植物乳桿菌LR-39對(duì)犬的促生長(zhǎng)及腸道菌群調(diào)節(jié)作用

陳則東，朱建平，郭書玉，盧 煒，劉 蕾

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 寵物科技學(xué)院，江蘇 泰州 225300； 2.西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039)

近幾年，食品行業(yè)已步入功能性食品時(shí)代。其中，益生菌的開發(fā)和應(yīng)用占據(jù)了重要位置。聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)將益生菌定義為活的微生物，當(dāng)給予宿主補(bǔ)充足夠數(shù)量時(shí)可對(duì)健康產(chǎn)生積極作用[1]。2013年，益生菌被重新定義，包括益生菌的3個(gè)主要方面：微生物、生物活性、有益健康[2]。益生菌在維持腸道菌群平衡、改善腸道功能、提高免疫力、增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)、降低血清膽固醇等方面有著舉足輕重的地位[3-6]。全球益生菌市場(chǎng)主要集中在亞洲、北美和歐洲三大區(qū)域。預(yù)計(jì)到2021年亞太地區(qū)益生菌市場(chǎng)銷售額將達(dá)到314億美元。預(yù)計(jì)到2024年，全球市場(chǎng)上益生菌的價(jià)值將超過(guò)730億美元[7]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)益生菌產(chǎn)業(yè)也迎來(lái)了井噴式發(fā)展。然而，與益生菌的龐大市場(chǎng)相比，對(duì)于益生菌的功能評(píng)價(jià)仍然不足。

目前，大多數(shù)益生菌的功能評(píng)價(jià)仍然采用小鼠、大鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。但是，這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類的飲食習(xí)慣、生活習(xí)慣等有很大的差異[8]。因此，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物評(píng)價(jià)結(jié)果僅具有有限的指導(dǎo)意義。犬常與人類共享生活環(huán)境，甚至具有相似的飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣[9]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，犬消化、代謝、神經(jīng)和腫瘤相關(guān)的基因與人類具有共同的進(jìn)化趨勢(shì)[10-12]。與小鼠、豬等腸道菌群常用動(dòng)物模型相比，犬的腸道微生物結(jié)構(gòu)和功能更為接近[13]。鑒于此，犬是研究人類腸道微生物菌群更為可靠的動(dòng)物模型。近年來(lái)，在伴侶動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)方面的研究成為熱點(diǎn)[14]。與人類益生菌市場(chǎng)類似，寵物犬的益生菌市場(chǎng)同樣具有巨大的潛力。然而，在犬中進(jìn)行益生菌功能評(píng)價(jià)的相關(guān)研究還十分匱乏。鑒于此，以犬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，評(píng)價(jià)益生菌的促生長(zhǎng)作用及腸道調(diào)節(jié)作用，不僅為人類益生菌的研究和開發(fā)提供重要參考價(jià)值，也對(duì)寵物益生菌資源的開發(fā)和評(píng)價(jià)具有重要意義。

基于上述研究背景，以比格犬為試驗(yàn)對(duì)象，飼喂1株從發(fā)酵泡菜中分離得到的植物乳桿菌LR-39，通過(guò)測(cè)定試驗(yàn)犬平均日增質(zhì)量、料重比及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率，評(píng)價(jià)該株乳酸菌對(duì)宿主的促生長(zhǎng)作用；通過(guò)高通量測(cè)序分析犬腸道菌群變化，并進(jìn)一步采用PICRUSt解析腸道中微生物差異功能基因的表達(dá)情況，評(píng)價(jià)該菌株對(duì)宿主的腸道調(diào)節(jié)作用，并進(jìn)一步對(duì)該菌株的全基因組序列進(jìn)行測(cè)序，明確該菌株的基本遺傳背景，為今后益生菌的開發(fā)和評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) LR-39保存在中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，保藏編號(hào)為CICC No.24811。全基因組序列已提交至GenBank，登錄號(hào)為VRKS00000000。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS(DeMan-Rogosa-Sharpe)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，檸檬酸二銨2 g/L，葡萄糖20 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，牛肉浸膏10 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，乙酸鈉5 g/L，吐溫80 1 mL/L，硫酸錳0.25 g/L。

