烘烤期煙葉霉?fàn)€病病原菌的分離、鑒定及生物學(xué)特性

潘祖賢 蔡永占 何鵬飛 于 仰 謝金思 吳毅歆 蔣佳容 何月秋

摘??要：為明確云南省烘烤期煙葉霉?fàn)€病的病原，采用分子和形態(tài)學(xué)鑒定方法，依據(jù)柯赫氏法則，對病原菌進(jìn)行分離和鑒定并將其命名為Rhi-1，并初步研究了該病原菌的生物學(xué)特性。結(jié)果表明，引起該病害的病原菌為米根霉（）。菌株Rhi-1的氣生菌絲旺盛，質(zhì)地疏松，孢子囊和孢囊孢子直徑分別為53～123 μm和2.1～9.0 μm，兩者均呈球形或橢圓形。孢囊孢子萌發(fā)的最高溫度為44.6 ℃，水相介質(zhì)中孢囊孢子熱處理10 min的致死溫度為54 ℃，菌絲體熱處理30 min的致死溫度為70 ℃，最適pH為7.0，最佳培養(yǎng)基為PSA。此結(jié)果為研究霉?fàn)€病發(fā)生機(jī)制提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：煙葉霉?fàn)€;米根霉;孢子囊;孢囊孢子

中圖分類號：S435.72 ?????????文章編號：1007-5119（2019）04-0042-06 ?????DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.04.007

Isolation， Identification and Characterization of the Pathogen of Tobacco Leaf Mold during Flue-curing

PAN Zuxian， CAI Yongzhan， HE Pengfei， YU Yang， XIE Jinsi，

WU Yixin， JIANG Jiarong， HE Yueqiu

（1. Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China; 2. Xuanwei Tobacco Company of Qujing Prefecture， Xuanwei， Yunnan 655400， China; 3. National and Local Joint Engineering Research Center for Screening and Application of Microbial Strains， Kunming 650217， China）

?In recent years， tobacco leaf mold has become a serious disease in tobacco producing areas of Yunnan Province. To clarify the pathogen of the disease， the pathogen was isolated， identified and its biological characteristics were also analyzed?based on the Koch’s postulations， morphology observation and molecular technology.?The results showed that the aerial hyphae of the strain Rhi-1 is vigorous and loose， with its sporangium diameter being?53-123 μm and its sporangiospore diameter being?2.1-9.0 μm， both being?spherical or oval. Combining with the 16s rDNA-ITS sequence analysis， the strain Rhi-1 was identified as . The highest temperature of spore germination is 44.6 ℃，?lethal temperature of the spores is 54 ℃ in hot water bath for 10 min and lethal temperature of the mycelium is 70 ℃?in hot water bath for 30 min. The optimal pH value is 7.0?and the optimal medium is PSA. These results could provide a good basis for pathogenicity studies?of the pathogen.

： tobacco leaf mold; ; sporangium; sporangiospore

煙葉在烘烤過程中，均有可能發(fā)生霉?fàn)€，尤其是在初烤時，煙葉霉?fàn)€病發(fā)生嚴(yán)重。在烤煙房內(nèi)發(fā)病時，葉柄處首先出現(xiàn)水漬狀斑，變褐腐爛，病部縊縮軟化，隨后再由基部沿葉脈向葉片尖端延伸，表面著生大量白色菌絲并向葉基部擴(kuò)展蔓延，后期菌絲體變?yōu)榛液谏罱K導(dǎo)致葉片大面積發(fā)霉腐爛。然而，目前對煙葉霉?fàn)€病的研究多數(shù)集中在儲藏階段，對烘烤期的煙葉霉?fàn)€病報道較少。當(dāng)前國內(nèi)已報道引起倉儲期煙葉霉?fàn)€的優(yōu)勢病原菌為青霉屬（）和曲霉屬（）真菌。早先有報道認(rèn)為紅花大金元煙葉在烘烤過程中出現(xiàn)的葉柄霉?fàn)€是由于感染霉菌而引起的。最近不同煙草產(chǎn)區(qū)先后發(fā)現(xiàn)烘烤期煙葉霉?fàn)€的主要病原菌是米根霉（）。依據(jù)霉變的發(fā)生癥狀，將其劃分為葉基霉?fàn)€型和葉片霉?fàn)€型。云南省個別地區(qū)在烘烤中部煙葉時，霉?fàn)€病發(fā)病率達(dá)30%以上，損失達(dá)20%左右，以葉基霉?fàn)€型為主。然而，該病的病原還不清楚。為了明確其主要病原分類地位、生物特性和制訂防治策略，本研究對來自云南省宣威市的烤煙霉?fàn)€病標(biāo)本進(jìn)行了病原物分離、鑒定和生物學(xué)特性研究。

