干、螯肢、須肢、體毛、體表紋理等形態(tài)特點進行鑒定，其因要求低、鑒定成本低而被廣泛采用，隨著顯微技術的不斷發(fā)展，形態(tài)學鑒定也能尋找更精細的特征，提高形態(tài)學分類的鑒定水平。例如趙巖等[4]利用環(huán)境掃描電鏡觀察人體超微蠕型螨。

1.3.2 數值分類法

數值分類法與分子生物學密切結合，其核心是通過將所有的分類性狀加權處理，再以性狀間的相似性進行歸類，為葉螨不同種群在分子水平上精確鑒定開辟了新的途徑。目前有些學者運用數值分類法在葉螨的鑒定上有著一定的成果，侯舒心等[5]選取52種恙螨，每種恙螨相互獨立的48個形態(tài)測定數據并將定性指標賦值進行系統(tǒng)分析，鑒定結果與傳統(tǒng)形態(tài)鑒定結果基本一致。

1.3.3應用多媒體專家輔助鑒定系統(tǒng)

近年來信息技術的不斷發(fā)展有效推動了多媒體鑒定技術在葉螨分類鑒定中的應用，其原理主要是將需要鑒定的生物體視頻、圖像以及相關特性描述詳細輸入輔助鑒定系統(tǒng)中，進而對數據進行檢索、分析，最后輸出鑒定結果。目前計算機專家開發(fā)的系統(tǒng)已經在植物檢疫中得到了有效應用，不僅對操作人員、實驗室設備條件要求較低，也為從事葉螨分類鑒定工作者開拓了新的思路，但就目前情況來看，在葉螨鑒定方面應用較少，需要加強對數據的研究。

鑒于傳統(tǒng)形態(tài)分類鑒定葉螨容易產生錯判等問題，在葉螨鑒定中引入分子生物學技術，從而實現葉螨物種的準確鑒定成為物種鑒定的趨勢。

2 分子生物學技術在葉螨鑒定中的應用

2.1 蛋白質標記技術

基于蛋白質多態(tài)性發(fā)展起來的一種分子標記為蛋白質標記，其原理主要是通過分析某種特定的蛋H質是否存在于群體內或者在個體間的分布的差異性，進而分析總結該群體的遺傳情況。目前在葉螨鑒定研究中，蛋白質標記技術應用比較多的為同工酶標記，該技術通過分析同工酶的多態(tài)性獲得種群的遺傳結構和變異情況，相比分子標記技術，同工酶技術具有準確、快速、操作簡便、重復性強、共顯性表達等優(yōu)點，在葉螨鑒定中具有不可替代的地位?？锖Ｔ吹萚6]用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法測定了朱砂葉螨和二斑葉螨群體的幾種同工酶，結果顯示這兩個種的蘋果酸酶同工酶及蘋果酸脫氨酶MDH2、MDH3同工酶的基因型不同，進而區(qū)分朱砂葉螨和二斑葉螨。但同時，同工酶技術也存在一定的缺點：檢測位點數少且位點變異分辨力弱，對樣品基因組遺傳變異的情況不能準確地全面反映;樣本質量要求高，不能用于一些需要大量標記的研究中。

2.2 DNA分子標記技術

隨著PCR的建立，涌現_『一系列分子生物學技術，DNA分子標記是根據生物個體或種群間基因組DNA多態(tài)性而發(fā)展起來的能反映DNA水平上差異的特異性DNA片段，可比性好、穩(wěn)定性高、信息含量高，且不受發(fā)育階段、性別、環(huán)境等因素的影響，對澄清某些近緣種和近似種以及種內分類起到了積極作用，但也存在一定的局限性，需要結合形態(tài)學鑒定手段。下面就對幾種常用的分子標記技術優(yōu)缺點應用進行分析。

限制性片段長度多態(tài)性（RFIP）是一項綜合技術，在葉螨種類鑒定和種間種內系統(tǒng)進化關系研究方面有一定的應用，其操作步驟主要包括設計標準序列的擴增引物，然后進行目的基因的提取，提取后使用PCR技術進行擴增，最后限制性內切酶酶切，酶切產物進行凝膠電泳。Osakabe[7]將RFLP技術應用于葉螨科全爪螨屬內近似種的區(qū)分，能夠很好地用于葉螨系統(tǒng)進化關系的研究。但是該技術在鑒定試驗過程中需要依賴Southern印跡轉移、DNA片段克隆等技術支持，對基因組DNA質量要求高、需要量大等限制。

隨機擴增DNA多態(tài)性（RAPD）是一種以PCR為基礎的DNA分子標記，通過利用隨機引物對目的基因進行PCR擴增，擴增產物經電泳后顯色，分析擴增產物DNA片段的多態(tài)性，從而反映了基因組相應區(qū)域的DNA多態(tài)性。該技術的優(yōu)點在于使用的是隨機引物，免除了引物設計的煩瑣，得到廣泛的應用，但RAPD技術不能準確區(qū)別雜合子和純合子，而且由于使用隨機引物，故在電泳環(huán)節(jié)中可能存在共遷移問題[8-ll]。

擴增片段長度多態(tài)性（ AFIP）與RFLP的主要區(qū)別在于PCR代替Souchen雜交，具有準確、靈敏、快速、穩(wěn)定性高、重復性好以及所需要的DNA量少等優(yōu)點，但從技術操作層面來說，AFLP對技術操作要求較高，對基因組DNA和限制性內切酶的質量要求均較高，且技術費用較為昂貴。