1.1.3 供試動(dòng)物 3.5月齡比格犬(Beagle)10只，由揚(yáng)州四方實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，飼養(yǎng)于江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，自由飲水，早晚各采食指定品牌犬糧1次，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(蘇)2012—0029。

1.1.4 基礎(chǔ)犬糧 比瑞吉品牌全價(jià)小型犬幼年期犬糧，符合美國(guó)飼料管理協(xié)會(huì)(AAFCO)營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，購(gòu)自上海比瑞吉公司。犬糧成分分析保證值(以干物質(zhì)計(jì))：粗蛋白≥30.0%、粗脂肪≥16.0%、粗纖維≤5.0%、粗灰分≤10.0%、賴氨酸≥1.0%、鈣≥1.2%、總碳≥1.0%、水分≤10.0%、水溶性氯化物(以CI計(jì))≥0.45%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)與凍干 將活化的LR-39按1∶100比例接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃、 200 r/min培養(yǎng)36 h，5 000 r/min離心10 min收集菌體，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，凍干保護(hù)劑重懸菌體至終濃度1×109cfu/mL，分裝至西林瓶。-80 ℃冰箱內(nèi)預(yù)凍10 h后，置于真空冷凍干燥機(jī)中，-40 ℃、40 MPa冷凍干燥24 h，制備得凍干菌粉。

1.2.2 動(dòng)物分組與處理 比格犬10只，隨機(jī)分為試驗(yàn)組與對(duì)照組，每組各5只，犬只之間體質(zhì)量接近，每只犬單籠飼養(yǎng)。試驗(yàn)組依次編號(hào)為A1—A5，灌飼LR-39菌液(1×109cfu/mL)1 mL；對(duì)照組依次編號(hào)為B1—B5，灌飼等體積PBS。于犬每日早上采食犬糧后灌飼，連續(xù)灌飼28 d。

1.2.3 體質(zhì)量測(cè)定及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率測(cè)定 在28 d的試驗(yàn)期內(nèi)，每周按時(shí)測(cè)量犬體質(zhì)量。計(jì)算料重比，即飼料消耗/體質(zhì)量增加。同時(shí)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)采集犬的新鮮糞便50 g，保存于-80 ℃條件下，送往青島科創(chuàng)質(zhì)量檢測(cè)有限公司檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量，包括水、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、鈣、總磷、灰分，計(jì)算消化率。消化率=(飼料中的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量-糞便中的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量)/飼料中的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量×100%。

1.2.4 基因組提取及測(cè)序 收集灌飼第28天犬新鮮糞便樣本送往華大基因(深圳)有限公司，利用Illumina測(cè)序平臺(tái)分析16S rRNA V4 區(qū)。所有序列按操作分類單元(OTU)進(jìn)行分類，相似度為97%。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 使用Cutadapt軟件(V1.9.1)過(guò)濾原始讀數(shù)，利用短讀數(shù)的快速長(zhǎng)度調(diào)整軟件V1.2.11(FLASH)調(diào)整干凈數(shù)據(jù)。應(yīng)用USEARCH(V7.0.1090)軟件將所有干凈的讀數(shù)聚集到具有代表性的OTU中，并使用RDP分類器(V2.2)進(jìn)行注釋。利用gplots of R(V3.1.1)將微生物群的豐度聚類到熱圖中。采用效應(yīng)大小線性判別分析(LEfSe)評(píng)估結(jié)腸微生物群落的物種組成(https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)，用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，用Spearman分析物種間的相關(guān)性。通過(guò)PICRUSt(基于16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)果預(yù)測(cè)微生物群落功能)對(duì)菌群功能基因進(jìn)行預(yù)測(cè)(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)。用Wilcox試驗(yàn)分析差異功能基因圖譜。