1 ?材料與方法

1.1 ?病原菌的分離

霉變煙葉樣品于2018年8月采自云南省宣威市格宜鎮(zhèn)石磨村煙草烤房，烤煙品種為云煙105（?cv. Yunyan 105）。從煙葉葉柄處挑取少量菌絲體，轉(zhuǎn)入PDA平板，32 ℃黑暗培養(yǎng)3 d，轉(zhuǎn)接繼代培養(yǎng)3次，所得純凈菌株命名為Rhi-1。用濾紙片法保存純化后的菌株Rhi-1，?80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 ?病原菌的鑒定

1.2.1 ?形態(tài)觀察??在PDA平板上活化菌株，挑取少量菌絲于光學(xué)顯微鏡下鏡檢。根據(jù)文獻(xiàn)[6-7]的方法觀察病原菌形態(tài)特征并對病原菌進(jìn)行鑒定，初步明確此菌株的分類地位。

1.2.2 ?分子鑒定??采用CTAB法提取基因組DNA。通過ITS擴(kuò)增及測序鑒定此菌株。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由碩擎生物技術(shù)有限公司測序。應(yīng)用NCBI-Blast和MEGA X等軟件對所得到的序列進(jìn)行分析，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中提交該菌株的ITS序列。

1.2.3 ?致病性測定??將菌株孢子懸浮液（1×10?cfu/mL）噴施在新鮮健康的煙葉柄表面。于32 ℃恒溫箱內(nèi)保濕黑暗培養(yǎng)。5 d后，觀察葉柄的發(fā)病情況。分離發(fā)病煙葉柄處的微生物，并完成形態(tài)及分子鑒定。

1.3 ?生物學(xué)特征研究

1.3.1 ?溫度對Rhi-1孢囊孢子萌發(fā)、孢囊孢子萌發(fā)活性及菌絲體生長的影響??將孢子液接種于PDA上，在36.8、37.9、39.1、40.1、41.1、42.1、43.3、44.6、46.0、47.4、48.5、49.5及50.2 ℃下培養(yǎng)。48 h后，觀察記錄菌株的生長情況。每個處理4個重復(fù)。同時將孢子懸浮液（10?cfu/mL）在不同溫度（46、48、50、52、54、56、58、60及62 ℃）下處理10 min，并涂布于?PDA平板，32 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。10 h后，統(tǒng)計萌發(fā)的孢子數(shù)。每個處理5個重復(fù)。將菌絲體在50、55、60、65、70、75和80 ℃條件下處理30 min后轉(zhuǎn)入PDA平板，32 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。3 d后，觀察有無新生菌絲長出，計算存活率[存活率=（存活樣本數(shù)/總樣本數(shù)）×100%]和致死率{致死率=[（對照組存活率-處理組存活率）/對照組存活率]×100%}。每個處理20個重復(fù)。上述試驗均重復(fù)3次。

1.3.2 ?pH對Rhi-1生長的影響??在pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的PDA平板中央處接種直徑5 mm的菌餅，32 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)。24 h后，采用十字交叉法測量菌落直徑。根據(jù)菌落直徑的大小判斷pH對Rhi-1菌株生長的影響。每個pH處理15個重復(fù)，1皿/重復(fù)。

1.3.3 ?培養(yǎng)基種類對Rhi-1生長的影響??用水瓊脂培養(yǎng)基（WA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）、燕麥瓊脂培養(yǎng)基（OMA）、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA）、玉米粉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（CMD）及煙莖培養(yǎng)基（煙莖200?g，煮汁20 min，去煙莖、瓊脂粉24 g、水1000 mL）培養(yǎng)菌株。其他具體操作同1.3.2。

