致病疫霉游動(dòng)孢子制備方法研究

楊祝強(qiáng)，王洪洋，唐 唯，李燦輝，劉 晶

(1.云南師范大學(xué) 云南省馬鈴薯生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2.云南師范大學(xué) 云南省高校馬鈴薯生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

馬鈴薯作為全球第三大糧食作物，在人類糧食安全中發(fā)揮著重要作用[1-2]。然而，由致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起的馬鈴薯晚疫病，在世界范圍內(nèi)導(dǎo)致馬鈴薯產(chǎn)量降低，甚至引起馬鈴薯絕收，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-7]。1845年，馬鈴薯晚疫病在愛爾蘭大暴發(fā)并造成饑荒，致使數(shù)百萬人死亡[8]。當(dāng)前，晚疫病仍是現(xiàn)代馬鈴薯生產(chǎn)上的巨大問題[9]。致病疫霉屬于藻界(Chromista)卵菌門(Oomycota)鞭毛菌亞門(Mastigomycotina)卵菌綱(Ommycetes)霜霉目(Peronosporales)腐霉科(Pyhiaceae)疫霉屬(Phytophthora)[10]。致病疫霉的生活史分為無性世代和有性世代，在無性世代中，孢子囊是致病疫霉無性階段最主要的繁殖器官和侵染器官。與菌絲體相比，孢子囊抵抗不利環(huán)境的能力更強(qiáng)且更易于傳播。當(dāng)外界環(huán)境濕度較高、溫度在24～25 ℃時(shí)，孢子囊直接萌發(fā)產(chǎn)生芽管[11]；當(dāng)外界環(huán)境濕度較高、溫度較低(最適溫度10～15 ℃)時(shí)，孢子囊釋放出游動(dòng)孢子[3]。致病疫霉的游動(dòng)孢子呈腎形，具2根鞭毛，能在水中游動(dòng)；游動(dòng)孢子侵染寄主植物前，其鞭毛脫落，形成球形的休止孢，之后休止孢萌發(fā)產(chǎn)生芽管侵入寄主體內(nèi)[12]。游動(dòng)孢子的主要作用是幫助病原菌擴(kuò)散到合適的侵染部位進(jìn)行侵染，并且游動(dòng)孢子也是非常有效的繁殖體[13-14]。無論是孢子囊直接萌發(fā)還是孢子囊釋放游動(dòng)孢子均能夠引起田間多次再侵染并造成病害大流行[15]。馬鈴薯種質(zhì)資源抗晚疫病評(píng)價(jià)、抗晚疫病基因挖掘及克隆、致病疫霉致病機(jī)制等相關(guān)研究中都需要大量的游動(dòng)孢子作為接種菌源及研究材料。因此，探索游動(dòng)孢子的最佳釋放條件至關(guān)重要。在辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)及大豆疫霉(Phytophthoranicotianae)等疫霉屬致病卵菌中，游動(dòng)孢子制備的最佳條件不盡相同，但游動(dòng)孢子的產(chǎn)生均離不開水[16-21]。目前，尚未有致病疫霉游動(dòng)孢子最佳制備條件的相關(guān)報(bào)道，鑒于此，探索致病疫霉孢子囊和游動(dòng)孢子制備的最佳條件，為今后致病疫霉致病機(jī)制及馬鈴薯抗晚疫病研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株為致病疫霉88069菌株, 由云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院保存并提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 供試培養(yǎng)基為黑麥-V8培養(yǎng)基，配制方法如下：向60 g浸泡過夜的黑麥中加入1 000 mL蒸餾水，121 ℃高壓蒸汽滅菌40 min，經(jīng)2層紗布過濾得到黑麥汁，向黑麥汁中加入V8蔬菜汁100 mL、瓊脂20 g、碳酸鈣1 g，調(diào)pH值至7.0，加ddH2O補(bǔ)足至1 000 mL，121 ℃高溫高壓滅菌20 min備用。

1.1.3 供試溶液 供試溶液為Petri’s溶液。50×Petri’s母液配制方法如下：CaCl21.39 g，MgSO46.02 g，KH2PO46.80 g，KCl 2.98 g，加ddH2O定容至1 000 mL，使用前稀釋成1×Petri’s溶液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 用接種針挑取保存的致病疫霉88069接種于黑麥-V8培養(yǎng)基上，18 ℃黑暗培養(yǎng)。