1.2.6 全基因組測(cè)序 將提取的LR-39基因組DNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建、簇生成，于Illumina Hiseq 2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序深度為311×。所有 DNA 讀取短片段經(jīng)SOAPdenovo進(jìn)行收集，以GenBank中LactobacillusplantarumWCFS1全基因組序列為參考基因組，經(jīng)SOAPGapCloser進(jìn)行g(shù)ap彌合，獲得大片段(無(wú)gap)拼接的全基因組草圖。進(jìn)一步對(duì)全基因組序列進(jìn)行COG及CAZy注釋分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。平均日增質(zhì)量、料重比、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率等組間比較運(yùn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)程序分析，腸道菌群比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 LR-39菌株對(duì)犬生長(zhǎng)性能的影響

由表1可知，在試驗(yàn)開始時(shí)，試驗(yàn)組與對(duì)照組初始體質(zhì)量無(wú)顯著(P>0.05)差異；在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與對(duì)照組相比試驗(yàn)組平均體質(zhì)量提高0.54 kg，差異顯著(P<0.05)；在試驗(yàn)周期內(nèi)，試驗(yàn)組較對(duì)照組平均日增質(zhì)量極顯著(P<0.01)提高12.15 g，料重比顯著(P<0.05)降低3.17。以上結(jié)果表明，LR-39菌株對(duì)犬具有顯著的促生長(zhǎng)作用。

2.2 LR-39菌株對(duì)犬消化率的影響

本研究就植物乳桿菌LR-39調(diào)整犬對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率進(jìn)行了比較，包括粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、鈣、總磷、灰分。由表2可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組粗蛋白、粗脂肪、鈣的消化率顯著(P<0.05)提升；粗纖維、磷、灰分的消化率有所提升，但不存在顯著(P>0.05)差異。結(jié)果表明，飼喂植物乳桿菌LR-39能促進(jìn)犬對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化。

表2 LR-39菌株對(duì)犬營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響Tab.2 Effect of LR-39 strain on nutrient digestibility of dogs %

2.3 LR-39菌株對(duì)犬腸道菌群的影響

采用高通量測(cè)序?qū)υ囼?yàn)組和對(duì)照組犬腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。由圖1可知，試驗(yàn)組、對(duì)照組犬的共有OTU數(shù)目為236個(gè)，試驗(yàn)組特有OTU 20個(gè)，對(duì)照組特有OTU 13個(gè)(圖1A)。PLSDA分析結(jié)果表明，試驗(yàn)組與對(duì)照組可以被明顯區(qū)分(圖1B)，飼喂植物乳桿菌LR-39對(duì)犬腸道菌群產(chǎn)生明顯的影響。

圖1 犬腸道微生物OTU數(shù)量的Venn圖(A)和偏最小二乘法判別分析(B)Fig.1 Venn map of OTU number in dog intestine(A)and partial least squares discrimination analysis(B)

由表3可知，門水平上主要檢測(cè)到梭桿菌門(Fusobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)5個(gè)門。試驗(yàn)組梭桿菌門和擬桿菌門相對(duì)豐度顯著(P<0.05)提高，放線菌門相對(duì)豐度顯著(P<0.05)降低；變形菌門相對(duì)豐度上調(diào)(P>0.05)，厚壁菌門相對(duì)豐度下調(diào)(P>0.05)。上述結(jié)果說(shuō)明，飼喂植物乳桿菌LR-39可以在門水平改變?nèi)c道菌群的組成。

表3 LR-39菌株對(duì)犬腸道主要菌群門水平相對(duì)豐度的影響Tab.3 Effect of LR-39 strain on relative abundance of intestinal flora in dog at phylum level %