2 ?結(jié)??果

2.1 ?煙草霉?fàn)€病病原菌的分離與鑒定

真菌菌株Rhi-1在PDA培養(yǎng)基上生長良好，氣生菌絲旺盛，菌落初為白色，后期呈灰黑色，菌絲質(zhì)地疏松，呈放射狀生長，菌絲生長速度較快，2～3 d后即可長滿整個平板（圖1a）。菌絲無隔，分化出假根和匍匐菌絲（圖1d）。孢囊梗單生或叢生，與假根對生，頂端著生孢子囊。孢子囊呈球形或近球形，初期無色或淡褐色，后期老熟變?yōu)楹诤稚?，囊軸明顯，基部有囊托，孢子囊較大，直徑53～123 μm。孢子囊成熟后散出大量孢囊孢子，孢囊孢子呈球形、卵形或不規(guī)則形，無色或淡褐色，呈透明狀，光滑、無隔膜，直徑大小為2.1～9.0 μm（圖1b和c）。初步的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果顯示Rhi-1與根霉屬（）真菌形態(tài)類似。

注：a.菌落形態(tài);b.孢子囊（近景）;c.孢囊孢子;d.假根和孢子囊。

Note： a. colony on PDA plate; b. sporangia （nearby view）; c. sporangiospores;d. rhizoids and sporangia.

圖1 ?Rhi-1菌株的形態(tài)特征

Fig. 1 ?Morphological characteristics of Strain Rhi-1

以菌株Rhi-1基因組DNA為模板，使用真菌ITS鑒定的通用引物ITS-1/ITS-4可擴(kuò)增出長度為0.6 kb左右的DNA片段。BLAST同源比對的結(jié)果顯示菌株Rhi-1與GenBank數(shù)據(jù)庫中的一些米根霉（）菌株親緣關(guān)系最近，ITS序列的一致性達(dá)100%?；贗TS序列（GenBank中的登錄號為MH997437.1）的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2，Rhi-1菌株與米根霉MB15、SPL16040等菌株的親緣關(guān)系較近。綜合形態(tài)學(xué)特征及ITS序列分析結(jié)果，可確定菌株Rhi-1為米根霉（）。

注：黑色三角形為Rhi-1菌株。

Note： the black triangle is the Rhi-1 strain.

圖2 ?基于ITS序列采用鄰接法構(gòu)建的Rhi-1菌株

及其相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig. 2 ?Phylogenetic tree of Rhi-1 and related strains based on ITS sequences by the neighbor-joining method

2.2 ?Rhi-1菌株的致病性測定

將病原菌接種到煙葉3 d后，開始發(fā)病。病部中央?yún)^(qū)域首先有水漬狀，變軟，后期逐漸向周圍擴(kuò)大，呈腐爛狀，嚴(yán)重時導(dǎo)致整個煙柄軟化腐爛。葉柄失綠漸變?yōu)榘迭S色，最后呈深褐色。同時，煙葉葉柄上開始出現(xiàn)白色毛發(fā)狀菌絲體，隨后菌絲體受潮易貼伏在煙柄表面使病組織散發(fā)出霉?fàn)€味（圖3 B）。其癥狀與烤房內(nèi)所發(fā)現(xiàn)的煙葉霉?fàn)€癥狀（圖3 A）相似。從上述煙柄組織中分離真菌，并對該真菌進(jìn)行形態(tài)特征觀察以及分子鑒定，發(fā)現(xiàn)分離出的真菌與Rhi-1菌株完全相同。故確定菌株Rhi-1為引起烘烤期煙葉霉?fàn)€的病原菌。

注：A.烤房內(nèi)的發(fā)病癥狀;B.人工接種的發(fā)病癥狀。

Note： A. Symptoms of infected tobacco in curing barn， B. Symptoms of tobacco inoculated with the Rhi-1.

圖3 ?煙葉霉?fàn)€病癥狀

Fig. 3 ?Typical symptoms of tobacco leaf mold

2.3 ?溫度對Rhi-1菌株生長的影響

2.3.1 ?孢囊孢子萌發(fā)溫度??不同溫度處理Rhi-1菌株孢囊孢子的結(jié)果表明，病菌孢子在36.8～43.3 ℃范圍內(nèi)均可萌發(fā)生長，但溫度過高不利于孢子生存。溫度為36.8 ℃和37.9 ℃的處理組內(nèi)孢子萌發(fā)活性最高，長出的菌絲也最為旺盛并有黑色孢子囊出現(xiàn)（圖片未顯示），生長級數(shù)為9.0;39.1 ℃和40.1 ℃菌落生長級數(shù)減小至8.0和6.5，表現(xiàn)出一定程度地受抑制。隨著溫度的升高，高溫對孢子萌發(fā)的抑制效果更為顯著，42.1 ℃和43.3 ℃時孢子雖可萌發(fā)，但生長級數(shù)分別銳減至3.0和0.5，而在溫度大于或

