基于葉片結(jié)構(gòu)分析的不同品種核桃抗旱性評(píng)價(jià)

云琳穎，劉 凱，李林晴，趙書崗，王紅霞

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,河北 保定 071001；3.河北省山區(qū)研究所/國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071001)

核桃是世界著名的“四大干果”之一，栽培歷史悠久，也是我國的重要經(jīng)濟(jì)樹種[1]。近幾年來，核桃種植面積逐年擴(kuò)大，品種化發(fā)展迅猛，一些良種得到迅速推廣，但品種適應(yīng)性存在差異，造成部分良種出現(xiàn)問題，抗逆性差是部分品種極為突出的問題。干旱是我國常見的自然災(zāi)害，北方山區(qū)是核桃主產(chǎn)區(qū)，近些年干旱頻發(fā)[2-3]，其影響區(qū)域廣、延續(xù)時(shí)間長，危害嚴(yán)重。干旱不僅是水分的缺少，還往往伴隨著高溫干燥等現(xiàn)象[4]，也可造成植株的灼燒現(xiàn)象。水是構(gòu)成植物體的重要因子，葉片通過蒸騰作用為植株供水，但在干旱條件下，水分運(yùn)輸緩慢甚至停止，妨礙光合作用，影響植物生存、成長、繁殖等[5]。植物受環(huán)境中的脅迫主要體現(xiàn)在葉片結(jié)構(gòu)的變化[6]，特別是植物應(yīng)對(duì)干旱時(shí)，產(chǎn)生的生理反應(yīng)使其葉片中各組織形態(tài)發(fā)生變化，因此研究葉片結(jié)構(gòu)對(duì)于評(píng)價(jià)植物抗旱性具有十分重要的意義[7-8]。干旱條件下，植物葉片結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，如表皮細(xì)胞細(xì)胞壁和角質(zhì)層顯著增厚[9]，柵欄組織高度發(fā)達(dá)[10]，海綿組織相對(duì)減少[11]，柵欄組織與海綿組織比值升高等[12]。朱廣龍等[13]研究發(fā)現(xiàn)，酸棗在干旱加劇條件下，葉片厚度增厚，角質(zhì)層加厚。葉脈中維管束及薄壁細(xì)胞的分布與植物體內(nèi)運(yùn)輸效率直接相關(guān)[14]，長柄扁桃中抗性最強(qiáng)的品種其維管組織發(fā)達(dá)，貯水細(xì)胞豐富[8]，酸棗在梯度干旱條件下葉脈導(dǎo)管管徑增大，薄壁細(xì)胞相對(duì)厚度逐漸減小[13]。氣孔的分布能夠反映植物對(duì)CO2的吸收效率，有研究發(fā)現(xiàn)，干旱條件下，氣孔密度越大，越有利于短時(shí)間充分利用有效水分進(jìn)行光合作用，并利用散熱減少植株損傷[15]。但也有學(xué)者認(rèn)為，氣孔密度小，則抗旱力增強(qiáng)[16]。此外，氣孔的長度也可體現(xiàn)抗性的強(qiáng)弱，裸子植物中下表皮氣孔越小，抗旱性越強(qiáng)。因此，抗旱性強(qiáng)的植株具有葉片厚度大、柵欄組織厚度大、海綿組織厚度小、氣孔密度高、表皮致密等特點(diǎn)[17]。

核桃是北方山區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)林樹種，北方山區(qū)旱情頻發(fā)嚴(yán)重影響了核桃生產(chǎn)，因此對(duì)抗旱品種及砧木的選育及推廣提出迫切需求。此前，白重炎等[18]對(duì)核桃(J.regia)種內(nèi)部分品種開展過抗旱性評(píng)價(jià)，然而前人很少關(guān)注核桃屬內(nèi)不同品種的抗旱性差異，鑒于此，通過對(duì)葉片組織結(jié)構(gòu)、葉脈及氣孔特征分析，結(jié)合主成分分析法篩選合適的抗旱指標(biāo)，對(duì)核桃不同品種進(jìn)行抗旱性評(píng)價(jià)，旨在為抗旱品種及砧木選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)地位于河北省保定市河北農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)標(biāo)本園，地處冀中平原西部，北緯38°10′～40°00′，東經(jīng)113°40′～116°20′，年平均氣溫12 ℃，年降水量550 mm，屬于溫帶季風(fēng)性氣候。