1.2.2 孢子囊的制備 將18 ℃黑暗培養(yǎng)9 d的88069菌株用直徑為0.8 cm的打孔器在培養(yǎng)平板上隨機(jī)均勻地打取菌絲塊，并接種于新的含黑麥-V8培養(yǎng)基的平板上，每個(gè)平板均勻接種3塊菌絲，18 ℃黑暗條件下分別培養(yǎng)7～12 d。向以上培養(yǎng)7～12 d的88069菌株中分別加入3 mL Petri’s溶液，用滅菌玻璃涂布棒將培養(yǎng)基上的孢子囊刮下，經(jīng)Microcloth過濾后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管中，統(tǒng)計(jì)1 mL孢子囊懸浮液中的孢子囊個(gè)數(shù)，并將其稀釋成104個(gè)/mL備用。

1.2.3 游動(dòng)孢子的制備 分別采用5種不同低溫誘導(dǎo)組合方法制備游動(dòng)孢子。方法M1：將孢子囊懸浮液于10 ℃下靜置30 min，再在18 ℃下靜置30 min；方法M2：將孢子囊懸浮液于4 ℃下靜置30 min，再在10 ℃下靜置90 min；方法M3：將孢子囊懸浮液于4 ℃下靜置30 min，再在10 ℃下靜置60 min；方法M4：將孢子囊懸浮液于4 ℃下靜置3 h；方法M5：將孢子囊懸浮液于4 ℃下靜置2 h，再在18 ℃下靜置1 h。

1.2.4 孢子囊及游動(dòng)孢子的計(jì)數(shù) 用移液槍吸取5 μL孢子囊或游動(dòng)孢子懸浮液，將懸浮液在載玻片上輕拉成一條細(xì)線，計(jì)算樣本中的孢子囊或游動(dòng)孢子總數(shù)，每個(gè)樣本取樣5次，計(jì)算1 mL懸浮液中的孢子囊或游動(dòng)孢子個(gè)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism和SPSS 18.0軟件進(jìn)行作圖和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病疫霉孢子囊和游動(dòng)孢子的形態(tài)特征

致病疫霉孢子囊呈長(zhǎng)檸檬形，頂端有乳突，另一端有小柄，小柄易從菌絲上脫落(圖1)。當(dāng)環(huán)境濕度較高且溫度較低的條件下，孢子囊可從乳突釋放出游動(dòng)孢子(圖2)。游動(dòng)孢子呈腎形，從孢子囊中釋放后便無規(guī)則游動(dòng)，40×10倍鏡下可隱約看到2根鞭毛(圖2A、B)。游動(dòng)孢子釋放完畢后形成空孢子囊殼(圖2C) 。

A、B、C分別為10×10、20×10、40×10倍鏡下的孢子囊形態(tài)，黑色箭頭所指為孢子囊A,B,C are the sporangia morphology under 10×10,20×10 and 40×10 magnifications respectively,the black arrow points to the sporangium圖1 致病疫霉孢子囊的形態(tài)Fig.1 The morphology of P.infestans sporangium

A.孢子囊正在釋放游動(dòng)孢子(40×10)； B.游動(dòng)孢子(40×10); C.游動(dòng)孢子及空孢子囊(20×10),黑色箭頭所指為游動(dòng)孢子，白色箭頭所指為空孢子囊A.Sporangium is releasing zoospores (40×10); B.Zoospore (40×10); C.Zoospores and empty sporangium(20×10),the black arrow indicates zoospores while the white arrow indicates empty sporangium圖2 致病疫霉游動(dòng)孢子的形態(tài)Fig.2 Morphology of zoospores of P.infestans

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)致病疫霉孢子囊產(chǎn)量的影響

為測(cè)定不同培養(yǎng)天數(shù)對(duì)致病疫霉孢子囊產(chǎn)量的影響，將致病疫霉接種于黑麥-V8培養(yǎng)基上，在18 ℃黑暗條件下分別培養(yǎng)7～12 d并收集孢子囊。結(jié)果顯示，孢子囊產(chǎn)量先迅速增加，隨后增速放緩，直至基本不再增加(圖3)。培養(yǎng)7 d的致病疫霉孢子囊產(chǎn)量最低，為4.87×104個(gè)/mL，之后孢子囊產(chǎn)量迅速增加。第8、9天孢子囊產(chǎn)量分別比前1 d增加71.3%、79.2%。從第10 天開始，孢子囊產(chǎn)量增速稍有降低，相比第9天孢子囊產(chǎn)量增加了66.07%。第11天的孢子囊產(chǎn)量增速大幅下降，僅比第10天孢子囊產(chǎn)量增加了23.7%，孢子囊產(chǎn)量為3.07×105個(gè)/mL。隨后孢子囊產(chǎn)量進(jìn)入平臺(tái)期，第12天的孢子囊產(chǎn)量與前1 d相比無顯著差異，為3.15×105個(gè)/mL (圖3)。