等于44.6 ℃的處理組，孢子無萌發(fā)，生長級數(shù)為0，顯著地低于其他溫度處理（<0.05）。此結(jié)果表明Rhi-1菌株孢子萌發(fā)的最高溫度為44.6 ℃（圖4）。

注：生長情況分級標(biāo)準(zhǔn)如下：0級，無菌絲;1級，極少量菌絲;3級，少量菌絲，僅能覆蓋住培養(yǎng)基表面;5級，有一定量的菌絲體，氣生菌絲層厚度中等;7級，菌絲和氣生菌絲層厚度較多，但無黑色孢子囊出現(xiàn);9級，菌絲和氣生菌絲層均較多，有黑色孢子囊出現(xiàn)。不同字母表示5%顯著差異水平。

Note： Grading of growth were based on follows： 0， no mycelium; 1， a little mycelium; 3， a small amount of mycelium， only covering the surface of medium; 5， a certain amount of mycelium; 7， more hyphae， but no sporangium appears; 9， black sporangium appears. Different lowercase letters indicate significant difference at <0.05 levels by Duncan’s test.

圖4 ?溫度對孢囊孢子萌發(fā)的影響

Fig. 4 ?Effects?of different temperatures on sporangiospores germination of

2.3.2 ?水相介質(zhì)中的孢囊孢子萌發(fā)溫度??不同溫度處理水相介質(zhì)中的Rhi-1孢子，溫度為46、48、50、52、54、56、58、60和62 ℃時，孢子致死率分別為14% a、23% b、30% c、57% d、100% e、100% e、100% e、100% e和100% e（數(shù)字后的字母不同表示在<0.05水平下差異顯著性，下同）。當(dāng)熱處理溫度為46～52 ℃時，致死率隨溫度的升高呈現(xiàn)出升高的趨勢，當(dāng)溫度上升至54 ℃時，只有極少數(shù)的孢子存活、萌發(fā)并在PDA平板上形成菌落，數(shù)量顯著低于46、48、50和52 ℃的溫度處理（<0.05）。以上結(jié)果表明54 ℃熱處理孢子液10 min即可導(dǎo)致其中的孢子完全失活。

2.3.3 ?菌絲體生長致死溫度??以50、55、60、65、70、75和80 ℃的溫度直接處理Rhi-1，其菌絲體死亡率分別為9% c、9% c、10% c、91% b、100% a、100% a和100% a。溫度范圍為50～60 ℃的處理（50 ℃、55 ℃及60 ℃）對Rhi-1菌絲的致死效應(yīng)無明顯差異且均未超過10%。將70 ℃及以上高溫處理30 min的菌絲體轉(zhuǎn)接到PDA平板上后，發(fā)現(xiàn)均無菌落擴(kuò)展（圖片未顯示），顯示菌絲體已全部死亡，致死率達(dá)100%。即，70 ℃直接熱處理Rhi-1的菌絲體30 min可使之完全致死。

2.4 ?pH對Rhi-1菌株生長的影響

米根霉Rhi-1在pH為5～9范圍內(nèi)的PDA平板上均可生長。pH為5、6、7、8和9時，菌落直徑分別為3.66 c、4.12 b、5.44 a、5.42 a、和3.14 d cm。其中在pH 7.0的PDA平板上培養(yǎng)1 d，菌落直徑可達(dá)5.44 cm，顯著地高于其他pH處理（<0.05），表明該菌株的最適宜生長pH為7.0。在pH為5.0和9.0的PDA平板上培養(yǎng)，直徑均較短，表明過酸或過堿均不利于Rhi-1在PDA平板上的生長。

2.5 ?不同培養(yǎng)基對Rhi-1菌株生長的影響

使用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)米根霉Rhi-1菌株，48 h后測定菌落直徑。結(jié)果表明，病原真菌在供試的7種不同培養(yǎng)基中均能生長，其中在PSA培養(yǎng)基中生長最好，菌落平均直徑可達(dá)8.50 cm，PDA次之，WA培養(yǎng)基中長勢最差，菌落直徑僅有1.83 cm（表1）。

3 ?討??論

煙葉霉?fàn)€多發(fā)生于高溫高濕，通風(fēng)不暢的烤房，嚴(yán)重影響煙草品質(zhì)和煙農(nóng)經(jīng)濟(jì)收益。通過形態(tài)觀察、ITS測序以及柯赫氏法則驗證，采自云南省宣威市霉?fàn)€病葉的病原為米根霉（），與前人報道相一致。米根霉不僅引起烘烤期煙葉霉變，