為了進(jìn)一步明確試驗(yàn)組與對(duì)照組腸道菌群的特征微生物，開展LEfSe分析。從圖2A可以看出，在科水平，LEfSe共鑒定出4個(gè)科存在顯著差異，分別是紅蝽?xiàng)U菌科(Coriobacteriaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、梭桿菌科(Fusobacteriaceae)。其中，對(duì)照組中的特征微生物科是紅蝽?xiàng)U菌科(Coriobacteriaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)，而飼喂LR-39后，特征微生物為梭桿菌科(Fusobacteriaceae)。從圖2B可以看出，對(duì)照組特征微生物菌屬分別是丹毒絲菌屬(Bulleidia)、鏈型桿菌屬(Catenibacterium)、真桿菌屬(Eubacterium)、布勞特氏菌屬(Blautia)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)，而試驗(yàn)組特征微生物菌屬是梭桿菌屬(Fusobacterium)。以上結(jié)果說(shuō)明，飼喂LR-39會(huì)顯著改變宿主的腸道菌群結(jié)構(gòu)，并改變特征微生物科屬。

C：紅蝽?xiàng)U菌科；D：紅蝽?xiàng)U菌目；E：紅蝽菌綱；F：毛螺菌科；G：瘤胃球菌科；H：梭菌目；I：梭菌綱；J：梭桿菌科；K：梭桿菌目；L：梭桿菌綱；M：α-變形菌綱C:Coriobacteriaceae;D:Coriobacteriales;E:Coriobacteriia;F:Lachnospiraceae;G:Ruminococcaceae;H:Clostridiales;I:Clostridia;J:Fusobacteriaceae;K:Fusobacteriales;L:Fusobacteriia;M:Alpha-proteobacteria圖2 組間差異犬腸道菌群的LEfSe進(jìn)化分支圖(A)和LDA值分布柱狀圖(B)Fig.2 Evolutionary branch diagram of LEfSe(A)and histogram of LDA value distribution in dog intestinal flora between different groups

為比較LR-39在種水平上對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)腸道相對(duì)豐度較高的前10位的菌種進(jìn)行比較，結(jié)果如圖3所示。在種水平上，試驗(yàn)組瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)相對(duì)豐度極顯著(P<0.01)升高；其他菌種相對(duì)豐度降低，其中柯林斯菌(Collinsellastercoris)、黏液真桿菌(Blautiaproducta)相對(duì)豐度顯著(P<0.05)降低。上述結(jié)果表明，在種水平，整體上植物乳桿菌LR-39對(duì)腸道菌群具有正向調(diào)節(jié)作用，可以顯著促進(jìn)有益菌種相對(duì)豐度升高，降低有害菌種的相對(duì)豐度。植物乳桿菌LR-39可以降低動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimals)的相對(duì)豐度，其原因有待進(jìn)一步研究。

2.4 犬腸道菌群相關(guān)性分析

為了分析宿主腸道菌群之間的關(guān)聯(lián)，對(duì)菌群在種水平的相關(guān)性進(jìn)行了進(jìn)一步分析，結(jié)果如圖4所示。其中，瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticu)與柯林斯菌(Collinsellastercoris)、黏液真桿菌(Blautiaproducta)、瘤胃球菌(Ruminococcustorques)、白痢丁酸桿菌(Butyricicoccuspullicaecorucorum)呈負(fù)相關(guān)。大腸桿菌(Escherichiacoli)與梭形鯨蠟桿菌(Cetobacteriumsomerae)、白痢丁酸桿菌(Butyricicoccuspullicaecorucorum)呈正相關(guān)。非解乳糖鏈球菌(Streptococcusalactolyticus)與黃斑葡萄球菌(Prevotellacopri)呈顯著正相關(guān)，與動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimal)和瘤胃球菌(Ruminococcustorques)呈負(fù)相關(guān)。

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)* represents significant difference(P<0.05),** represents extremely significant difference(P<0.01)圖3 犬腸道種水平相對(duì)豐度前10位的菌種差異分析Fig.3 Analysis on the top 10 species in relative abundance in dog intestine