1.2 供試材料

選取樹齡及生長勢一致的不同品種的核桃：黑核桃(Juglansnigra)、雜交黑核桃(J.major×J.regia),普通核桃品種遼寧1號(hào)(J.regia‘Liaoning1’)、晚實(shí)品種清香(J.regia‘Qingxiang’)、實(shí)生優(yōu)株2(J.regia)，分別用代號(hào)JN、MR、JL1、QX、YZ2表示。于2018年5月下旬選擇各類型東南方向中部無病蟲害核桃葉片，選取復(fù)葉的第3枚小葉(自上而下、從左至右的順序)備用。

1.3 試驗(yàn)方法

在葉片近基部1/3處，以主葉脈為中心切取0.5 cm2樣品，F(xiàn)AA固定后，經(jīng)脫水，二甲苯過渡，石蠟包埋，YD-3旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片(厚度6 μm)，番紅-固綠染色，制成永久切片。BH-2顯微鏡(Olympus)觀察，每品種選取10個(gè)葉片，每葉片選取15個(gè)視野，利用軟件Motic images plus 2.0測量葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)。選取同一葉片中部區(qū)域，在葉背涂膠水，利用印跡法統(tǒng)計(jì)氣孔相關(guān)指標(biāo)[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用模糊隸屬函數(shù)法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)不同類型核桃抗旱性進(jìn)行評(píng)價(jià)[20]。采用Excel 2017和SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃葉片的橫切結(jié)構(gòu)

2.1.1 葉片組織結(jié)構(gòu)特征 由表1和圖1可知，各品種核桃葉片厚度存在顯著差異，普通核桃類型(JL1、QX、YZ2)葉片較厚，其中，遼寧1號(hào)葉片厚度為186.0 μm，而黑核桃和雜交黑核桃葉片厚度分別為122.6 μm和119.1 μm，均顯著小于3種普通核桃；各品種上表皮厚度為12.1～13.7 μm，差異不顯著，下表皮厚度介于12.1～16.2 μm，其中黑核桃下表皮厚度為16.2 μm，顯著大于其他各品種；黑核桃上下表皮細(xì)胞在葉片橫切中相對(duì)體積較大(圖1A)，雜交黑核桃與其類似(圖1C)。柵欄組織多層普遍被認(rèn)為是植物抗旱的表現(xiàn)之一，各品種核桃葉片柵欄組織均呈現(xiàn)多層，普通核桃類型(JL1、QX、YZ2)葉片柵欄組織多為2層，局部為3層，并且其柵欄組織排列較黑核桃和雜交黑核桃更緊密。各品種核桃的葉片柵欄組織厚度在49.8～83.0 μm，其中，遼寧1號(hào)柵欄組織厚度達(dá)83.0 μm，而黑核桃僅為49.8 μm；上層?xùn)艡诮M織較下層?xùn)艡诮M織厚，其中，遼寧1號(hào)上層?xùn)艡诮M織厚度為49.9 μm，顯著高于其他核桃。與柵欄組織類似，黑核桃和雜交黑核桃的海綿組織厚度均小于普通核桃類型(JL1、QX、YZ2)，其中，雜交黑核桃海綿組織厚度為40.2 μm，而3種普通核桃類型海綿組織厚度均大于65 μm，并且3種之間差異不顯著。5個(gè)類型核桃柵欄組織與海綿組織厚度比值均大于1。

表1 不同品種核桃葉片結(jié)構(gòu)差異Tab.1 Analysis of leaves structures in different walnut varieties

A—E分別為JN、JL1、MR、QX和YZ2;Sp:上表皮，Xp：下表皮，Zl：柵欄組織，Hm：海綿組織。標(biāo)尺=50 μmA—E: JN,JL1,MR,QX and YZ2; Sp: Upper epidermis,Xp: Lower epidermis,Zl: Palisade tissue,Hm: Spongy tissue.Bar is 50 μm圖1 不同品種核桃葉片橫切結(jié)構(gòu)Fig.1 Leaves structure of different walnut varieties