2.3 不同培養(yǎng)時(shí)間及制備方法對(duì)致病疫霉游動(dòng)孢子產(chǎn)量的影響

為測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間及制備方法對(duì)致病疫霉游動(dòng)孢子產(chǎn)量的影響，分別在黑麥-V8培養(yǎng)基上培養(yǎng)致病疫霉7～12 d收獲孢子囊，并用5種方法分別制備游動(dòng)孢子。結(jié)果表明，用培養(yǎng)7～9 d的致病疫霉收獲的孢子囊制備游動(dòng)孢子時(shí)，無論選擇哪種制備方法，游動(dòng)孢子產(chǎn)量起初均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，并在第9天達(dá)到峰值；之后，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)到10～12 d時(shí)，游動(dòng)孢子產(chǎn)量均顯著下降，尤其是方法M1，用培養(yǎng)12 d收獲的孢子囊制備游動(dòng)孢子時(shí)，游動(dòng)孢子產(chǎn)量較培養(yǎng)9 d的減少77.71%(圖4)。使用培養(yǎng)9 d得到的孢子囊制備游動(dòng)孢子時(shí)，游動(dòng)孢子產(chǎn)量最高，且5種不同方法得到的游動(dòng)孢子產(chǎn)量差異不顯著。除使用培養(yǎng)9 d收獲的孢子囊制備的游動(dòng)孢子產(chǎn)量最高外，其他培養(yǎng)時(shí)間下得到的游動(dòng)孢子量根據(jù)制備方法的不同稍有差異。結(jié)合圖3及圖4的結(jié)果可知，孢子囊產(chǎn)量大時(shí)其游動(dòng)孢子產(chǎn)量并不一定大，二者之間不完全呈正相關(guān)。因此，要快速得到大量的游動(dòng)孢子，可以收集培養(yǎng)9 d的致病疫霉孢子囊，將其在10 ℃下靜置30 min，再在18 ℃下靜置30 min(M1)，收集游動(dòng)孢子。如果不考慮制備時(shí)間，可以用培養(yǎng)9 d的致病疫霉孢子囊在4 ℃靜置2 h后再在18 ℃靜置1 h，即可獲得最大量的游動(dòng)孢子。

不同小寫字母表示差異顯著(Tukey’s HSD,P<0.05)Different lowercase letters mean significantdifference among groups(Tukey’s HSD,P<0.05)圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間致病疫霉的孢子囊產(chǎn)量Fig.3 The sporangia yield of P.infestans under different culture time

不同小寫字母表示同一時(shí)間不同方法差異顯著Different lowercase letters mean significant difference among different methods at the same time圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間、不同制備方法對(duì)致病疫霉游動(dòng)孢子產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of different culture time and different preparation methods on zoospore yield of P.infestans

3 結(jié)論與討論

由致病疫霉引起的馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)上的主要病害之一，該病害嚴(yán)重威脅馬鈴薯的生產(chǎn)和全球糧食安全[2-3]。致病疫霉釋放的游動(dòng)孢子是侵染馬鈴薯并引起晚疫病的主要田間因素之一。因此，優(yōu)化致病疫霉游動(dòng)孢子的制備條件對(duì)篩選馬鈴薯抗晚疫病品種、挖掘其抗晚疫病基因以及解析致病疫霉的致病機(jī)制等具有重要意義。本研究探討了不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)致病疫霉孢子囊產(chǎn)量的影響，以及不同培養(yǎng)時(shí)間、不同制備方法對(duì)致病疫霉游動(dòng)孢子產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，用培養(yǎng)9 d 的致病疫霉收獲的孢子囊能夠制備得到大量游動(dòng)孢子，且不同制備方法得到的游動(dòng)孢子產(chǎn)量差異不顯著。如要快速大量制備游動(dòng)孢子，可收集培養(yǎng)9 d的致病疫霉孢子囊，將其在10 ℃下靜置30 min，再在18 ℃下靜置30 min。如要得到最大量的游動(dòng)孢子且不考慮制備時(shí)間，可收集培養(yǎng)9 d的致病疫霉孢子囊，將其在4 ℃靜置2 h后再在18 ℃靜置1 h。