2.3 DNA條形碼技術

DNA條形碼（DNA Barcode）的概念由加拿大動物學家Paul Hebert首次提出。DNA條形碼是生物基因組中普遍存在的、較短的、標準化的DNA序列。因DNA條形碼既具有穩(wěn)定的種內保守性，又包含足夠的種間遺傳變異，可以用于物種的分子鑒定。Hebert等[12-13]在提出DNA條形碼概念之初，即通過線粒體細胞色素氧化酶亞基I基因（ Cvtochrome Oxidase SubunitI，COI）序列對動物界11門13 320個物種進行分析，結果發(fā)現，其中98%的物種可被準確鑒定。I基于COI的葉螨DNA條形碼鑒定方面，Hinomoto等[14]通過分析綠色型和紅色型二斑葉螨COI基因，證實兩者為同一物種，解決了形態(tài)學不能解決或者存在疑問的問題。楊順義等[15]通過COI基因分析，對甘肅不同地區(qū)的截形葉螨種群作遺傳分化分析，明確了甘肅截形葉螨不同種群間的系統(tǒng)發(fā)育及進化關系。除了C01序列外，基于核糖體轉錄間隔區(qū)2（ITS2）序列，Ben等[6]以ITS2基因作為分子標記用于鑒定以色列16個葉螨物種并基于ITS建立系統(tǒng)發(fā)育樹分析各物種進化關系，從而得出 ITS2在葉螨物種鑒定中的有效性。曹利軍等[17]通過核糖體轉錄間隔區(qū)2（ lTS2）序列作為DNA條形碼，對我國12個地區(qū)的草莓葉螨進行分子鑒定和遺傳多樣性分析，表明二斑葉螨為這些地區(qū)草莓上唯一的葉螨種類，種群內遺傳多樣性非常低，研究結果對于制定草莓上葉螨的防治策略具有指導意義。不過，DNA條形碼分子鑒定也存在一些問題，葉螨個體較小，提取單個個體的基因組相對較為困難，對實驗操作有較高的要求，而且操作過程較為煩瑣，對實驗環(huán)境和儀器要求較高[18]。

3 基于形態(tài)學與分子生物學技術相結合的葉螨鑒定流程

根據以上對形態(tài)學和分子技術的應用闡述，單純靠傳統(tǒng)形態(tài)葉螨鑒定方法獲得準確的結果較為困難，針對葉螨形態(tài)學鑒定困難的現象，如能利用多種分子鑒定手段作為形態(tài)鑒定方法的有利補充，能為葉螨屬的分類提供準確的鑒定方法，對葉螨屬內不同種類的針對性防治具有極其重要的意義[19]。本文將形態(tài)學和DNA條形碼分子鑒定技術相結合的鑒定流程進行簡要介紹。

3.1 形態(tài)學特征記錄

（1）采集好供試材料，主要采集到6個不同地理區(qū)域的葉螨，對采集時間、寄主植物樣本信息進行登記。

（2）進行葉螨的形態(tài)學鑒定，制定形態(tài)完好和清晰透明的葉螨標本。

（3）將制作好的玻片靜置合理的時間后放在規(guī)定溫度的恒溫箱中，并在高倍顯微鏡下觀察其用于分類的形態(tài)特征。3.2 DNA條形碼分子鑒定操作

（1）先將單個螨蟲置于1.5ml離心管中，用75%的酒精沖洗消毒，殘留酒精揮發(fā)后用1.5mL離心管適配的研磨棒進行研磨。

（2）用適當的商品化提取試劑盒，按說明書提取基因組DNA。由于單個螨蟲個體小，成螨長約0.5mm，其基因組DNA可用微量組織基因組DNA提取試劑盒進行提取。

（3）用全波長酶標儀檢測所提DNA的濃度和純度，以確定所提取DNA是否滿足下一步的PCR擴增要求。

（4）使用COl和lTS2序列引物，配置PCR反應體系，對所提DNA進行PCR擴增，將擴增產物進行電泳分析擴增是否成功。

（5）將PCR擴增產物雙向測序，所得上、下游引物序列用DNAMAN軟件進行拼接獲得COI或ITS2序列片段。

（6）在NCBI的Blasl中或BOLD的Identification中搜索拼接后獲得的序列片段，在搜索結果中對應

同源性最高的物種則為本次分子鑒定的葉螨種類，若同源性高的結果有幾個種，還可以通過構建系統(tǒng)發(fā)育樹進行進一步的序列分析。3.3 分子鑒定與形態(tài)學分析相互印證

將分子鑒定的葉螨種類形態(tài)學特征與被鑒定葉螨的形態(tài)學特征相瓦印證，若描述一致，則可確定葉螨種類。

近年來，由于科學的進步和多學科實驗研究方法的借鑒，葉螨的準確鑒定取得了長足進展。鑒于形態(tài)學鑒定方法的局限性，本文結合分子技術，結合各自的條件靈活運用，使得鑒定結果更為準確，介紹了形態(tài)學和DNA條形碼分子鑒定技術相結合的、更為準確的鑒定過程。但是分子生物學技術對實驗條件要求較高，操作過程也較為煩瑣，一定程度上阻礙了在葉螨分類鑒定中的推廣與應用，尤其是在一些條件較差的基層單位，所以如何優(yōu)化鑒定技術，在保證準確性的前提下，降低實驗條件要求，是下一階段需要研究的課題。

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