2.1.2 主葉脈及氣孔特征 葉脈和維管束是水分運(yùn)輸?shù)闹饕ǖ?，發(fā)達(dá)的主葉脈和維管束是植物對(duì)干旱環(huán)境的適應(yīng)[13]，二者是評(píng)價(jià)植物抗旱性的重要指標(biāo)。由表2可知，各品種核桃的主葉脈厚度差異較大，其中3種普通核桃主葉脈厚度顯著大于2種黑核桃類型，其中清香為1 478.0 μm，雜交黑核桃僅為834.0 μm；維管束厚度與主葉脈厚度表現(xiàn)一致，雜交黑核桃僅為441.3 μm，清香為957.7 μm；各品種維管束與葉脈厚度比均大于0.50，說明維管束占據(jù)整個(gè)主葉脈的1/2以上，其中清香顯著大于其他核桃；各品種核桃葉片主葉脈維管束均由上、下兩部分組成(圖2)，清香的主葉脈維管束木質(zhì)部和韌皮部均較大，而黑核桃和雜交黑核桃較小；主葉脈中上、下薄壁組織也存在較大差異，3種普通核桃上薄壁組織較厚，其中實(shí)生優(yōu)株2為327.3 μm，顯著大于其他核桃，而黑核桃和雜交黑核桃上、下薄壁組織均較薄，特別是向光層即上薄壁組織，雜交黑核桃僅為194.0 μm，顯著小于其他類型。

表2 不同品種核桃主葉脈及氣孔特征 Tab.2 Analysis of vein structures and otomatal feature in different walnut varieties

A—E分別為JN、JL1、MR、QX和YZ2;M：木質(zhì)部；Sr:上韌皮部；Xr:下韌皮部；Sb:上薄壁組織；Xb:下薄壁組織；標(biāo)尺=200 μmA—E: JN,JL1,MR,QX and YZ2;M:Xylem;Sr:Upper phloem;Xr:Lower phloem;Sb:Upper parenchyma;Xb:Lower parenchyma;Bar is 200 μm圖2 不同品種核桃葉脈橫切結(jié)構(gòu)Fig.2 Vein structure of different walnut varieties

氣孔是植物進(jìn)行蒸騰作用，與外界氣體交換和吸收水分的重要通道。各品種中清香氣孔密度顯著大于其他類型，為428.1個(gè)/mm2，實(shí)生優(yōu)株2氣孔密度顯著小于其他類型，為262.6個(gè)/mm2，黑核桃、遼寧1號(hào)和清香核桃的氣孔較長，而雜交黑核桃氣孔長度和寬度最小，僅為12.0 μm和5.2 μm(表2)。

2.2 不同品種核桃抗旱指標(biāo)的主成分分析

由表1和表2可知，各品種核桃在葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、柵欄組織與海綿組織厚度比、下表皮厚度、上層?xùn)艡诮M織厚度、下層?xùn)艡诮M織厚度、主葉脈厚度、維管束厚度、木質(zhì)部厚度、維管束與主葉脈厚度比、上韌皮部厚度、下韌皮部厚度、上薄壁組織厚度、下薄壁組織厚度、氣孔長度、氣孔寬度以及氣孔密度等18項(xiàng)指標(biāo)均存在顯著差異，變異系數(shù)在9.07%～48.10%，具有一定的代表性和較高靈敏度，作為評(píng)價(jià)指標(biāo)均具有顯著意義[21]。因過多相關(guān)指標(biāo)不利于揭示類型特征，易產(chǎn)生認(rèn)識(shí)偏差，故選取變異系數(shù)大于20%的指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行主成分分析，根據(jù)累積貢獻(xiàn)率≥85%的原則抽取主成分，根據(jù)各主成分中每個(gè)指標(biāo)載荷量及變異系數(shù)大小選取代表性指標(biāo)。

經(jīng)主成分提取后前4個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率已達(dá)88.60%(表3)，很好地保留了選取指標(biāo)的大部分信息。根據(jù)載荷值越大，其對(duì)主成分貢獻(xiàn)越大，典型性越強(qiáng)的原則，對(duì)4個(gè)主成分進(jìn)行分析，在第一主成分中，葉片厚度、主葉脈厚度、維管束厚度、下韌皮部厚度具有較大的載荷值，主要反映了葉片輸導(dǎo)能力。第二主成分中，氣孔長度、氣孔寬度、氣孔密度均有較大的載荷值，主要反映了氣孔特征。同樣，第三主成分中，氣孔特征出現(xiàn)較大的載荷值。第四主成分中，下薄壁組織厚度具有較大載荷值，反映了葉脈貯水能力。

表3 主成分載荷矩陣 Tab.3 Principal components matrix

根據(jù)主成分分析結(jié)果進(jìn)行指標(biāo)篩選，鑒于第一主成分貢獻(xiàn)率達(dá)到58.64%，并且葉片厚度、維管束厚度和下韌皮部厚度有較大變異系數(shù)，能夠代表植株的輸導(dǎo)能力，因此,選取為第一主成分典型指標(biāo)。第二主成分中氣孔長度和第三主成分中氣孔寬度，具有較大變異系數(shù)，選取氣孔長度和寬度為第二和第三主成分典型指標(biāo)。第四主成分中下部薄壁組織厚度載荷值遠(yuǎn)大于其他指標(biāo)，故選取其為第四主成分典型指標(biāo)。