A:白痢丁酸桿菌；B:非解乳糖鏈球菌；C：瑞士乳桿菌；D：瘤胃球菌；E：Clostridium.hiranonis； F：動(dòng)物雙歧桿菌；G：大腸桿菌；H：黏液真桿菌；I：梭形鯨蠟桿菌；J：普氏糞桿菌；K：科林斯菌；L：黃斑葡萄球菌；M：其他A:Butyricicoccus pullicaecorum；B:Streptococcus alactolyticus；C：Lactobacillus helveticus；D：Ruminococcus torques；E：Clostridium hiranonis；F：Bifidobacterium animals；G：Escherichia coli；H：Blautia producta；I：Cetobacterium somerae；J：Faecalibacterium prausnitzii；K：Collinsella stercoris；L：Prevotella copri；M：Others圖4 犬腸道菌群種水平相關(guān)性分析Fig.4 Correlation thermogram of intestinal flora at species level in dog

2.5 犬腸道菌群功能差異基因分析

為了明確植物乳桿菌LR-39對(duì)犬腸道菌群功能基因及代謝途徑的影響，采用PICRUSt和Wilcox對(duì)兩者進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖5所示。預(yù)測(cè)的功能基因涉及20條代謝途徑，主要包括復(fù)制、重組和修復(fù)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、碳水化合物運(yùn)輸和代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、轉(zhuǎn)錄、碳水化合物運(yùn)輸和代謝、次級(jí)代謝物合成的基因相對(duì)豐度發(fā)生下調(diào)，其余基因發(fā)生上調(diào)；其中差異最為明顯的是細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)以及次級(jí)代謝物3條途徑的基因相對(duì)豐度，前兩者發(fā)生上調(diào)，后者發(fā)生下調(diào)。

2.6 基于全基因組序列分析LR-39菌株

通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)對(duì)植物乳桿菌LR-39進(jìn)行全基因組草圖測(cè)序，結(jié)果如圖6所示。LR-39菌株全長(zhǎng)247 554 bp，無(wú)質(zhì)粒，GC含量為44.26%，與已經(jīng)公布序列的植物乳桿菌類似。進(jìn)一步對(duì)LR-39菌株的序列進(jìn)行COG及CAZy注釋分析，結(jié)果如圖7所示。從圖7A可以看出，LR-39菌株的基因主要分布于22個(gè)大類。LR-39菌株碳水化合物代謝相關(guān)基因豐度最高，氨基酸代謝基因其次，而脂代謝相關(guān)基因的豐度較低。此外，LR-39菌株與拮抗機(jī)制相關(guān)的基因占有一定比例，提示LR-39菌株在胃腸道環(huán)境及產(chǎn)品研發(fā)的不良環(huán)境中具有拮抗?jié)摿?。LR-39菌株的五大酶系主要分布在糖苷水解酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、碳水化合物酯酶、碳水化合物結(jié)合分子、輔助性酶類(圖7B)。

圖5 犬腸道菌群的功能差異基因分析Fig.5 Functional differential gene analysis of dog intestinal flora

圖6 植物乳桿菌LR-39全基因組草圖Fig.6 Draft genome of L.plantarum LR-39

C：復(fù)制、重組和修復(fù)；D：氨基酸的運(yùn)輸和代謝；E：細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂、染色體分裂；F：RNA加工與修飾；G：能量代謝與轉(zhuǎn)換；H：信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制；I：核苷酸運(yùn)輸和代謝；J：脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝；K：轉(zhuǎn)錄；L：輔酶的運(yùn)輸與代謝；M：翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成；N：細(xì)胞壁/膜生物合成；O：翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換與伴侶；P：無(wú)機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；Q：一般功能預(yù)測(cè)；R：碳水化合物的運(yùn)輸和代謝；S：染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)；T：細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌和囊泡運(yùn)輸；U：細(xì)胞外結(jié)構(gòu)；V：次級(jí)代謝物的生物合成，運(yùn)輸和分解代謝;W：細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；X：未知功能；Y：防御機(jī)制；Z：可移動(dòng)基因組、前噬菌體、轉(zhuǎn)座子；AA:輔助性酶類；CBM：碳水化合物結(jié)合分子；CE：碳水化合物脂酶；GH：糖苷水解酶；GT：糖基轉(zhuǎn)移酶