在疫霉屬其他植物致病菌中也有關(guān)于游動(dòng)孢子最佳制備條件的報(bào)道，其中有關(guān)辣椒疫霉孢子囊及游動(dòng)孢子的制備條件等研究報(bào)道相對(duì)較多，研究結(jié)果也不盡相同。張榮等[16]研究發(fā)現(xiàn)，辣椒疫霉游動(dòng)孢子的最佳誘導(dǎo)條件是，該菌在玉米粉瓊脂培養(yǎng)基上26 ℃暗培養(yǎng)3 d并持續(xù)光照培養(yǎng)6 d，再加無菌水并置于16 ℃光照0.5 h。李立鳳等[17]研究表明，將長(zhǎng)滿菌絲的辣椒疫霉培養(yǎng)皿加入30 mL滅菌水后于30 ℃全光照處理6 d時(shí)，游動(dòng)孢子產(chǎn)量最大。許亞池等[18]對(duì)辣椒疫霉游動(dòng)孢子的最佳產(chǎn)生方法進(jìn)行探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，辣椒疫霉在5% V8培養(yǎng)基上28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d，向培養(yǎng)皿內(nèi)加入無菌水后再在28 ℃下全光照培養(yǎng)5 d，可誘導(dǎo)該菌產(chǎn)生大量的游動(dòng)孢子。此外，在煙草疫霉及大豆疫霉(Phytophthorasojae)中也有游動(dòng)孢子制備方法的相關(guān)報(bào)道。楊建卿等[19]經(jīng)過試驗(yàn)研究得出，在滴加了土壤浸出液的皮氏培養(yǎng)液中，煙草疫霉菌絲可在3 d內(nèi)產(chǎn)生大量的游動(dòng)孢子囊，游動(dòng)孢子囊經(jīng)低溫處理后再培養(yǎng)24 h可產(chǎn)生大量游動(dòng)孢子。AHONSI等[20]研究發(fā)現(xiàn)，溫度顯著影響煙草疫霉游動(dòng)孢子的產(chǎn)生；22 ℃下游動(dòng)孢子產(chǎn)量最高，36 ℃下游動(dòng)孢子的形成被完全抑制。趙艷龍等[21]比較了不同培養(yǎng)方法對(duì)煙草疫霉游動(dòng)孢子產(chǎn)生的影響，結(jié)果表明，菌絲塊-水培法產(chǎn)生游動(dòng)孢子的速度最快、數(shù)量最多，且方法簡(jiǎn)單，是最佳的培養(yǎng)方法。左豫虎等[22]研究發(fā)現(xiàn)，間歇性地給大豆疫霉菌絲塊換水可以誘導(dǎo)菌絲產(chǎn)生孢子囊，進(jìn)而釋放游動(dòng)孢子。蘭成忠等[23]對(duì)誘發(fā)大豆疫霉產(chǎn)生游動(dòng)孢子囊的10種方法進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，土壤浸出液法和皮氏液加土壤浸出液法能夠得到大量的游動(dòng)孢子。綜合前人研究結(jié)果可以看出，疫霉屬卵菌的游動(dòng)孢子釋放條件各不相同，但游動(dòng)孢子的產(chǎn)生都離不開水。

本研究以致病疫霉為材料，探討了不同培養(yǎng)時(shí)間及不同低溫誘導(dǎo)組合的方法對(duì)其游動(dòng)孢子釋放的影響。致病疫霉孢子囊的產(chǎn)量起初隨著菌株培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而快速增加，隨后孢子囊產(chǎn)量增速放緩，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，孢子囊產(chǎn)量基本不再增加，培養(yǎng)12 d得到的孢子囊產(chǎn)量與前1 d相比差異不顯著。收集不同培養(yǎng)時(shí)間收獲的孢子囊并制備游動(dòng)孢子，游動(dòng)孢子的產(chǎn)量隨著孢子囊培養(yǎng)日齡的增加均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為9 d時(shí)，游動(dòng)孢子產(chǎn)量最高且不同制備方法得到的游動(dòng)孢子產(chǎn)量差異不顯著；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間大于9 d時(shí)，不同制備方法得到的游動(dòng)孢子產(chǎn)量均迅速下降。該研究結(jié)果表明，孢子囊產(chǎn)量與游動(dòng)孢子產(chǎn)量并不完全呈正相關(guān)，這與張榮等[16]、王曉敏等[24]關(guān)于辣椒疫霉游動(dòng)孢子誘導(dǎo)條件的研究結(jié)論一致。推測(cè)當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間大于9 d時(shí)游動(dòng)孢子產(chǎn)量下降的原因可能是由于后期孢子囊隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸成熟并衰老，從而影響到游動(dòng)孢子的釋放。該研究結(jié)果為大量制備致病疫霉游動(dòng)孢子提供了參考，為后續(xù)馬鈴薯抗晚疫病研究及致病疫霉的致病機(jī)制等相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。