經(jīng)方差分析和主成分分析，從原來18個(gè)指標(biāo)中選出葉片厚度、維管束厚度、下韌皮部厚度、氣孔長度、氣孔寬度和下薄壁組織厚度作為不同類型核桃抗旱性預(yù)測的主要指標(biāo)。

2.3 不同品種核桃抗旱性比較

對(duì)各品種所篩選的指標(biāo)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同類型核桃葉片維管束厚度、下韌皮部厚度、氣孔長度、葉片厚度、下薄壁組織厚度均具有較大差異，故采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法進(jìn)行比較，對(duì)5種核桃的5個(gè)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值進(jìn)行累加，取其平均值，平均值越大，則抗旱性越強(qiáng)。如表4所示，經(jīng)綜合評(píng)價(jià)后抗旱能力：黑核桃>清香>遼寧1號(hào)>雜交黑核桃>實(shí)生優(yōu)株2。

表4 不同核桃品種抗旱性比較 Tab.4 Comparison of drought resistance of different walnut varieties

3 結(jié)論與討論

葉片是植物光合作用的中心，是在環(huán)境中暴露面積最大的器官，植物體受干旱脅迫時(shí)，葉片結(jié)構(gòu)最快發(fā)生響應(yīng)，而這種響應(yīng)直接反映植物體的抗旱能力[13]。不同學(xué)者對(duì)植物葉片抗旱性指標(biāo)篩選存在差異，江川等[21]通過對(duì)5種灌木葉片抗旱性進(jìn)行研究，從10個(gè)抗旱指標(biāo)中篩選出葉片厚度、上表皮厚度和氣孔長度3項(xiàng)指標(biāo)；劉紅茹等[22]對(duì)10種闊葉園林植物進(jìn)行研究，從15個(gè)指標(biāo)中篩選出下表皮厚度、柵欄組織厚度、維管束厚度、氣孔密度4項(xiàng)指標(biāo)作為評(píng)價(jià)指標(biāo),白重炎等[18]通過對(duì)12種普通核桃品種葉片結(jié)構(gòu)分析，從7個(gè)指標(biāo)中篩選出上表皮厚度、柵欄組織與葉片厚度比值及葉脈維管束長徑為較好的抗旱指標(biāo)。本研究篩選出維管束厚度、下韌皮部厚度、氣孔長度、葉片厚度、下薄壁組織厚度共5項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)合前人研究發(fā)現(xiàn)，氣孔結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)在各個(gè)研究所篩選出的指標(biāo)中，說明氣孔特征是抗旱性研究的最重要指標(biāo)之一。此外，前人研究中所篩選出的指標(biāo)均出現(xiàn)維管組織特征或表皮細(xì)胞特征[18，21-22]，而本研究的所篩選的維管束厚度、下韌皮部厚度均反映了維管系統(tǒng)的特征，說明輸導(dǎo)能力強(qiáng)弱是植物抗旱的關(guān)鍵因素。前人研究發(fā)現(xiàn)，紫葉小檗及連翹抗旱性相對(duì)較差，其柵欄組織和海綿組織厚度均小于1，且葉脈中維管束所占比例相對(duì)較小[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，各類型核桃葉片結(jié)構(gòu)中，柵欄組織表現(xiàn)為多層，維管束與主葉脈厚度比值大于0.50，柵欄組織與海綿組織厚度比值大于1，說明核桃整體抗旱性較強(qiáng)。

選育抗旱品種及砧木是我國核桃育種的重要方向之一，目前國內(nèi)外核桃砧木多以普通核桃、奇異核桃、北加州黑核桃、黑核桃或者種間雜交種為主[23]。國外研究認(rèn)為奇異核桃和小果胡桃對(duì)干旱適應(yīng)能力較強(qiáng)，可用作普通核桃的砧木，而國內(nèi)核桃以普通核桃和核桃楸為主，也具有較強(qiáng)的抗旱性[24]。清香作為晚實(shí)核桃優(yōu)良品種，其抗旱性相對(duì)較強(qiáng)，這與其在立地條件差、土層瘠薄山區(qū)表現(xiàn)良好具有一致性[26]。一般認(rèn)為黑核桃的抗旱性優(yōu)于普通核桃[25]，本研究結(jié)果與其一致，鑒于黑核桃較普通核桃品種更具抗旱性，可作為砧木育種的良好種質(zhì)。