3 結(jié)論與討論

目前，已有越來(lái)越多的證據(jù)表明,益生菌對(duì)于宿主的健康具有諸多不同的益生功效，其中調(diào)節(jié)腸道菌群是較為明確的功效之一[15-16]。腸道菌群紊亂與很多疾病相關(guān)，目前的主要療法仍是抗生素或其他化學(xué)物質(zhì)的使用，但是這可能會(huì)加重宿主的腸道失調(diào)[17]。同時(shí)，抗生素耐藥性是更為嚴(yán)重的問(wèn)題。因此，開發(fā)益生菌制劑具有廣闊的市場(chǎng)前景[18]。雖然已有研究充分表明益生菌對(duì)宿主腸道有積極作用[19]，益生菌制劑也廣泛地應(yīng)用于經(jīng)濟(jì)動(dòng)物及伴侶動(dòng)物中，但是關(guān)于其在犬中的科學(xué)研究還較為匱乏。

本研究首先評(píng)價(jià)了植物乳桿菌LR-39對(duì)犬體質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，益生菌能夠促進(jìn)多種動(dòng)物的體質(zhì)量增長(zhǎng)，例如火雞、雞、羊、豬等[20-23]，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。益生乳桿菌LR-39能夠極顯著提高犬的平均日增質(zhì)量、顯著降低料重比。本研究對(duì)腸道菌群進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，主要微生物門有厚壁菌門、梭桿菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門。與人類和其他動(dòng)物相比，犬的梭桿菌門相對(duì)豐度更高。在門水平上，試驗(yàn)組梭桿菌門相對(duì)豐度顯著上調(diào)，放線菌門相對(duì)豐度顯著下調(diào)。LEfSe分析結(jié)果顯示，對(duì)照組特征微生物菌屬分別是丹毒絲菌屬(Bulleidia)、鏈型桿菌屬(Catenibacterium)、真桿菌屬(Eubacterium)、布勞特氏菌屬(Blautia)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)，而試驗(yàn)組特征微生物菌屬是梭桿菌屬(Fusobacterium)。梭桿菌屬(Fusobacterium)成為試驗(yàn)組的特征菌屬與試驗(yàn)預(yù)期不符，具體原因還有待進(jìn)一步研究。在種水平上，試驗(yàn)組瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)相對(duì)豐度極顯著提高，腸道有害菌群相對(duì)豐度降低，表明植物乳桿菌LR-39對(duì)犬的腸道健康具有正向調(diào)節(jié)作用。然而補(bǔ)飼植物乳桿菌LR-39后，具有益生作用的動(dòng)物雙歧桿菌相對(duì)豐度發(fā)生降低，這可能與腸道pH值較大幅度降低有關(guān)。PICRUSt是一種基于16S RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行功能基因和代謝通路預(yù)測(cè)的新方法[24]。目前，采用該方法對(duì)犬腸道菌群功能基因及代謝途徑進(jìn)行預(yù)測(cè)的研究還非常少見(jiàn)。最近研究發(fā)現(xiàn)，益生菌的飼喂會(huì)使得腸道中涉及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、轉(zhuǎn)錄等功能基因的相對(duì)豐度發(fā)生顯著變化[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂益生菌后，犬腸道中復(fù)制、重組和修復(fù)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、碳水化合物運(yùn)輸和代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等基因發(fā)生變化。本研究有助于進(jìn)一步拓展對(duì)益生菌調(diào)節(jié)犬腸道菌群的作用及機(jī)制的理解，為今后的相關(guān)研究提供參考。

綜上所述，飼喂植物乳桿菌LR-39能提高犬營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率，促進(jìn)犬生長(zhǎng)，正向調(diào)節(jié)犬腸道菌群結(jié)構(gòu)；補(bǔ)飼LR-39還能夠影響腸道菌群功能基因及代謝途徑，使參與細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)的基因相對(duì)豐度顯著升高。此外，本研究進(jìn)一步對(duì)該菌株的全基因組序列進(jìn)行了測(cè)序，明確了該菌株的基本遺傳背景，為今后益生菌的開發(fā)和評(píng)價(jià)奠定了理論基礎(chǔ)。