還可引起倉儲煙葉霉變及煙支霉變。米根霉作為一種弱寄生的致病菌，可引起多種作物的真菌性軟腐病，如花生、紅薯、向日葵、馬鈴薯等。但也有研究認(rèn)為此類真菌能夠發(fā)酵煙末并增加煙葉致香成分，在卷煙生產(chǎn)的其他流程中，它與曲霉等真菌在一定范圍內(nèi)可起到提高煙絲品質(zhì)的作用。且不同時期，煙葉真菌優(yōu)勢種不同，格孢菌目為新鮮健康煙葉的內(nèi)生優(yōu)勢菌群，曬黃煙調(diào)制過程中的優(yōu)勢菌群為附球菌屬、節(jié)菱孢屬和鐮孢菌屬，根霉屬為復(fù)烤煙葉醇化過程中的優(yōu)勢類群，引起煙支霉變的微生物主要為球孢枝孢、黃曲霉、桔青霉和米曲霉。本研究顯示米根霉為烘烤過程中的優(yōu)勢菌種，歸于根霉屬，與前人結(jié)果一致。

前人探究溫度對菌株生長的影響時，采用的方法多為平板培養(yǎng)，將平板放置于不同溫度的培養(yǎng)箱中處理，耗時耗材。本研究采用定量PCR儀的方法，相比前者，有用樣量小、溫度精準(zhǔn)可控和試驗周期短等優(yōu)點，所得到的實驗數(shù)據(jù)應(yīng)當(dāng)更加可信。結(jié)果表明，米根霉Rhi-1孢子萌發(fā)最適溫度為36.8～37.9 ℃，高于44.6 ℃就不能萌發(fā)生長;在水相介質(zhì)中，即使52 ℃下，仍有部分孢子萌發(fā)，菌絲在50 ℃時，便有部分死亡，在60 ℃時，死亡率達(dá)10%，溫度達(dá)70 ℃以上時，便全部死亡。在36.8～40.1 ℃中，菌絲仍能保持良好生長，顯示出對高溫環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性，具有一定的嗜高溫特性，這與烤房烘烤期的溫度條件（36～42 ℃階段式升溫52 h）高度重合，且煙葉烘烤失水速率先增快后減慢，為米根霉的快速生長提供了適宜條件，暗示這一時期極有可能就是煙葉霉?fàn)€發(fā)生的主要時期。致病性測定結(jié)果顯示，孢子噴霧接種煙柄，32 ℃健康煙柄顯癥僅需48 h，低于階段式升溫用時（52 h）。若綜合溫度因素，烤房內(nèi)米根霉完成煙柄侵染的實際用時可能還要更短，加之空氣流通，可能還會有多次再侵染。

值得注意的是，烤房里煙葉經(jīng)歷54、60以及68 ℃連續(xù)高溫烘烤后，仍能從煙葉霉?fàn)€部位分離到存活的菌絲體。然而，菌絲體致死溫度結(jié)果顯示，65 ℃處理菌絲體30 min就能使絕大多數(shù)菌絲體失活。兩者相差的原因可能與烤房內(nèi)隨著溫度升高，相對濕度逐漸降低，菌絲漸干，耐受溫度的能力逐漸提高有關(guān)。

許多報道認(rèn)為，作物產(chǎn)后病害實際在田間就已經(jīng)開始發(fā)生，且在大田時期的健康煙柄以及烤房內(nèi)外等環(huán)境都分離到米根霉。實際中，我們也從健康的煙草葉柄以及烘烤前后的烤房內(nèi)均收集到米根霉（數(shù)據(jù)未顯示）。這些結(jié)果表明大田煙葉以及烤房周邊的空氣等是煙葉霉?fàn)€病的重要初侵染源，這為此病害后續(xù)的有效防控提供了重要的理論支持。

4 ?結(jié)??論

米根霉（）是引起云南省宣威市烘烤期煙葉霉?fàn)€病的病原菌。病原菌對高溫具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，孢囊孢子萌發(fā)并生長的最高溫度為44.6 ℃;菌絲體致死溫度為70 ℃，30 min;水相介質(zhì)中的孢囊孢子失活溫度為54 ℃，10 min;烘烤期（36～42 ℃）是此病害的主要發(fā)生期。

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